3次元（3D）モデルを用いた乳癌細胞浸潤の定量化

本手順の目的は、3次元浸潤アッセイを用いてがん細胞の浸潤能を評価することです。まず、がん細胞を基底膜マトリックス内で培養します。その後、光学顕微鏡を用いて、マトリックスへの細胞浸潤を5日間以上にわたって観察します。

最終ステップとして、目的タンパク質を局在化させるために、細胞を蛍光抗体で標識します。最終的に、がん細胞の浸潤速度およびそれに伴うタンパク質発現の変化を、免疫蛍光顕微鏡法によって解析することが可能です。Transwellチャンバー浸潤アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、3Dマトリゲル浸潤アッセイの方が、がん細胞が増殖する生体内環境をより適切に模倣している点にあります。

この手法はがん治療への応用が期待されており、がんの浸潤および転移に関与する新たなタンパク質の同定を可能にします。培養操作を開始する前に、基底膜マトリックス、P 200ピペット、およびピペットチップを4 °Cで一晩氷上に置いておきます。翌日、氷冷した200 µLピペットのチップを用い、共焦点顕微鏡用No. 1ガラスボトムディッシュの底面に50 µLのマトリックスを渦巻き状に塗布します。

次に、マトリックスを凝固させるため、ディッシュを37 °C、5% CO2の細胞培養インキュベーターに少なくとも30分間置きます。細胞が剥がれ始めたら、70〜80%のコンフルエント状態にある100 mmプレートの細胞をトリプシン処理します。10 mLの培地でトリプシンを不活化し、細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。細胞を4 °C、100 ×gで3分間遠心分離し、細胞を沈殿させます。

基底膜マトリックス1皿につき、マトリックスを50 µLずつ1 mLマイクロ遠心チューブに分注し、細胞の遠心分離が完了するまでチューブを氷上に置きます。ペレットを乱さないように上清を吸引し、次いで細胞を1 mLの培地で再懸濁してカウントします。

2.5 × 10⁴ 個の細胞を新しいマイクロ遠心チューブに移し、培地を加えて細胞懸濁液の最終容量を 50 µL に調整します。次に、氷冷した基底膜マトリックス 50 µL を細胞に 1:1 の比率で加え、最終容量を 100 µL とします。このマトリックスと細胞の混合物を、あらかじめ固化させた基底膜マトリックスの上に静かに播種し、細胞培養インキュベーター内で細胞がマトリックスに埋め込まれるまで静置します。

30分後、マトリックスを2 mLの培地で覆い、ディッシュをインキュベーターに戻します。実験期間中は毎日培地を交換してください。また、実験期間中、1日1回、光学顕微鏡の10倍対物レンズを用いて、基底膜マトリックス中に懸濁したコロニーの微分干渉（DIC）画像を20枚撮影します。これらの画像をブラインド解析し、細胞コロニーの星状形成（stellate formation）を判定します。

細胞の集団から1つ以上の突出部が観察される場合、そのコロニーは星状であるとみなされます。3Dコロニーの形態学的特徴を調べるために、細胞をインキュベーターから取り出し、氷を入れたトレイの上に置きます。培地を吸引し、次に2 mLの冷PBSでコロニーを3回洗浄します。

最後の洗浄後、20%アセトン、80%メタノール溶液2 mLを用いて、4°Cで20分間細胞を固定し、その後ディッシュを室温に戻します。基底膜マトリックスが室温になったら、固定液を吸引し、先ほど示した方法でPBSを用いてプレートを3回洗浄します。最終洗浄後、3% BSA 2 mLを用いて、室温で30分以上、細胞の非特異的結合をブロックします。

次に、3%BSAで希釈した目的の一次抗体を用いて、室温で細胞をインキュベートします。1時間後、PBSで未結合の一次抗体を3回洗浄して除去し、3%BSAに溶解させた二次抗体を適切な希釈倍率で添加し、室温かつ遮光条件下で1時間インキュベートします。PBSで未結合の二次抗体を洗浄した後、PBSに溶解した2mLのhext 3, 3, 2, 5 8を用いて、遮光下で5分間細胞核を染色します。

次に、結合しなかった成分をPBSで5回洗浄して細胞から除去します。5回目の洗浄後、マトリックスと細胞の混合物に封入剤を直接加え、基底膜マトリックスと細胞の混合物の完全性が損なわれないよう、注意深くカバーガラスで封入剤を覆います。ディッシュを室温で一晩乾燥させた後、使用した抗体に適切なレーザー波長を用いて、蛍光顕微鏡で画像を取得します。

3Dマトリックスに浸潤するMDA MB 2 3 1細胞が示されています。1日目にマトリックスに埋め込まれた細胞は、3日目までに浸潤性の星状構造を形成し始めました。5日目までには、マトリックスへの完全な浸潤が観察されました。

その後、形成された星状コロニーの数をカウントし、1ディッシュあたりの浸潤性および非浸潤性コロニーの総数に対する割合（%）として算出しました。さらに、5日間にわたり毎日測定を行ったため、これらの免疫蛍光画像から浸潤速度を評価することも可能でした。細胞膜の完全性の喪失および基底膜タンパク質laminin fiveのびまん性局在を示すMDA MB 2 3 1細胞の代表的な浸潤性星状コロニーが示されており、これはMDA MB 2 31乳がん細胞で観察される像とは対照的です。

ラミニン5は、未処理の非悪性MCF 10 A細胞の記憶アシニンを囲む完全な基底膜層に局在していました。この手順の後、ストローマ細胞との共培養を行うことで、微小環境の構築後にがん細胞がストローマ細胞とクロストークを行うかといった追加の疑問を検証することが可能です。この手法は、がん細胞の転移に不可欠ながんの浸潤と遊走を探索する腫瘍学分野の研究者に道を開きました。