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この作品は、PDにし、JM低から医師の医療教育研究財団（テネシー大学）賞で持続可能なエネルギー教育研究センター賞（テネシー大）、PDに米国心臓協会賞13SDG14500046によってサポートされていました彼の揺れインキュベーター、卓上遠心、およびウエスタンブロット分析装置の使用のためにエリック·T. Boder（テネシー大学）;、著者らは、フェロプラストに分裂酵母を変換するためのプロトコルのためにキャロラインLeplante（エール大学）に感謝し、センター彼らの超遠心機を使用するための環境バイオテクノロジー（東大テネシー州）、酵母抗体についてのギュンター·ダウム（グラーツ大学技術、オーストリア）;技術支援のための産婦人科（東大テネシー州の医療センター）の職員。

1。 （分裂）酵母細胞から脂肪滴を分離酵母サッカロミセス·セレビシエ 、 出芽人気のモデル生物からの液滴の単離は、以下のプロトコル6とほぼ同じです。調剤の違いに注目している。 1。成長している酵母細胞<ol><li>メディアを準備します。ガラス瓶や培養フラスコ中のdH 2 Oリットル当たりYE5Sの粉末36グラムを兼ね備えています。メディアの約2 Lは必要とされるであろう。 20分間121℃でオートクレーブ媒体。媒体を室温まで冷却させる。 S.のためのcerevisiaeの YPDでYE5Sを交換してください。 </li><li>無菌技術を使用して、250ミリリットルの培養フラスコに冷却YE5Sメディアの10〜20ミリリットル入れます。無菌木の棒または同等を使用した寒天プレートからの酵母細胞の少量のメディアを接種する。細胞は30℃で所望の光学密度まで成長させAでの光学密度を測定する分光光度計を用いて波長595nm。 </li><li> 2.8 Lのフラスコ内に残っ​​ているメディアをセットします。振盪インキュベーター中で細胞増殖の間に適切な混合を確実にするために2.8 Lのフラスコあたり培地1 L以下で使用しない。湿った細胞の最終収率は、プロテオミクスとlipidomic分析のための十分な脂肪滴を取得することができるように約10グラムである必要があります。 </li><li>各ステップ1.1で調製した培地を1リットルた2.8 Lのフラスコにステップ1.2から細胞を紹介する。 </li><li> 30℃で所望の密度まで細胞を増殖させる</li><li>細胞は脂肪滴があることを確認してください。準備金の細胞の1ミリリットル。試料の光学密度（OD）を測定する。サンプルに細胞のODあたりのエタノールにBODIPY 503分の493の100 mMストックの0.1ミリリットルを追加します。ガラススライドとカバーガラスの間にサンプルを3μLを配置します。 GFPフィルター（ 図1A）と蛍光顕微鏡下で可視化する。 </li><li> 4＆＃でステップ1.5から細胞をペレット化176、C 10分間3800×gで。遠心管の容量に応じて、バッチで動作します。 </li><li> YE5Sメディアを捨て、ソルビトール、EMM + 600 mMの緩衝液で細胞を洗浄。ソルビトールは、浸透サポートを提供します。 </li><li>無菌の50ml遠心チューブに細胞を移し、10分間、2,000×gで4℃で細胞をペレット化。上清を取り除きます。湿潤細胞を秤量する。細胞1グラムあたり（EMM + 600mMのソルビトール）緩衝液2mlで細胞を再懸濁する。 </li></ol> 2。スフェロとその後の溶解に分裂酵母細胞への変換<ol><li> ）酵母溶解酵素を5 mgの1をそれぞれ追加し、2）酵母トリコデルマハルジアナムあたりのグラムステップ1.9で計量した湿った細胞の由来の酵素を溶解する。 S.のためのセレビシエはザイモリアーゼ同量のこれらの酵素を増強する。 </li><li> 60分間、100rpmで穏やかに振とう下、30℃で細胞をインキュベートする。 </li><li>スフェロ脂質DRを持っていることを確認してくださいoplets。ステップ1.6（ 図1B）を繰り返すことにより。 </li></ol> 3。密度勾配遠心<ol><li> 5分間、2,000×gで4℃で遠心分離することにより、スフェロプラストをペレット化。 </li><li>慎重にプラスチック製のトランスファーピペットを用いて上清を除去します。 </li><li>優しくソルビトールの氷冷10mMトリス-HCl、600 mmのペレット状のスフェロプラストを再懸濁し、200μMのEDTA。スフェロは非常に脆弱であることに留意してください。 </li><li>ステップ3.1と同じ設定を使用して、もう一度フェロプラストをペレット化。慎重に上清を除去し、2ミリリットル/ G-細胞の濃度で12％のFicoll、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA中のプラスチックトランスファーピペットを使用してスフェロ再懸濁します。 </li><li>ガラスホモジナイザーに再懸濁フェロプラストを移し、ゆっくりとガラスホモジナイザーのゆったり乳棒を用いて、氷の上で、20〜30ストロークを均質化する。 </li><li>遠心管に溶解したスフェロプラストを転送し、同じVOオーバーレイ12％フィコール、10mMトリス-HCl、および200μMEDTA緩衝液LUME。各チューブは、約3分の2杯になるように使用する遠心管の数を選択してください。 </li><li> SW28ローターまたは同等の中で1.5時間、100,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>優しくピペッターまたは曲がっパスツールピペットのいずれかを使用して、新しい遠心管（複数可）に、液滴を含む最白浮き層（ 図2A）、転送します。それは大まかに遠心管の3分の1を満たすように、試料に12％の十分な容量のFicollを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。 </li><li>新しい遠心管（S）のサンプル（S）の先頭に8％のFicoll相当ボリュームを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。この添加後、チューブをバッファフルの三分の二程度にする必要があります。 </li><li> SW28ローターまたは同等の中で1時間、100,000×gで4℃で遠心します。 R（停止するまで惰性ローターを許可するotor減速= 0）。 </li><li>優しくピペッターまたは曲がっパスツールピペットのいずれかを使用して、新しい遠心管（複数可）に、液滴を含むことになるトップ浮遊白層（ 図2B）を 、転送します。それは遠心管の約3分の1を満たすように600mMのソルビトールを追加し、8％フィコール、10mMトリス-HCl、試料200μMEDTA緩衝液。 </li><li>新しい遠心管（S）のサンプル（S）のトップにソルビトール250 mMと同等のボリュームを追加し、10 mMトリス-HCl、および200μMのEDTA緩衝液。この添加後、チューブをバッファフルの三分の二程度にする必要があります。 </li><li> SW28ローターまたは同等の中で1時間、100,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>透析管に、唯一の脂質小滴と結合したタンパク質を含有し、そしてフィコールを排除するために10mMトリス-HCl及び200μMEDTA緩衝液中にO / Nを透析する必要があり頂白色層（ 図2C）を転送する。 </li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。ヒト胎盤絨毛細胞から脂肪滴を分離胎盤は、シングルトン妊娠前任期で自然分娩の発症に選択的帝王切開の配信を受けている健康な女性から採取した。被験者は、自分の胎盤を収集するための書面によるインフォームドコンセントを与えた。胎盤の収集、およびその後の使用は、テネシー大学からの承認を得て行われ、ノックス治験審査委員会の医学のテネシー大学大学院（＃の8757Bと＃3338、それぞれ）した。 1。ヒト胎盤絨毛細胞を単離するプロトコルの第1部では、ペトロフらの以前公開されたプロトコルの変形である。26 次の解決策を準備します。 <ul><li> NaCl水溶液（1 L）：1 Lの溶液を得たのdH 2 O 9のNaCl（M 58.4グラム/モル）を溶解する。濾過滅菌（0.2;の膜）。 </li><li> 10倍ハンクス液（10×HBSS）（1 L）：4のKCl（M 74.5グラム/モル）、0.6グラムのKH 2 PO 4（M 136.086グラム/モル）、80グラムのNaCl（M 58.44グラム/モル）; 10gのD-グルコース（M 180.16グラム/モル）、2 HPO 4（M 141.96グラム/モル）のNa。 1 Lの溶液を得たのdH 2 O中の成分の各々を溶解する。濾過滅菌（0.2μmの膜）。 </li><li>酵素消化緩衝液（0.6ミリリットル）：3.3ミリリットル、7.5％のNaビスカーボネート、17.5ミリリットルの1MのHEPES、及び266.1ミリリットルのdH 2 Oで70ミリリットル10倍のHBSSを組み合わせ、濾過滅菌（0.2μm膜）。 4℃で保存する</li><li> DNアーゼ私は：使用直前に、DNA分解酵素のバイアルに5ミリリットルの無菌の0.9％NaClを追加します。 -20℃での使用·保管まで氷上に保つ</li></ul><ol><li>解剖の準備胎盤<ol><li>できるだけ配達時に近いヒト胎盤およびプロセスを取得します。このような胎盤を輸送する冷却器として密封容器を使用してください。とき手は、常に十分注意してください玲人間の生体物質。 </li><li>生物学的安全フード、滅菌オートクレーブ容器に胎盤を転送し、慎重に無菌の0.9％NaCl（生理食塩水）溶液を用いて、胎盤および膜から血を洗う。液体生物学的廃棄物として1リットルのビーカーに血まみれの生理食塩水を捨てる。 </li><li>滑らかな表面を上に向け臍帯を保有して、無菌領域に胎盤を置きます。シャープ、ファインポイントハサミとピンセットで胎児の膜および臍帯を削除します。 </li><li>母体の表面（粗面）が上を向いているように、胎盤を裏返し。上層基板組織、表面から約3ミリメートルを削除します。 </li></ol></li><li>胎盤を解剖<ol><li>絨毛膜板を避けて一度に1子葉を解剖。生理食塩水250ミリリットルビーカーに絨毛組織を収集しています。 </li><li>液体廃棄物の1リットルのビーカーを使用して、ピンセットで回転させることによって、0.9％NaClを別のビーカー内の組織数回すすいでください。 </li><li> 150ミリメートルペトリ皿に一度に1子葉を転送します。ピンセットで保持し、シャーレ上の血管からかみそりの刃で組織をこすり。 0.9％NaClを含む別のビーカー中に掻き組織を置きます。すべての組織片について、この手順を繰り返します。 </li><li>細胞解離ふるいに組織の一部を転送し、溶出液が透明になるまで徹底的に0.9％NaClですすいでください。全ての組織に対して、この手順を繰り返します。 </li><li>細胞解離ふるいに掻き組織をすすいだ後、余分な液体と重さ、それを排出します。 この時点で、組織は、O / N DMEM中で4℃で無菌三角フラスコ内に格納することができる。 </li></ol></li><li>胎盤組織の酵素消化<ol><li>あらかじめ温めておいた酵素希釈緩衝液100ml、1ミリリットルのDNase Iと20ミリリットル2.5％10Xトリプシン：組織消化液を調製する。 </li><li> 500ミリリットルの滅菌三角フラスコに総採取した組織（通常は約250〜300グラム）から60グラムを転送する、組織を分割する。 </li><l私は&gt;組織を含む三角フラスコに組織消化物を追加し、150 rpmで45分間シェーカーで37℃でインキュベートする。 </li></ol></li><li>解離した細胞を回収する<ol><li>組織が安定するまで最初の45分解離した後、傾斜で消化フラスコを設定します。 </li><li>未解離組織を収集しないように注意しながら、上清を集める。回収した上清に、HBSSを同量を追加し、滅菌15mL遠心管に移す。解離していない組織の追加部分については、解離していない組織とステップ3.2から始まる手順を繰り返してください。 </li><li>遠心分離機で15分間、1,000×gで4℃でホモジネート。 </li><li>各バッチには、遠心分離後、ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去する。胎盤絨毛細胞は赤血球の上にある、ペレットの白い部分に主にある。 </li><li> STに絨毛細胞（ペレットの白い部分）を転送erile 50ミリリットルコニカル遠心管、氷上に保つ。 </li><li> 3つ全ての消化段階から細胞を収集した後、滅菌50mlコニカル遠心管の最上部に挿入さ100μmナイロン細胞ストレーナーを用いて懸濁液を濾過する。細胞懸濁液の濾過が遅くなる場合は、チューブ内に真空を引くために、フィルタを上に持ち上げる。 </li><li> 10分間1,000×gで4℃で遠心。慎重にペレットを乱すことなく、上清を除去します。 </li></ol></li></ol> 2。胎盤絨毛細胞をホモジナイズ<ol><li>分離プロセスを開始する前に、20mMのトリス-HCl、pH7.4および1mMのEDTAを含有する低張溶解培地（HLM）を50mlを調製する。使用直前に、HLMにプロテアーゼ阻害剤を添加し、氷上でメディアを保持します。 </li><li>生物学的安全フード内で、細胞への氷冷HLMの4倍の細胞ペレットの量を追加します。