Name: C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 4 s
Description: 学ぶC型肝炎ウイルス複製サイクルの解析法。プラスミドからHCVゲノムRNAを合成し、細胞にトランスフェクションして感染性細胞培養系を構築する。RT-PCR、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法を用いてウイルス複製を定量的に評価できる。

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Huh-7.5.1細胞株を提供してくださったF. Chisari氏に感謝します。原稿の編集にご協力いただいたJustine Ho氏に感謝いたします。この研究は、Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research AwardおよびNational Center for Advancing Translational Sciences、V.A.への助成金UL1TR000124によって支援されました。

プロトコルの概要を図1に示されている。 1。細胞<ol><li> 10〜15％ウシ胎児血清（FBS）、10 mMの非必​​須アミノ酸、10mMのHepes、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を、および2mM L-グルタミンを含有する完全増殖培地を調製する。 </li><li> C型肝炎ウイルスの複製サイクルのインビトロ分析のための上記のサプリメントを含む完全な増殖培地中でホ- 7.5.1細胞の13を維持する。 </li><li> 5％のCO 2、37℃で指定された補足の増殖培地とホ- 7.5.1細胞で培養したウイルス株。 </li></ol> 2ウイルスやプラスミド構築<ol><li> HCV RNAの相補DNA（cDNA）の形態を生成し、遺伝子操作を容易にするためのプラスミドベクターにクローニングする。注：日本の劇症肝炎1の発見は、JFH-1（遺伝子型2aのHCV）、HCVの研究のための批判的とされている単離主にHCVの複製サイクル11から13を研究するために使用。 JFH-1のHCVに基づく間およびintragenotypicキメラウイルスは、一般的に、研究14〜18で使用されています。合成intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびモノシストロンキメラレポーター株の構築は、19と建設の詳細は、このプロトコルの範囲を超えて先に説明した。 </li><li>それは（ヌクレオチド1から2878）J6CF親株（NCBIアクセッション番号AF177036）の、よう5&#39;NTR、構造領域とP7とNS2非構造領域の一部が含まれてpFNX抗HCV intragenotype 2aのウイルスを使用して、よくJFH-1ウイルス株（NCBIアクセッション番号AB047639）の非構造部材として。注：FNX-HCVは、以前に報告された15 Jc1にintragenotype 2aのキメラHCVの配列に基づいて合成した。 </li><li> Rを挿入することで（ステップ2.2以上）pFNX-HCV株に基づいて、モノシストロニックキメラレポーターウイルス構築、pFNX-Rlucをを生成（NT 388と389の間）5 &#39;NTRとコア遺伝子との間enillaルシフェラーゼ遺伝子。続いて、切断シグナルとして働くだろう口蹄疫ウイルス2A（F2A）ペプチド配列を用いて、ルシフェラーゼ遺伝子およびその構築物のコア遺伝子を接続する。 </li><li> pFNX-HCVまたはpFNX-Rlucをウイルス背景のいずれかを使用して、RNAポリメラーゼ-ヌル（ポル·）ウイルス構築エンジニア。 、AAGのアミノ酸残基とこれらのウイルスの主鎖のいずれかの、NS5Bポリメラーゼ触媒残基、GDD（8615から8623をntのAA 2759年から2761年）を交換します。 </li></ol> 3 インビトロのHCV RNA転写<ol><li> intragenotype 2aのキメラウイルスFNX-HCVおよびFNX-HCVルポールヌルウイルス複製（ 図2A）の評価のための（ポル·）は、HCVを使用してください。 </li><li> XbaI制限酵素でウイルスプラスミドを直線化して、平滑末端を生成するために、緑豆ヌクレアーゼで処理する。陰イオン交換クロマトグラフィーによって消化プラスミドを精製する。 oを整合性を検証fは、ゲル電気泳動（ 図2B）をアガロースにDNAを施すことにより、プラスミドを線状化。 </li><li> T7-RNAポリメラーゼを用いて線形化されたウイルスのプラスミドを転写。 </li><li> RNA精製キットを用いて新たに合成されたDNase処理RNAを精製する。 </li><li>アガロースゲル電気泳動（ 図2C）により、RNAの生産を確認してください。 </li><li>分光測光法によりRNAを定量化する。 </li><li> 10μgの作業アリコートで-80℃で生成したRNAを保管してください。