細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

この手順の全体的な目標は、組織から脂肪滴を分離することです。これは、最初に胎盤組織を解剖して分離することによって達成されます。次に、オレインの細胞を均質化します。

次に、細胞小器官はいくつかの遠心分離ステップによって分離されます。最後に、脂質液滴を含む浮遊層が収集され、脂質滴が特徴付けられます。最終的には、蛍光顕微鏡とウェスタン血液分析を使用して、脂肪滴画分の純度を示します。

この技術の主な利点は、ほとんどの大動脈細胞から脂肪滴を単離することが可能であることです。特定の組織では、液滴の数が浮遊G層および液滴の数を減少させるものより少なくなる可能性があることに注意してください。胎盤は、単胎妊娠の健康な女性から採取されました 選択的帝王切開分娩を受ける前に 正期産の被験者は、胎盤の収集について書面によるインフォームドコンセントを与えました。

胎盤の収集とその後の使用は、テネシー大学とノックスビルのテネシー大学医学部の承認を得て行われました。生物学的安全性フードの治験審査委員会は、胎盤を滅菌オートクレーブ可能な容器に移し、滅菌生理食塩水を使用して胎盤と膜から血液を慎重に洗浄します。1リットルのビーカーに入った血まみれの生理食塩水を液体の生物学的廃棄物として捨てます。

この滑らかな表面で臍帯が上を向いている状態で、胎盤を無菌状態に置きます。へその緒と胎児の膜を取り除きます。次に、母体の表面が上を向くように胎盤を裏

次に、表面から約3ミリメートルのところにある基底板組織を取り除きます。絨毛膜板を避けて一度に1つのCOTAリードインを解剖し、絨毛組織を生理食塩水を含む250ミリリットルのビーカーに集めます。次に、0.9%滅菌生理食塩水と鉗子を使用して、液体廃棄物用の1リットルのビーカーを使用して渦巻くことにより、別のビーカーで組織を数回すすぎます。

一度に1つのコーディリードインを150ミリメートルのペトリ皿に移します。鉗子で保持し、かみそりの刃を使用して、血管から組織をペトリ皿にこすり落とします。削り取った組織を0.9%滅菌生理食塩水を含む別のビーカーに入れます。

すべてのティッシュピースについて繰り返します。細胞解離cveで削り取った組織をすすぎた後、余分な液体と重量を排出して胎盤組織を消化します。組織消化混合物を調製した後、収集した組織全体から60グラムを500ミリリットルの滅菌ヘレンマイヤーフラスコに移して組織を分割します。

組織消化混合物を組織が入ったフラスコに加え、シェーカーで摂氏37度で45分間インキュベートします。150 RPMでインキュベーション後に解離した細胞を採取し、フラスコを傾けて組織を沈殿させます。スーパーナチンを集める。

UND解離組織を採取しないように注意してください。上清に同量のHBSSを加えてから、滅菌済みの15ミリリットル遠心チューブに移します。1000回遠心分離後の各バッチについて、UND関連組織の残りの部分との解離と上清の収集を繰り返します。

摂氏4度で15分間の重力で、ペレットを乱さずに上清を吸引します。胎盤絨毛細胞は、主に赤血球を覆うペレットの白い部分にあります。ペレットの白い部分の絨毛細胞を滅菌済みの50ミリリットルの円錐形遠心分離管に移し、氷上に保ちます。

3つの消化段階すべてから細胞を採取した後、無菌の50ミリリットルの円錐形遠心分離管の上部に挿入した100ミクロンのナイロン製セルストレーナーを使用して、懸濁液をろ過します。細胞懸濁液のろ過が遅くなる場合は、フィルター上で上向きに持ち上げて、チューブ内の真空を遠心分離機に4°C、重力1000倍で10分間吸引します。ペレットを乱さずに上清を慎重に取り除き、新たに調製した低張溶解培地または生物学的安全フード内のHLMを使用して胎盤絨毛細胞を均質化し、細胞ペレットの4倍の量の氷冷HLMを細胞に加えます。

10ミリリットルのピペットを使用して、優しく徹底的に蘇生します。細胞をピペッティングして懸濁します。細胞を氷上で10分間インキュベートした後、氷冷したダウンホモジナイザーに移し、ゆるい乳棒で20〜25回の穏やかなストロークを適用して細胞をゆっくりと均質化します。

ライセートを重力3000倍、摂氏4度で10分間回転させ、壊れていない細胞を取り除きます。次に、上澄みを新しいチューブに集めてから、重力の25,000倍、摂氏4度で20分間再び回転させます。ミトコンドリアを除去して超遠心分離によって脂肪滴を分離するには、スーパーナチンを50ミリリットルの遠心分離チューブに集めます。

20%スクロースに調整し、S SW 28ローターまたは同等のオーバーレイ用の超遠心チューブの底に、約10ミリリットルの氷冷、100ミリモル炭酸ナトリウム緩衝液、および0.5〜1ミリリットルの氷冷HLMで密度調整されたスーパーナチンを移し、130でS SW 28スイングバケットローター遠心分離機を使用してチューブを満たします。 重力の000倍、摂氏4度で45分間。次に、浮遊層を収集し、10%スクロースに調整し、SW 41 TIローターまたは同等のもの用の13.2ミリリットルの超遠心チューブの底に、密度調整された上清を約5ミリリットルの氷冷、100ミリモルの炭酸ナトリウム緩衝液、および0.5ミリリットルの氷冷HLMで274で遠心分離した後、上澄みをオーバーレイします。 重力の000倍、摂氏4度で60分間。SW 41 TIローターで、1ミリリットルのピペットを使用して、脂肪滴を含む上部の浮遊層を慎重に収集します。

容量を10%スクロースに調整し、再度13.2ミリリットルの超遠心チューブに移してから、5ミリリットルの氷冷、100ミリモルの炭酸ナトリウム緩衝液、0.5ミリリットルの氷冷HLMを重ねます。30分間遠心分離した後、曲げたPEピペットを使用して、脂肪滴を含む上部の白色浮遊層を100マイクロリットルのHLMを含む3本の1.5ミリリットルチューブに慎重に収集します。この図に見られるように、テキストプロトコルに従って脂質液滴を特徴付け、ヒト用語胎盤絨毛細胞から単離された脂質液滴の存在を、中性脂質特異的蛍光色素boda P 4 93 5 0 3で染色することにより確認し、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。

ここに示されているのは、単離された脂肪滴画分の純度を、脂肪滴のマーカータンパク質を用いてウェスタンブロッティングにより評価した。これには、エラ、goiマーカー、GM1、30CO、4、ミトコンドリアおよび原形質膜、MEK1を含む脂質飛沫のマーカータンパク質が含まれていた。老朽化後、冷たいアセトンで脂質が液滴化し、タンパク質が抽出されます。画分をウェスタンブロッティングパラリピンに供した。

2つ目は、脂質液滴タンパク質が核後上清と、脂質液滴を含む単離された白色浮遊層で検出されたことです。MK oneやGM oneなどの原形質膜に特異的なタンパク質30は、スピン4とスピン5の浮遊層下のいずれの層の脂肪滴画分でも検出されなかった。以前に報告されたように、タンパク質カルネキシンおよびミトコンドリア膜タンパク質CO X fourの弱い染色は、脂質液滴画分の他の場所で検出されている。

これらの結果は、脂肪滴が哺乳類細胞のミトコンドリアおよびERRと相互作用することを示す以前の報告と一致しています。この手順に続いて、プロテオミクス法やリピドーム法などの他の方法を実行して、液滴に結合している要因などの追加の問題を研究できます。