3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化
2014年6月11日
この資料は、乳癌細胞の浸潤を定量化するための3次元（3D）のアッセイの使用のための詳細な方法論を提供する。具体的には、細胞が侵入したときに発生する膜の完全性の喪失を検査するためにこのようなアッセイ、定量化、およびデータ分析だけでなく、メソッドを設定するために必要な手順を説明します。
次の手順の全体的な目標は、3次元浸潤アッセイを使用して癌細胞の侵襲能力を評価することです。これは、最初に基底膜マトリックスでがん細胞を培養することによって達成されます。次に、マトリックスの細胞浸潤を光学顕微鏡で5日以上観察します。
最終ステップでは、細胞を蛍光抗体で標識し、目的のタンパク質を局在化させます。最終的には、がん細胞の浸潤速度とそれに伴うタンパク質発現の変化を免疫蛍光顕微鏡で解析できます。この技術がトランズウェルチャンバー浸潤アッセイなどの既存の技術よりも優れている点は、3Dメジャーゲル浸潤アッセイが、がんが成長を解決するin vivo環境をよりよく模倣
していることです。この技術の意味するところは、がん治療に向けられており、がんの浸潤と転移に関与する新しいタンパク質を研究で特定できます。培養手順を開始する前に、基底膜マトリックスA P 200ピペットとピペットチップを氷上に摂氏4度で一晩置きます。翌日、氷のように冷えた200マイクロリットルのピペットの先端を使用して、50マイクロリットルのマトリックスを共焦点の1番ガラス底皿の底にらせん状に広げます。
次に、マトリックスが固化トリプシンアイを受けている間、少なくとも30分間、摂氏37度の細胞培養インキュベーターに皿を置きます。その間、マトリックスは固化トリプシン目、細胞が分離し始めたら、細胞の70〜80%コンフルエントな100ミリメートルプレートです。10ミリリットルの培地でトリプシンを不活性化し、次に細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐管に移します。細胞がスピンダウンしている間、細胞を100Gおよび摂氏4度で3分間遠心分離します。
基底膜マトリックスの皿ごとに50マイクロリットルのマトリックスを1つの1ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに分注し、細胞が回転し終わったらチューブを氷の上に置きます。ペレットを乱さずに上清を吸引し、その後蘇生します。細胞を1ミリリットルの培地に懸濁し、次にそれらをカウントします。
4番目の細胞に10の2.5倍を新しいマイクロ遠心チューブに移し、細胞懸濁液に培地を補充して最終容量50マイクロリットルにします。次に、50マイクロリットルの氷冷基底膜マトリックスを細胞に1対1の比率で追加し、最終容量を100マイクロリットルにします。固化した基底膜マトリックス上にマトリックスを細胞混合物に穏やかにプレートし、細胞を細胞培養インキュベーターのマトリックスに埋め込むようにします。
30分後、マトリックスを2ミリリットルの培地で覆い、ディッシュをインキュベーターに戻し、実験期間中毎日培地を交換し、実験期間中は10倍対物レンズを光学顕微鏡で1日1回使用して、20の差動干渉を取ります。基底膜マトリックスに懸濁したコロニーのコントラスト画像。画像を盲目的に解析して、細胞コロニーの星状形成を決定します。
コロニーは、細胞のステロイドからの1つ以上の突起が観察された場合、星状であると見なされます。3Dコロニーの形態形成の特徴を調べるには、インキュベーターから細胞を取り出し、氷のトレイに置きます。メディアを吸引し、次に2ミリリットルの冷たいPBSでコロニーを3回洗浄します。
最後の洗浄後、細胞を2ミリリットルの20%アセトン、80%メタノール溶液に摂氏4度で20分間固定し、皿を室温に戻します。基底膜マトリックスが室温になったら、固定剤を吸引し、示したようにプレートをPBSで3回洗浄します。最終洗浄後、細胞上の非特異的結合を2ミリリットルの3%BSAで室温で少なくとも30分間ブロックします。
次に、室温で3%BSAで希釈した目的の一次抗体で細胞をインキュベートします。1時間後、未結合の一次抗体をPBSで3回洗い流した後、一次抗体溶液を取り出し、3%BSAに溶解した二次抗体を適切な希釈で加え、暗所で室温で1時間細胞をインキュベートします。未結合の二次抗体をPBSで洗い流した後、細胞の核を2ミリリットルのhext 3, 3, 2, 5 8 in PBSで5分間暗所で染色します。
次に、結合していないヘクストをPBSで細胞から5回洗い流します。5回目の洗浄後、封入剤をマトリックス-細胞混合物に直接添加し、封入剤をガラスカバースリップで慎重に覆って、基底膜マトリックスと細胞混合物の完全性が損なわれないようにします。ディッシュを室温で一晩乾燥させた後、蛍光顕微鏡で、これらの画像に使用されている抗体に適したレーザー波長で画像を取得します。
3Dマトリックスに侵入するMDA MB 2 3 1セルが示されています。細胞は1日目にマトリックスに埋め込まれ、3日目までに侵襲性星状構造を形成し始めました。5日目までに、マトリックスへの完全な侵入が観察されました。
次に、形成された星状コロニーの数をカウントし、皿ごとの侵襲的コロニーと非侵襲的コロニーの総数の割合として表しました。さらに、測定は5日間毎日行われたため、これらの免疫蛍光画像で浸潤率も評価できました。MDA MB 2 3 1細胞の代表的な浸潤性星状コロニーは、膜完全性の喪失と基底膜タンパク質ラミニン5のびまん性局在を示し、MDA MB 2 31乳がん細胞で観察されるものとはまったく対照的です。
ラミニン5は、未処理の非悪性MCF10A細胞の記憶アシニンを囲む無傷の基底膜層に局在化した。この手順に続いて、間質細胞との共培養を行い、がん細胞が発生後に微小環境内で間質細胞とクロストークするかなどの追加の質問に答えることができます。この技術は、腫瘍学の研究者が、がん細胞の転移性拡散に必要ながんの浸潤と移動を調査する道を開きました。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この記事では、乳がん細胞の浸潤を定量化するための三次元（3D）アッセイの方法論を提供します。手順には、アッセイの設定、定量化、データ分析、および細胞浸潤時の膜完全性損失の検査が含まれます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- がん研究
背景
- がん細胞の浸潤能力は転移を理解する上で重要です。
- 3Dアッセイは従来の方法と比較して、in vivo環境をよりよく模倣します。
- 蛍光標識により詳細なタンパク質局在研究が可能になります。
- 光学顕微鏡は時間経過による細胞浸潤の観察に使用されます。
研究目的
- 乳がん細胞の浸潤能力を評価すること。
- 浸潤時のタンパク質発現の変化を分析すること。
- がん細胞挙動の研究方法を改善すること。
使用された方法
- 細胞外マトリックスを用いたがん細胞の培養。
- 5日間以上にわたる光学顕微鏡による細胞浸潤の観察。
- タンパク質局在のための細胞の蛍光抗体による標識。
- 免疫蛍光顕微鏡を用いた浸潤率とタンパク質発現変化の分析。
主な結果
- 3D浸潤アッセイはin vivo環境を効果的に模倣します。
- 浸潤時にタンパク質発現の有意な変化が観察されました。
- この方法はがん細胞浸潤の信頼できる定量化を提供します。
- 結果はがん細胞挙動の理解を深めます。
結論
- 3Dマトリックス浸潤アッセイは従来の技術よりも優れています。
- この方法はがん転移に関するより良い洞察につながる可能性があります。
- 将来の研究はこれらの方法論を基に更なる研究を行うことができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Quantifying breast cancer cell invasiveness in a physiologically relevant 3D microenvironment enables mechanistic de-risking of invasion pathways and supports target validation in oncology drug discovery. This approach improves predictive confidence by modeling cell-ECM interactions that drive metastatic potential, informing early go/no-go decisions. The method aligns with discovery-stage efforts to identify regulators of epithelial-mesenchymal transition and stromal crosstalk.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by assessing how genetic or pharmacological perturbations affect invasive stellate colony formation in a basement membrane model.