注：同じ時に各ウイルスのサンプルおよびコントロールのためのすべてのRNAを転写することにより、各実験計画の中にRNAの品質のばらつきを最小限に抑えます。 </li></ol> 4。のHCV RNAのトランスフェクションおよび検体採取<ol><li>トリプシンを用いたHuh-7.5.1細胞を採取する。 </li><li>細胞、遠心分離機をすすぎ、冷たい低血清培地で二回、サスペンションを再懸濁し。 ml当たり1×10 7個の細胞で低血清培地で細胞を再懸濁します。 </li><li> 10＆＃合計を混ぜる956; 0.4 cmのエレクトロポレーションキュベット中に再懸濁細胞（4×10 6細胞）を400μlの転写されたウイルスRNAのG。 、270 Vでエレクトロポレーションを介して細胞をトランスフェクト100Ω、および950μF。 </li><li> 15％FBSと10ミリリットル完全増殖培地中でエレクトロポレーションした細胞を再懸濁。注：許-7.5.1細胞は15％ウシ胎児血清中で培養したときにエレクトロポレーションした細胞生存性の増大が見られる。 </li><li> 4、48及び96時間：両方のT-25フラスコ（フラスコあたり〜1.2×10 6細胞）を、48ウェルプレートに以下の時点の各々について（ウェル当たり1×10 4細胞）で細胞をプレート。 </li><li>培養されたフラスコおよびプレートから死細胞破片を除去し、10％FBSを新鮮な増補増殖培地で4-8時間のトランスフェクション後にメディアを交換してください。 </li><li>収穫細胞培養上清48、96時間の時点で、4℃で10分間、1500rpmで細胞を遠心分離によって収集したサンプルから細胞破片を除去 ºCの</li><li> -80ºCで無細胞上清を保存する溶解ウエスタンブロットによるタンパク質およびRNA分析のために、示された時点で転写定量的PCRリバース細胞。 </li></ol> 5。HCVゲノムコピーを評価するための転写定量PCR（RT-qPCRの）をリバース<ol><li> HCVゲノムRNAコピー数を決定するために、ツーステップRT-定量PCRを行う。 </li><li>またはハウスキーピング遺伝子のペプチジルイソメラーゼG（PPIG R特異的なプライマー：逆、逆転写酵素と5&#39;NTR（5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;JFH RTQ R）に結合し、HCVのセンス鎖特異的なプライマーを用いて、全細胞RNAの1μgのを転写：5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;）。また、HCVのセンス鎖プライマーを用いて、既知のゲノムコピー（1月 10 日から9月 10 日までの標準）の（ステップ3で生成された）FNX-HCV RNAを逆転写。 </li><li> （HCV JFH RT特異プライマーを用いて得られた転写されたcDNA 50ngのを用いて定量PCRを行うことQF：5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R：5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;）およびDNAの定量PCRスーパーミックスを含むグリーン色素を結合。だけでなく、ハウスキーピング遺伝子PPIGための定量PCRを行う（プライマーPPIG F：5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;; PPIG R：5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;）注：サンプル間で正確な細胞内のHCV RNA量を計算するため、細胞のハウスキーピング遺伝子、PPIGを使用正規化のため、発現量（Ctの周期）。コピー数の決定のための標準としてFNX-HCVゲノムのコピー数を使用してください。 </li><li> 15秒95ºCと60：のHCV RNAコピー数を決定するために、定量PCRを実行するときに、以下の条件を使用してください&#160;リアルタイムPCRシステムを用いて30秒（40サイクル）ºC。 </li><li>ゲノム複製の結果を得るために、図3Aと図3Bを参照してください。 </li></ol> 6。ウェスタンブロッティング分析HCVタンパク質の発現（図3C）を検出する<ol><li>細胞溶解物のFRを使用して、OMウイルスRNAは、タンパク質ウェスタンブロッティング解析のための96時間後、トランスフェクションでトランスフェクトした。 </li><li> SDS-PAGE及びポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜に転写を用いて細胞溶解物を解決する。 </li><li> 5％スキムミルク、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.2％Tween 20を含むブロッキング溶液を用いて膜をブロックする。 </li><li>一次マウスモノクローナル抗体のNS3（1千倍希釈）およびβ-アクチン（1 5000倍希釈）を有する膜をインキュベートする。 </li><li>西洋ワサビペルオキシダーゼ（1 5000倍希釈）に結合したヤギ抗マウスIgGを加え、化学発光によって検出します。 </li></ol> 7。免疫蛍光アッセイ（IFA） <ol><li>免疫蛍光アッセイのため-20℃で30分間メタノールを使用してHCV感染およびトランスフェクトされた細胞を固定します。 </li><li> PBSで三回細胞を洗浄し、IFAはブロッキング緩衝液でブロックする。 </li><li>ウサギポリクローナル抗NS5Aは、主に抗体（親切に博士ダスグプタ、UCLAによって提供される）またはマウスモノクローナル抗DSR使用NA抗体1:200（1μg/ ml）を希釈でJ2と5時間に一晩4でインキュベート ºCの</li><li> 3回の一次抗体の後、PBSで細胞を洗浄。 </li><li>ヤギ抗ウサギIgG-488ポリクローナル二次抗体または1:1,000希釈（1μg/ ml）を少なくともヤギ抗マウスIgG-594ポリクローナル二次抗体を添加し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>蛍光顕微鏡（ 図3D）を使用して、ヘキスト染料とビューを用いてPBS 3回染色核で細胞を洗浄。 </li></ol> 8。測定ウイルス力価<ol><li>プレートナイーブホ-7.5.1細胞を、約3×10 3細胞/ウェルで96ウェルプレートを用いて。翌日、増殖培地を用いて、HCVのRNAトランスフェクトした細胞から採取し、無細胞培養上清の10倍段階希釈を実施したHuh-7.5.1細胞の上に三重で接種する。 </li><li> -20℃で30分間、メタノールを（使用して72時間の感染後、細胞を固定</suC）およびセクション7で述べたようなHCV NS5Aタンパク質のための免疫染色ºP&gt;。 </li><li> NS5A陽性病巣のためにカウントしミリリットル当たり焦点形成単位の平均数（FFU）を計算するために最高希釈を使用しています。 HCV力価については、図4を参照してください。 </li></ol>ウイルスゲノム複製および感染のため9。 ウミルシフェラーゼレポーターアッセイ<ol><li>ウイルスゲノムの複製、48ウェルプレート中で三連でプレートHCVのRNA電気穿孔たHuh-7.5.1細胞（1×10 4細胞/ウェル）を評価する。 </li><li>溶解6時間での受動溶解緩衝液75μlを、48時間、および96時間後にトランスフェクションした細胞。 </li><li> -80ºCで室温店で15分間穏やかプレートを揺する</li><li> ウミシイタケルシフェラーゼ酵素活性を測定するために、室温にタンパク質溶解物およびウミシイタケルシフェラーゼアッセイ試薬を解凍する。 </li><li> 96-WELウェル当たりタンパク質溶解液20μlを追加<html> Lホワイト発光プレートルミノメーターでプレートを置き。 </li><li>ウェルあたり2秒先読み遅延の後にウミルシフェラーゼアッセイ試薬（セレンテラジン基質+バッファ）の100μLを分注する。 10秒間照射された光を統合する。 </li><li>生物学的な三連のルシフェラーゼ値から、各試料の平均値と標準偏差を計算し、統計的分析（ 図5）にデータを供する。 </li><li>感染性を評価するため、48ウェルプレートにナイーブホ - 7.5.1細胞の上に三重に指示された時点（48時間および96時間）のためのHCV RNAトランスフェクトした細胞から得られた無細胞上清500μlを接種。 </li><li> 6時間後に感染した後、ウェルあたりの新鮮な培地500μlのウイルス接種を交換してください。 </li><li>溶解ウミシイタケルシフェラーゼアッセイと48時間後に感染し、対象の細胞のステップ8.2から8.7（ 図5）で説明したように。 </li></ol>イトルを記入 &quot;&gt; 10。統計解析<ol><li>グラフ中のエラーバーは標準偏差（SD）を示す。 P値は、対応のないt検定により計算した。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

この図は、C型肝炎ウイルス複製サイクルを分析するための方法を記載している。 HCVはヒトの病原体であり、所定の生物学的安全性プロトコルは、必ず守っていただきます。感染性HCV細胞培養系は、以前に11-13,16,17記載されている。示されたプロトコルを以下のときに我々が実装し、いくつかの重要なポイントがあります。まず、下流の研究のために無傷の完全長ウイルスゲノムRNAの良好な品質を有することが非常に重要である。ウイルスcDNAを運んで入力プラスミドを直線化し、慎重に平滑化する必要があります。のXba Iオーバーハングを鈍らするために採用緑豆ヌクレアーゼは、非特異的なヌクレアーゼで、長時間のインキュベーションは、ウイルスゲノムの3 &#39;末端の損傷や劣化が発生します。ヌクレアーゼは、フェノール - クロロホルム抽出、または陰イオン交換カラム精製によって指定された30分間のインキュベーションの直後に除去されなければならない。ヌクレアーゼ処理したDNAのゲル抽出のように、推奨されない場合があります酵素は、ゲル電気泳動プロセスの間アクティブである。 <p class="jove_content...