やさしく、徹底的に細胞をピペッティングして細胞を再懸濁アップANを10mlピペットを用いてdをダウン。 </li><li> 10分間氷上に懸濁した細胞をインキュベートします。 </li><li>氷の上でなければなりませんダウンスホモジナイザーに細胞を移す。ゆっくりホモジナイザーのゆったりした乳棒で20〜25穏やかなストロークを適用することにより、細胞を均質化する。 </li><li>遠心未破壊細胞、核および細胞破片を除去するために10分間3,000×gで4℃で細胞溶解物。 </li><li>上清を回収し、（25,000×gで遠心分離することができるまたは代替）SW28チューブに移す。ミトコンドリアを除去するために20分間25000×gで4℃で遠心します。 </li></ol> 3。超遠心分離によって脂質小滴を単離する<ol><li> 100mMの炭酸ナトリウム（M 106グラム/モル）緩衝液（pH 11.5）および60％スクロース（w / w）の溶液50mlを50mlを調製する。使用直前に炭酸ナトリウム緩衝液にプロテアーゼ阻害剤を添加し、氷上に保つ。 </li><li> 50ミリリットル遠心管にステップ2.6から上清を回収し、調整SW28ローター、または同等のための超遠心管の底部へのスクロースおよび転写の20％。 〜氷冷100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 11.5）を10mlのチューブに充填するために、氷冷HLM 0.5〜1 mlの密度に調整オーバーレイ上清。 </li><li> SW28スイングバケットローターを使用して45分間13万×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>浮遊層を集め、10％ショ糖に調整し、SW41Tiローター用13.2ミリリットル超遠心管の底部、または同等に移す。オーバーレイ密度約5mlの氷冷100mMの炭酸ナトリウム緩衝液（pH 11.5）を、0.5mlの氷冷HLMの上清を用いて調整した。 </li><li> SW41Tiスイングバケットローターを用いて60分間274,000×gで4℃で遠心します。脂肪滴層の破壊を最小限にするために、停止（ロータ減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>慎重に含む最浮動層（ 図2D）を収集1ミリリットルピペットを繰り返しステップ3.4に脂肪滴。 </li><li> SW41Tiスイングバケットローターを用いて30分間274,000×gで4℃で遠心します。ストップ（ローター減速= 0）に海岸にローターを許可します。 </li><li>慎重に100μlのHLMを含む3 1.5mlチューブに曲げたパスツールピペットで脂肪滴を含むトップ白色浮動層を収集します。 </li></ol> 特徴付ける脂質滴画分（プロトコール1及び2） 脂肪滴画分の回収および純度は、光又は電子顕微鏡と組み合わせてウエスタンブロットによって検証することができる。さらに、異なる遠心分離工程後のアリコートを収集することができ、浄化効率を決定するために保持される。ウェスタンブロッティングでは、tは上に他の膜画分に脂肪滴を比較するよりも、全細胞溶解物の当量を表し、脂肪滴の体積分率を比較することがより適切である総タンパク質含有量24の彼が根拠。

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

<html> このプロトコルの中の重要なステップ 培養細胞の成長中のメディアと細胞密度と一致していることを確認します。細胞の脂質滴はそれらに関連するタンパク質は、細胞が17培養された環境に大きく依存している点で独特である。したがって、細胞が成長する培地と細胞の密度は、密接に溶解する前に監視されるべきである。 脂肪滴のタンパク質組成物は、酵母細胞の増殖期の関数である。一部のタンパク質は、固定相に対する対数増殖期に小滴に結合される。また、効率のスフェロプラストは、酵母細胞の増殖期の関数である。後者は酵素処理に対してより耐性であるため、対数増殖期の細胞を静止期の細胞よりフェロプラストの高い収率を有するであろう。 10トン &quot;&gt; 細胞をオープン破る優しい技術を使用してください。</strong...

細胞の脂質滴は、細胞内で複数の機能を果たす動的小器官である。それらはエネルギーに変換またはリン脂質合成のために使用することができる中性脂質の貯蔵のハブである。液滴は、アテローム性動脈硬化症、肥満症および関連する代謝疾患を含む生理学的および病理学的状態において中心的役割を果たし、また、感染症1,2。さらに、それらは、バイオディーゼル燃料のための魅力的な供給源である。 脂肪滴の細胞の役割に関する多くの情報は、幅広い生物3から精製された液滴のプロテオミクスおよびlipidomic分析から得られている。これらの生物は、細菌4,5、酵母6-11含ま12,13植物、14を線虫、そして15,16飛ぶました。ヒトの代謝性疾患における脂肪滴の役割への関心を考慮すると、液滴はまた、培養動物細胞であり、aから単離されているニマル組織。培養細胞株は、3T3-L1脂肪細胞17、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞K2 18、ヒトhepatocyes 19,20、および上皮細胞系21が含まれている。液滴が単離されたから動物組織は、マウス骨格筋22、肝臓23、及び乳腺23が含まれている。上述したように、ほとんどの液滴の分離の研究の目標は、中性およびリン脂質に結合した因子およびlipidomic分析プロテオーム解析を実行することである。 中性脂質以来 - 脂質滴の最も多い成分は - ほとんどの他の細胞材料よりも緻密であり、液滴の分離は、従来、密度勾配遠心分離を用いて行われた。その手法は、ここで紹介するの両方プレップの目玉です。従来の技術は、培養6,24分裂酵母細胞からの液滴の分離を視覚的に結合され、変更されたおよび胎盤組織から得られたヒト細胞をnoncultured。目標は、液滴分離のための出発点に、2つの非常に異なる細胞型を選択することによって、この技術の広い適用可能性を示すことである。この手法は、ほとんどの生物からの液滴を分離したい方のために有用であるはずである。 プロトコル1は、真核細胞分裂の間に25滴形成を観察するためのモデルとして使用されてきた分裂酵母、 シゾサッカロミセス·ポンベから脂質滴の単離が記載されている。出芽酵母サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、脂質滴生物学を研究するためのモデル生物として広く使用されている。プロトコル1は、生物や強調されている準備の違いの両方に適用可能である。 プロトコル2は、ヒト満期胎盤から得た順にある胎盤絨毛細胞から脂肪滴の単離を記載している。ザ·満期胎盤のコレクションは、安全かつ倫理的に脂肪滴のかなりの数が含まれ、容易に入手可能なヒト組織26、200〜250を得するユニークな機会を提供します。これは、液滴が培養された細胞に由来高等真核生物における最も脂肪滴分離作業とは対照的である。これらの研究では、脂肪酸は、多くの場合、中性脂質の合成、従って、液滴の成長を促進する培養物に添加される。これは、脂質滴を、胎盤組織中の天然の条件下で形成される、ここでの作業とは対照的である。 脂肪滴の画分の純度は、細胞小器官マーカー抗体を用いたウェスタンブロット分析によって決定される。これら2つのプロトコルが、後続のプロテオームとlipidomic分析するのに適した脂肪滴画分が得られる。

