細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

本手順の全体的な目的は、組織から脂質滴を単離することです。まず、胎盤組織を解剖し分離します。次に、オレインの細胞をホモジナイズします。

その後、数回の遠心分離ステップによって細胞小器官を分離します。最後に、脂質滴を含む浮遊層を回収し、脂質滴の特性を解析します。最終的に、蛍光顕微鏡観察およびウェスタンブロット解析を用いて、脂質滴分画の純度を証明します。

この手法の主な利点は、ほとんどの大動脈細胞から脂質滴を単離できることです。特定の組織では、滴の数が少ないために、浮遊するG層および滴の数が減少する場合があることに注意してください。胎盤は、正期産の自然陣痛が始まる前に選択的帝王切開術を受けた、単胎妊娠の健康な女性から採取されました。被験者は、胎盤の採取について書面によるインフォームドコンセントを提供しました。

胎盤の採取およびその後の使用は、テネシー大学およびテネシー大学ノックスビル医学大学院の承認を得て実施されました。生物学的安全キャビネット内で、胎盤を滅菌済みのオートクレーブ可能容器に移し、滅菌生理食塩水を用いて胎盤および胎膜から血液を慎重に洗浄します。血液混じりの生理食塩水は、液体生物学的廃棄物として1リットルのビーカーに廃棄してください。

胎盤を滅菌フィールドに置き、臍帯がある平滑面を上に向けます。鋭利で先の細い剪刀とピンセットを用いて、臍帯と胎児膜を除去します。次に、胎盤を裏返し、母体面を上に向けます。

次に、表面から約3 mmの範囲で上層の基底板組織を除去します。絨毛膜板を避けながら、COTAリードインを1つずつ解剖し、生理食塩水を入れた250 mLビーカーに絨毛組織を回収します。その後、0.9%滅菌生理食塩水とピンセットを用い、別のビーカー内で組織を数回回転させて洗浄し、廃液には1 Lビーカーを使用します。

codi leadinを一度に1つずつ150 millimeterのペトリ皿に移します。ピンセットで固定し、カミソリ刃を用いて血管から組織を削り取り、ペトリ皿の上に回収します。削り取った組織を、0.9%滅菌生理食塩水を含む別のビーカーに入れます。

すべての組織片に対してこの操作を繰り返します。細胞分離溶液で洗浄した掻爬組織を、余分な液体がなくなるまで水切りし、胎盤組織を消化させるための重量を量ります。組織消化混合液を調製した後、回収した全組織から60 gramsを、500 milliliterの滅菌済みヘレンマイヤーフラスコに分注します。

組織を含むフラスコに組織消化混合液を加え、シェーカーを用いて37 °Cで45分間インキュベートします。150 RPMで回転させ、インキュベーション後、フラスコを傾けて組織を沈殿させた後、解離した細胞を回収します。上清を回収してください。

UND解離組織を回収しないように注意します。上清を滅菌済みの15 milliliter遠心チューブに移す前に、同量のHBSSを加えます。1000 ×gで遠心分離した後、各バッチの残りのUND結合組織を用いて、解離と上清回収を繰り返します。

4°Cで15分間遠心分離し、ペレットを乱さないように上清を吸引します。胎盤絨毛細胞は、主に赤血球の上に重なっているペレットの白い部分に存在します。ペレットの白い部分にある絨毛細胞を滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブに移し、氷上で保持します。

3段階すべての消化工程から細胞を回収した後、滅菌済みの50 mLコニカル遠心チューブの上部に挿入した100 micronナイロンセルストレーナーを用いて、懸濁液をろ過します。細胞懸濁液のろ過速度が低下した場合は、フィルターを上に持ち上げてチューブ内に真空状態を作り、4 °C、1000 ×gで10分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意して上清を除去し、バイオセーフティキャビネット内で、調製直後の低張溶血培地（HLM）を用いて胎盤絨毛細胞を均質化します。細胞ペレットの4倍量の氷冷したHLMを細胞に加えます。

10 mLピペットを使用して、緩やかに、かつ十分に再懸濁します。ピペッティングを繰り返して細胞を懸濁させてください。細胞を氷上で10分間インキュベートした後、氷冷したダウンホモジナイザーに移し、緩めに適合させたペスティルを用いて20〜25回緩やかにストロークし、ゆっくりと細胞をホモジナイズします。

未破砕細胞を除去するため、ライセートを3000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。次に、上清を新しいチューブに回収し、再度25,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。超遠心分離によってミトコンドリアを除去し脂質滴を単離するため、上清を50 mL遠心チューブに回収します。

20% sucroseに調整し、S SW 28ローターまたは同等品用の超遠心管の底部に分注します。密度調整した上清の上に、氷冷した100 millimolar炭酸ナトリウム緩衝液約10 millilitersと、氷冷したHLM 0.5から1 milliliterを加えて管を満たします。S SW 28スイングバケットローター搭載の遠心機を用い、130,000 ×g、4 °Cで45分間遠心分離します。その後、浮遊層を回収して10% sucroseに調整し、SW 41 TIローターまたは同等品用の13.2 milliliter超遠心管の底部に分注します。密度調整した上清の上に、氷冷した100 millimolar炭酸ナトリウム緩衝液約5 millilitersと、氷冷したHLM 0.5 millilitersを加えます。274,000 ×g、4 °Cで60分間遠心分離します。SW 41 TIローター内で、1 milliliterピペットを用いて、脂質滴を含む最上層の浮遊層を注意深く回収します。

液量を10% sucroseに調整し、再度13.2 milliliterの超遠心管に移します。その後、氷冷した100 millimolarの炭酸ナトリウム緩衝液5 millilitersと氷冷したHLM 0.5 millilitersを上層に加えます。30分間遠心分離した後、曲げたPEピペットを使用して、脂質滴を含む最上層の白色浮遊層を、100 microlitersのHLMが入った1.5 milliliterチューブ3本に注意深く回収します。本図に示すテキストプロトコルに従って脂質滴を特性解析します。ヒト正期胎盤絨毛細胞から単離された脂質滴の存在は、中性脂質特異的蛍光染料boda P 4 93 5 0 3による染色で確認し、蛍光顕微鏡を用いて可視化しました。

ここでは、単離した脂質滴画分の純度を、脂質滴のマーカータンパク質であるperilipin 2、小胞体（ER）のcalnexin、ゴルジ体のGM130、ミトコンドリアのCOX IV、および細胞膜のMEK1を用いたウェスタンブロッティングにより評価しています。冷アセトンを用いて脂質滴を脱脂した後、タンパク質を抽出しました。その後、各画分をperilipinでウェスタンブロッティングに供しました。

2つ目に、脂質滴タンパク質が核後上清および脂質滴を含む分離された白色浮遊層において検出されました。MK1やGM130などの細胞膜特異的なタンパク質は、スピン4およびスピン5の浮遊層以下のいずれの層の脂質滴画分においても検出されませんでした。既報の通り、タンパク質カルネキシンおよびミトコンドリア膜タンパク質CO X4の弱い染色は、他の脂質滴画分で検出されています。

これらの結果は、哺乳類細胞において脂質滴がミトコンドリアおよび小胞体（ER）と相互作用することを示した先行報告と一致しています。この手順に続き、プロテオミクスやリピドミクスなどの他の手法を用いることで、どのような因子が脂質滴に結合しているかといった追加の課題を研究することが可能です。