- Operational Value: Enables functional validation of candidate invasion regulators through quantitative imaging of membrane integrity loss and protein mislocalization.
- Scientific Value: Supports phenotypic screening of compounds that modulate cytoskeletal dynamics or ECM remodeling in a disease-relevant system.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, quantitative readouts of invasion kinetics and stellate formation for reproducible compound evaluation across screening campaigns.
- Operational Value: Establishes a scalable 3D culture platform compatible with immunofluorescent readouts, enabling multiplexed analysis of invasion and biomarker expression.
- Scientific Value: Facilitates assay readiness for target de-risking by linking invasive behavior to changes in key proteins such as laminin five.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models disease-relevant cell-microenvironment interactions to study stromal co-culture effects on invasion, supporting mechanistic continuity from discovery to preclinical validation.
- Operational Value: Provides a quantitative framework to assess how microenvironmental cues modulate invasive potential, informing risk-adjusted advancement decisions.
- Scientific Value: Enables evaluation of translational biomarkers associated with loss of epithelial integrity during invasion, aligning with preclinical mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The 3D invasion assay integrates into the oncology discovery continuum from target hypothesis testing through lead optimization, providing functional validation of targets implicated in metastasis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how gene knockdown or overexpression alters invasive capacity in a 3D ECM context.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs such as stellate colony percentage and invasion rate over time, enabling reliable compound screening.
- Analytics: Generates measurable endpoints including invasive colony counts and protein localization patterns that allow side-by-side comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects invasion phenotypes to microenvironmental signaling, supporting biomarker alignment when stromal interactions are tested.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for evaluating invasion across multiple breast cancer models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing reliance on artificial 2D systems that fail to capture invasion-relevant signaling.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility through defined matrix preparation, embedding protocols, and blinded image analysis.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of metastasis-associated targets, reducing late-stage attrition due to poor predictive models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of invasion-modulating candidates based on functional evidence from a physiologically relevant assay.
Implementation Considerations
- Requires expertise in 3D cell culture, fluorescent microscopy, and image analysis for stellate colony quantification.
- Dependent on access to basement membrane matrix, confocal glass-bottom dishes, and fluorescent antibody panels for protein localization.
- Necessitates standardization across teams for consistent matrix solidification, cell embedding, and daily imaging protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different cancer types or stromal co-culture systems.
- Limited by the need for manual image analysis and the semi-quantitative nature of stellate scoring without automated image processing pipelines.