<table><tbody><tr><td>プロトコル1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1。酵母細胞の増殖とスフェロプラストへの変換</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エジンバラミニマルメディア(EMM)</td><td>サンライズサイエンスプロダクツ</td><td>2005</td><td></td></tr>酵母<tr><td>抽出物と5つのサプリメント(YE5S)</td><td>サンライズサイエンスプロダクツ</td><td>2011</td><td>YE5S培地と各サプリメントの225 mg / ml:アデニニー、ヒスチジン、ロイシン、リジン、ウラシル。出芽酵母に相当するのはYPDです。</td></tr><tr><td>YPDの粉</td><td>の日の出の科学プロダクト</td><td>1875</td>年<td>のためのS.のセレビシae</i</td></tr><tr><td>>ソルビトール</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP439</td><td></td></tr><tr><td>酵母の溶解酵素</td><td>MP Biomedicals</td><td>215352610</td><td></td></tr><tr><td>Trichoderma harzianumからのLysingの酵素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Zymolayse-20T</td><td>Sunrise Science Products</td><td>N0766391</td><td>S. cerevisiae用</td></tr><tr><td>BODIPY 493/503</td><td>Invitrogen</td><td>D-3922</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス</td> フィ<td>ッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-542-B</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック移送ピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>137115AM</td><td></td></tr><tr><td>1 L ガラス瓶</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mlフラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.8 Lフラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2。酵母脂質液滴分離</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリス-HCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>フィコール 400</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP525</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/POR 透析膜</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤</td><td>ロシュ・ダイアグノスティック</td><td></td>ス <td>11873580001 刺激性</td></tr><tr><td>ダウンス ホモジナイザー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ 25 mm x 89 mm (SW28 用)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>12-14k Spectra/Por 透析膜</td><td>SpectrumLabs</td><td>132680</td><td></td></tr><tr><td>温度制御シェーカー</td><td>ニューブランズウィック・サイエンティフィック</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>サーモ・ソルバル・レジェンド XTR 遠心分離機</td><td>サーモ・サイエンティフィック</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット遠心分離機ローター</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite* F15-6x100y 固定角ローター</td><td>Thermo-Scientific</td><td>75003698</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 LB-M</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 超遠心分離機ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>プロトコル 2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><強い>1.