C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

C型肝炎ウイルス(HCV)は、肝硬変や癌を含む肝障害を引き起こす主要なヒト病原体です。HCV感染性細胞培養システムは、HCV複製の分子メカニズムを理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。ここでは、HCV複製サイクルのさまざまな段階を調査するためのプロトコルについて説明します。

この手順の全体的な目標は、C型肝炎ウイルスの複製サイクルのさまざまな段階を調査することです。これは、最初にHCVゲノムRNA、つまり直鎖状HCVプラスミドコンストラクトからの転写産物を生成することによって達成されます。2番目のステップは、細胞をH-C-V-R-N-Aでトランスフェクションすることです。

次に、細胞をさまざまな時点およびアッセイのためにプレーティングします。最後のステップは、ウイルスの力価を測定するための細胞培養上清を収集し、トランスフェクションされた細胞をタンパク質とRNAのために回収することです。最終的には、逆転写、PCRウェスタンブロッティング免疫蛍光アッセイ、およびHCV力価が実施され、堅牢なHCV感染性細胞培養システムが実証されます。

この感染性C型肝炎ウイルス細胞培養システムがHCVレプリカントシステムと比較した場合の主な利点は、ウイルスの侵入vionの組み立てと排出のステップを調査できることです。このプロトコルは、Vion、形態形成、宿主病原体の相互作用など、C型肝炎ウイルス学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法は、潜在的なワクチン候補として評価できる弱毒化ウイルス株の特性評価を可能にするため、ワクチン開発にまで及びます。

この方法はC型肝炎ウイルスに関する洞察を提供することができますが、ラボベルデファミリーの他のRNAウイルスにも適用できます。一般に、この方法に不慣れな個人は、高品質のHCVゲノムRNA研究を生成するという課題に直面するでしょう。HCVの完全な複製サイクルは、遺伝子型2 A HCV日本劇症肝炎1分離株の発見に続いて、細胞培養で実行可能になりました。

アッセイには分子技術と細胞技術の両方の専門知識が必要になるため、ウイルス学的アッセイの視覚的なデモンストレーションは重要です 遺伝子内2つのAキメラウイルスを使用して、F-N-X-H-C-VおよびF-N-X-H-C-Vはウイルス複製の評価のためにヌルHCVをポーリングします。以前に生成したウイルスプラスミドを、2ミリリットルチューブ内のXBA One Restriction Enzymeによる消化により直鎖化します。次に、プラスミドを緑豆ヌクレアーゼで処理して、鈍末端を生成します。

消化したプラスミドを陰イオン交換クロマトグラフィーで精製します。DNAをAROSゲル電気泳動にかけることにより、直鎖状プラスミドの完全性を確認します。次に、直鎖状プラスミドDNAテンプレートを、T 7 RNAポリメラーゼ反応成分を含む0.2ミリリットルのチューブに添加して、HCVゲノムRNA転写産物を合成します。

RNA精製キットを使用して、新たに合成されたDNAを処理したRNAを精製します。次に、Agrosゲル電気泳動によりRNA産生を確認します。これに続いて、スペクトル測光法によってRNAを定量します。

トリプシン酵素処理を使用してHUの7ベースの接着細胞を分離し、細胞を50ミリリットルの円錐形に集めます。2つの遠心分離resusに続く。細胞ペレットを冷冷低血清培地で懸濁 遠心分離を繰り返した後、低血清培地に細胞を10〜1ミリリットルあたり7細胞ずつ1回再懸濁します。

次に、合計10マイクログラムの転写ウイルスRNAと400マイクロリットルの再懸濁細胞を事前に冷却した0.4センチメートルのエレクトロポレーション獣医に混合し、270ボルト、100オーム、950マイクロフェレのエレクトロポレーションを使用してウイルスRNAを細胞に送達します。終了したら、この時点でエレクトロポレーション細胞を15%FBSを含む10ミリリットルの全増殖培地に再懸濁し、両方のT25フラスコの細胞をフラスコあたり6個の細胞に約1.2倍10回、48ウェルプレートに1ウェルあたり10個から4番目の細胞で4時間、48時間および96時間の時点でプレートします。トランスフェクション後4〜8時間で培地を10%FBSを含む新鮮な増殖培地と交換し、培養フラスコやプレートから死細胞の破片を取り除きます。

血清学的ピペットを使用して、48 N 96時間時点の細胞培養上清を15ミリリットルの円錐管に回収します。次に、遠心分離後、摂氏4度で10分間、15, 000RPMで遠心分離することにより、収集したサンプルから細胞の破片を除去します。無細胞上清は、マイナス80°Cで保存してください。

ウェスタンブロットおよび逆転写定量PCRまたはR-T-Q-P-C-Rにより、指定された時点でタンパク質およびRNA分析のために細胞を溶解します。逆転写酵素と、0.2ミリリットルのチューブ内の5つの主要な非翻訳領域に結合するHCVセンス鎖の特異的プライマーを使用して、1マイクログラムの全細胞RNAを逆転写します。また、リアルタイムPCRシステムを用いたHCVセンスストランドプライマーを用いて、既知のゲノムコピーのF-N-X-H-C-V-R-N-Aを逆転写します。