胎盤絨毛細胞の単離</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てアンダーパッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23666062</td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ可能なパン(容器)、3 L</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>1336110</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ、シャープシャープ、ストレート</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1406011</td><td></td></tr><tr><td>ロンドンフォーセプス</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1108002</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #7b 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>1127020</td><td></td></tr><tr><td>カミソリの刃フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S65921CD-1</td><td></td></tr>フィ<tr><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>S1145</td><td></td><td></td></tr><tr><td>40メッシュスクリーン用スクリーンカップ&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド細胞染色剤100 &mu;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>150 mm シャーレ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>NC9054771</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>S642</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P333</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>P386</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>2.5% Trypsin 10x</td><td>Invitrogen</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>DNase I grade II, from bovine pancreas</td><td>Roche Applied Science</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 三角フラスコ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ml ビーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml 遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 ml 血清ピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml 遠心チューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11965084</td><td></td></tr><tr><td><強い>2。絨毛性胎盤細胞からの脂質液滴の単離</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP120</td><td></td></tr><tr><td>D-スクロース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP220</td><td></td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP357EDTA</td><td></td></tr><tr><td>フリープロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤</td><td>ロシュ</td><td></td>診断<td>11873580001刺激性</td></tr><tr><td>デュースホモジナイザー&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9938</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ 25 mm x 89 mm (SW28 用)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>355642</td><td></td></tr><tr><td>超透明遠心チューブ 14 mm x 89 mm (SW41 用)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てホウケイ酸ガラス パスツールピペット</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820C</td><td></td></tr><tr><td>生物学的安全フード&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィ</td><td></td><td></td></tr>ック <tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>温度制御シェーカー</td><td>ニューブランズウィックサイエンティフィック</td><td>C25KC</td><td></td></tr><tr><td>サーモソルバルレジェンドXTR遠心分離機</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>75004521</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット 遠心分離機ローター</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>75003607</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機 LB-M</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SW28 超遠心ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>342204</td><td></td></tr><tr><td>SW41 Ti 超遠心ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td> ウェスタン ブロット</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680 ヤギ 抗ウサギ IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-68071</td><td>希釈率 1:15,000</td></tr><tr><td>IRDye 800CW ヤギ抗マウス IgG</td><td>LI-COR</td><td>926-32210</td><td>希釈 1:5,000</td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 12% Bis-Tris gels</td><td>Invitrogen</td><td>NP0341</td><td></td></tr><tr><td>Primary antibodies for Protocol 1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erg6p</td><td>gift from Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>希釈 1:5,000</td></tr><tr><td>Dpm1p</td><td>Abcam</td><td>ab113686</td><td>4 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Por1p</td><td>ギフト from Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>希釈率 1:5,000</td></tr><tr><td>Pma1p</td><td>gift from Dr. G. Daum</td><td>Graz University of Technology, Austria</td><td>希釈率 1:10,000</td></tr><tr><td>Vma1p (抗ATP6V1A)</td><td>Abcam</td><td>ab113745</td><td>0.5 &mu;プロトコル</td></tr> 2Perilipin 2 (anti-ADFP) の g/<tr><td>ml</td><td></td><td></td><td></td>Primary 抗体</tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab52355</td><td>2 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>Calnexin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2679</td><td>希釈率 1:1,000</td></tr><tr><td>GM130</td><td>Biorbyt</td><td>orb40533</td><td>希釈率 1:25</td></tr><tr><td>COX IV</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4850</td><td>希釈率 1:1,000</td></tr><tr><td>MEK1</td><td>Biorbyt</td><td>orb38775</td><td>希釈率 1:50</td></tr></tbody></table>

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

脂肪滴は、ほとんどの真核および特定の原核細胞で見つけることができる動的な細胞小器官である。構造的には、液滴は、リン脂質単分子膜に囲まれた中性脂質のコアで構成されています。液滴の細胞の役割を決定する際に最も有用な技術の1つは、液滴と共に単離することができ、結合したタンパク質のプロテオーム同定されている。分裂酵母とヒト胎盤絨毛細胞：ここでは、二つの方法が2幅広い真核生物からの脂肪滴とその結合したタンパク質を分離するために記述されている。両方の技術は、違いがありますが、mainメソッド - 密度勾配遠心分離を - 両方の製剤で共有されている。これは、提示された液滴分離技術の広い適用可能性を示している。 第一のプロトコルにおいて、酵母細胞は、その細胞壁の酵素消化によって、スフェロプラストに変換される。結果としてフェロプラストはその後紳士ですLYゆったりホモジナイザーで溶解。フィコール密度勾配を提供するために、溶解物に添加し、そして混合物を3回遠心分離する。第一のスピンの後、脂質滴は、小胞体（ER）、原形質膜、および液胞と共に遠心分離管の白色フローティング層に局在している。二つの連続スピンはこれらの他の3小器官を除去するために使用される。結果は滴と結合したタンパク質を持っている層である。 第二のプロトコルでは、胎盤絨毛細胞は、細胞がゆったりホモジナイザーでホモジナイズするトリプシンで酵素消化によりヒト満期胎盤から単離され、DNA分解酵素Iをされています。低速·中速遠心分離工程は、未破壊細胞、細胞破片、核、ミトコンドリアを除去するために使用される。スクロース密度勾配を提供するために、ホモジネートに添加し、混合物を他の蜂巣から脂質滴を分離するために遠心分離されるR画。 両方のプロトコルにおける脂肪滴の純度は、ウェスタンブロット分析によって確認される。両方の調製物からの液滴画分は、その後のプロテオームとlipidomic分析に適している。

期待通りに密度勾配遠心分離が働いていた場合、浮動層が脂肪滴が含まれている必要があり、高速スピンの進行を通じて、他の細胞小器官が枯渇する。 プロトコル1は、ウェスタンブロット、マーカー脂肪滴（Erg6p）に対する抗体、および酵母、ER（Dpm1p）、ミトコンドリア（Por1p）中の脂質滴と相互作用することが見出されている細胞小器官を用いて行った、原形質膜（Pma1p）、および液胞（Vma1p）。 各3スピンの浮遊層（ステップ3.7、3.10、及び3.13）を集め、等量のは、トリクロロ酢酸（15％最終濃度）で沈殿させ、水に可溶化した。各3スピンの細胞溶解物（ 図3A、「リジン」）およびタンパク質プレップ13mlの（ 図3A、「Spin1」、「Spin2」、および「Spin3」）をニトロセルロースに移し、12％SDS-PAGE上で分離した膜、およびオルガネラ仕様でイムノブロットFIC抗体。予想されたように、脂肪滴マーカータンパクErg6pは3スピン（ <strong...