得られた転写されたCD NAの50ナノグラムを特異的HCVプライマーとQPCRスーパーミックスを含むDNA結合緑色色素を使用してQPCRを実施します。QPCR を実行するときは、次の条件を使用して、QPCR に続く H-C-V-R-N-A コピー番号を判別します。96時間でトランスフェクションしたウイルスRNAから細胞ライセートを分離します。

SDSを使用したトランスフェクション後のページ。次に、ゲル中の分離されたタンパク質をトランスプロットターボ法によりポリバインジフッ化物膜に移します。PBS中に5%のスキムミルクと0.2%tween 20を含むブロッキング溶液を使用してメンブレンをブロックし、容器に入れます。

メンブレンを一次マウスモノクローナル抗体とS3を1000分の1希釈でインキュベートし、ベータアクチンを5,000分の1希釈で摂氏4度の冷蔵室でインキュベートします。インキュベーション後、ヤギの抗マウス免疫グロブリンGをセイヨウダイザビペルオキシダーゼに結合させて5, 000分の1の希釈で加え、化学発光で検出します。この時点で、メタノールを使用してH-C-V-R-N-Aトランスフェクション細胞を免疫蛍光アッセイのためにマイナス20°Cで30分間固定します。

終了したら、免疫蛍光アッセイブロッキングバッファーでブロッキングした後、細胞をPB S3で洗浄し、ウサギポリクローナル抗NSファイブA一次抗体およびマウスモノクローナル抗DS RNA抗体J 2を1〜200の希釈で使用し、摂氏4度の冷蔵室で5時間から一晩インキュベートします。インキュベーション後、一次抗体の後にPB S3回細胞を洗浄します。次に、ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンG 4 8 8ポリクローナル二次抗体とヤギ抗ミューズ免疫グロブリン5 9 4ポリクローナル二次抗体を1000分の1希釈で添加し、卓上ロッカーで室温で1時間インキュベー

PB Sで細胞を洗浄した後、herx dieを使用して核を染色し、蛍光顕微鏡で観察します。次にナイーブな色相は、ウェルあたり10〜3番目の細胞の約3倍で7.5 0.1細胞。翌日、96ウェルプレートを使用して、増殖培地を使用してH-C-V-R-N-Aトランスフェクション細胞から回収した無細胞培養上清を10倍段階希釈し、色相に3倍接種します。

7.5 0.1細胞 感染後72時間でメタノールを使用してマイナス摂氏20度で30分間細胞を固定します。冷凍庫から細胞を取り出した後、前述の条件でH-C-V-N-S five Aタンパク質を蛍光顕微鏡を使用してアミノ染色します。ウイルス希釈率が最も高いウェル内のNS 5、A陽性細胞病巣を数え、ミリリットルあたりのフォーカス形成単位の平均数を計算します。直鎖状化されたHCVプラスミドの品質は、ゲル電気泳動によって評価されました。

H-C-V-D-N-Aは、in vitro転写を媒介するT seven RNAポリメラーゼに供され、9.6キロベースで単一のRNA産物が得られました。R-T-Q-P-C-Rの結果は、野生型ウイルスがゲノムを効率的に複製することを示しました。野生型は、ポーリングヌルウイルスと比較して、1〜3ログ高いゲノム複製レベルを示しました。

野生型ウイルスは、ウイルスタンパク質の切断とゲノム複製に関与するNS3タンパク質を産生しました。野生型ウイルスはまた、野生型トランスフェクション細胞の細胞質に局在するNSファイブaタンパク質およびNSファイブaタンパク質および二本鎖RNAを発現し、活性ウイルス複製ウイルス力価測定は、野生型ウイルスが感染性であり、トランスフェクション後6時間で感染性粒子のミリリットルあたり10,000を超える病巣形成単位を生成することを示唆している。野生型ウイルスとポールヌルウイルスはどちらも同様のルシフェラーゼ活性を有し、トランスフェクションのインプットレベルが類似していた。

しかし、RNAはトランスフェクション後48時間および96時間後に翻訳されていました。野生型ウイルスは、ポーリングヌルウイルスと比較してゲノム複製レベルの増加を示しました。野生型ウイルスは、ウイルスNS 3タンパク質も産生しました。

ポーリングヌルウイルスは基本レベルのルシフェラーゼ活性を持っていましたが、野生型ウイルスはポーリングヌルレポーターウイルスと比較して2〜3ログ高い複製レベルを持っていました。一度習得すると、肝炎TCウイルス学的アッセイは、適切に実施されれば2週間で行うことができます この手順を試みる際には、堅牢な細胞と高品質のHCVゲノムRNA転写産物を持つことが重要です。この手順に続いて、HCV株の特性評価を動物モデルシステムで試験し、in vivo適応度と宿主病原体の相互作用を調査できます。

感染性HCV細胞培養システムの開発は、研究者がHCV複製サイクルのビリオン、形態形成、およびウイルス排出ステップを探求する道を開きました。このビデオを見れば、C型肝炎ウイルスの複製サイクルのさまざまな段階を特徴付けるためのさまざまなウイルス学的アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。C型肝炎ウイルスの取り扱いは非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは、適切な個人用保護具を着用するなどの安全予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。