1つの細胞の脂質滴を単離するための技術）は、酵母細胞および2）ヒト胎盤が提示される。両方の手順は、液滴の中心を含有する得られた浮遊層が容易に、眼によって視覚化抽出し、純度についてウェスタンブロット分析によって定量化することができる密度勾配遠心分離である。

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

この手順の全体的な目標は、組織から脂肪滴を分離することです。これは、最初に胎盤組織を解剖して分離することによって達成されます。次に、オレインの細胞を均質化します。次に、細胞小器官はいくつかの遠心分離ステップによって分離されます。最後に、脂質液滴を含む浮遊層が収集され、脂質滴が特徴付けられます。最終的には、蛍光顕微鏡とウェスタン血液分析を使用して、脂肪滴画分の純度を示します。この技術の主な利点は、ほとんどの大動脈細胞から脂肪滴を単離することが可能であることです。特定の組織では、液滴の数が浮遊G層および液滴の数を減少させるものより少なくなる可能性があることに注意してください。胎盤は、単胎妊娠の健康な女性から採取されました 選択的帝王切開分娩を受ける前に 正期産の被験者は、胎盤の収集について書面によるインフォームドコンセントを与えました。胎盤の収集とその後の使用は、テネシー大学とノックスビルのテネシー大学医学部の承認を得て行われました。生物学的安全性フードの治験審査委員会は、胎盤を滅菌オートクレーブ可能な容器に移し、滅菌生理食塩水を使用して胎盤と膜から血液を慎重に洗浄します。1リットルのビーカーに入った血まみれの生理食塩水を液体の生物学的廃棄物として捨てます。この滑らかな表面で臍帯が上を向いている状態で、胎盤を無菌状態に置きます。へその緒と胎児の膜を取り除きます。次に、母体の表面が上を向くように胎盤を裏返します。次に、表面から約3ミリメートルのところにある基底板組織を取り除きます。絨毛膜板を避けて一度に1つのCOTAリードインを解剖し、絨毛組織を生理食塩水を含む250ミリリットルのビーカーに集めます。次に、0.9%滅菌生理食塩水と鉗子を使用して、液体廃棄物用の1リットルのビーカーを使用して渦巻くことにより、別のビーカーで組織を数回すすぎます。一度に1つのコーディリードインを150ミリメートルのペトリ皿に移します。鉗子で保持し、かみそりの刃を使用して、血管から組織をペトリ皿にこすり落とします。削り取った組織を0.9%滅菌生理食塩水を含む別のビーカーに入れます。すべてのティッシュピースについて繰り返します。細胞解離cveで削り取った組織をすすぎた後、余分な液体と重量を排出して胎盤組織を消化します。組織消化混合物を調製した後、収集した組織全体から60グラムを500ミリリットルの滅菌ヘレンマイヤーフラスコに移して組織を分割します。組織消化混合物を組織が入ったフラスコに加え、シェーカーで摂氏37度で45分間インキュベートします。150 RPMでインキュベーション後に解離した細胞を採取し、フラスコを傾けて組織を沈殿させます。スーパーナチンを集める。UND解離組織を採取しないように注意してください。上清に同量のHBSSを加えてから、滅菌済みの15ミリリットル遠心チューブに移します。1000回遠心分離後の各バッチについて、UND関連組織の残りの部分との解離と上清の収集を繰り返します。摂氏4度で15分間の重力で、ペレットを乱さずに上清を吸引します。胎盤絨毛細胞は、主に赤血球を覆うペレットの白い部分にあります。ペレットの白い部分の絨毛細胞を滅菌済みの50ミリリットルの円錐形遠心分離管に移し、氷上に保ちます。3つの消化段階すべてから細胞を採取した後、無菌の50ミリリットルの円錐形遠心分離管の上部に挿入した100ミクロンのナイロン製セルストレーナーを使用して、懸濁液をろ過します。細胞懸濁液のろ過が遅くなる場合は、フィルター上で上向きに持ち上げて、チューブ内の真空を遠心分離機に4°C、重力1000倍で10分間吸引します。ペレットを乱さずに上清を慎重に取り除き、新たに調製した低張溶解培地または生物学的安全フード内のHLMを使用して胎盤絨毛細胞を均質化し、細胞ペレットの4倍の量の氷冷HLMを細胞に加えます。10ミリリットルのピペットを使用して、優しく徹底的に蘇生します。細胞をピペッティングして懸濁します。細胞を氷上で10分間インキュベートした後、氷冷したダウンホモジナイザーに移し、ゆるい乳棒で20〜25回の穏やかなストロークを適用して細胞をゆっくりと均質化します。ライセートを重力3000倍、摂氏4度で10分間回転させ、壊れていない細胞を取り除きます。次に、上澄みを新しいチューブに集めてから、重力の25,000倍、摂氏4度で20分間再び回転させます。ミトコンドリアを除去して超遠心分離によって脂肪滴を分離するには、スーパーナチンを50ミリリットルの遠心分離チューブに集めます。20%スクロースに調整し、S SW 28ローターまたは同等のオーバーレイ用の超遠心チューブの底に、約10ミリリットルの氷冷、100ミリモル炭酸ナトリウム緩衝液、および0.5〜1ミリリットルの氷冷HLMで密度調整されたスーパーナチンを移し、130でS SW 28スイングバケットローター遠心分離機を使用してチューブを満たします。 重力の000倍、摂氏4度で45分間。次に、浮遊層を収集し、10%スクロースに調整し、SW 41 TIローターまたは同等のもの用の13.2ミリリットルの超遠心チューブの底に、密度調整された上清を約5ミリリットルの氷冷、100ミリモルの炭酸ナトリウム緩衝液、および0.5ミリリットルの氷冷HLMで274で遠心分離した後、上澄みをオーバーレイします。 重力の000倍、摂氏4度で60分間。SW 41 TIローターで、1ミリリットルのピペットを使用して、脂肪滴を含む上部の浮遊層を慎重に収集します。容量を10%スクロースに調整し、再度13.2ミリリットルの超遠心チューブに移してから、5ミリリットルの氷冷、100ミリモルの炭酸ナトリウム緩衝液、0.5ミリリットルの氷冷HLMを重ねます。30分間遠心分離した後、曲げたPEピペットを使用して、脂肪滴を含む上部の白色浮遊層を100マイクロリットルのHLMを含む3本の1.5ミリリットルチューブに慎重に収集します。この図に見られるように、テキストプロトコルに従って脂質液滴を特徴付け、ヒト用語胎盤絨毛細胞から単離された脂質液滴の存在を、中性脂質特異的蛍光色素boda P 4 93 5 0 3で染色することにより確認し、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。ここに示されているのは、単離された脂肪滴画分の純度を、脂肪滴のマーカータンパク質を用いてウェスタンブロッティングにより評価した。これには、エラ、goiマーカー、GM1、30CO、4、ミトコンドリアおよび原形質膜、MEK1を含む脂質飛沫のマーカータンパク質が含まれていた。老朽化後、冷たいアセトンで脂質が液滴化し、タンパク質が抽出されます。画分をウェスタンブロッティングパラリピンに供した。2つ目は、脂質液滴タンパク質が核後上清と、脂質液滴を含む単離された白色浮遊層で検出されたことです。MK oneやGM oneなどの原形質膜に特異的なタンパク質30は、スピン4とスピン5の浮遊層下のいずれの層の脂肪滴画分でも検出されなかった。以前に報告されたように、タンパク質カルネキシンおよびミトコンドリア膜タンパク質CO X fourの弱い染色は、脂質液滴画分の他の場所で検出されている。これらの結果は、脂肪滴が哺乳類細胞のミトコンドリアおよびERRと相互作用することを示す以前の報告と一致しています。この手順に続いて、プロテオミクス法やリピドーム法などの他の方法を実行して、液滴に結合している要因などの追加の問題を研究できます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

我々は調査 - スキャンエレクトロスプレーイオン化質量分析（ESI /...

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

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