C型肝炎ウイルス（HCV）は、肝硬変および肝臓癌を引き起こす。それは35万人が毎年1-3死んで全世界1.7億人々に影響を与えます。 HCVは、9.6kbのゲノムサイズを有するプラス鎖RNAウイルスである。 HCVゲノムは、タンパク質分解的に10ポリペプチドに様々な細胞およびウイルスのプロテアーゼによって切断され〜3,000アミノ酸残基の単一ポリタンパク質として翻訳される。 HCVはヘパシウイルス属に原型ウイルスで、 フラビウイルス科 4に属しています。暴露されると、HCVは、個人の80％に慢性感染を確立します。感染は、診断が肝劣化を防止する治療的介入を可能にすることができる主に無症候性かつタイムリーである。現在の治療は、部分最適で、ワクチンは5,6ありません。 C型肝炎の病因は1989年7に記載した。HCVの複製を研究するC型肝炎ワクチンおよび治療 ​​の研究のために重要であるが、それがあった長い効率的なウイルス培養系の欠如によって妨げ。 HCVの分子クローンは、肝内接種8時チンパンジーにおける感染であることが示された。続いて、HCVサブゲノムレプリコンは、細胞培養系9,10におけるウイルスゲノムの複製段階を分析させ、これについて説明した。遺伝子型2aのHCVの発見は、JFH-1（日本劇症肝炎-1）を単離、細胞培養に感染することができる、HCV複製の研究11月13日のための新たな道を開いた。感染培養系をベース遺伝子型2a株JFH-1ベース間および内遺伝子型キメラウイルス遺伝子型1のHCVにも14〜18用意されています。 我々が正常タンパク質ドメインおよびシス作用RNAエレメント19,20の高分解能機能プロファイリングマップを得るために、JFH-1株およびHCV intragenotype 2aのキメラウイルスを使用している。これによれば、ここでは慣用的に使用可能にする効果的な培養システムを記載HCVの複製サイクルと宿主 - 病原体相互作用の様々な段階を研究。私たちは、ウイルスゲノムの複製とintragenotype 2aはHCVおよびウミシイタケルシフェラーゼに基づくレポーターHCVの新規の感染性を評価するために、ウイルス学的ア ​​ッセイを提示する。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」Fisher</td> <td>Scientific</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>Huh-7.5.1</td><td>スクリプス研究所</td><td></td><td>細胞株は、フランシス・チサリ博士からアルムガスワミ博士に提供され、スクリプス研究所とシダーズ・サイナイ医療センター・</td></tr><tr><td>プラスミド(pFNX-HCV、pFNX-HCV Pol null、pFNX-Rluc、pFNX-Rluc Pol null)</td>の間で実施されました。<td>シダーズ・サイナイ医療センター</td><td></td><td>HCVプラスミドは、アルムガスワミ博士によってオーバーラップするオリゴヌクレオチドを用いて合成されました。</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>ニューイングランドバイオラボ株式会社</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>緑豆ヌクレアーゼ</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RiboMAX Express 大規模 RNA 生産システム</td><td>Promega</td><td>P1320</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nanodrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット (4 mm)</td><td>Bioexpress</td><td>E-5010-4</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Total System</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2660</td><td></td></tr><tr><td>マウスモノクローナル抗dsRNA抗体J2&nbsp;</td><td>日本語 &サイエンティフィックコンサルティングKft.</td><td></td><td></td>10010200</tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG アレクサ フルーア 488</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11008</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG アレクサフロー 594</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11020</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレンパッケージ</td><td>バイオ・ラッド</td><td>162-0263</td><td></td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロッカー ノンファット ドライミルク</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-6404XTU</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-6531XTU</td><td></td></tr><tr><td>抗 C 型肝炎ウイルス NS3 抗体 [8 G-2]</td><td>Abcam</td><td>ab65407</td><td></td></tr><tr><td>抗 C 型肝炎ウイルス NS3 抗体 [H23]</td><td>Abcam</td><td>ab13830</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG と西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) を結合&nbsp;</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>115-035-003</td><td></td></tr><tr><td>アマシャムECLプライムウェスタンブロッティング検出試薬&nbsp;</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>RPN2236</td><td></td></tr><tr><td>SUPERSCRIPT III RT&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>18080085</td><td></td></tr><tr><td>SYBR QPCR SUPERMIX ROX 付き</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td></td> 11744500 <td></td></tr><tr><td>ViiA 7 リアルタイム PCR システム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ NA</td><td></td></tr><tr><td>レニラ ルシフェラーゼアッセイ システムキット</td><td>プロメガ</td><td>E2810</td><td></td></tr><tr><td>RNase-フリー DNase</td><td>プロメガ</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>GloMax-マルチ検出システム (ルミノメーター)</td><td>プロメガ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

c型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

C型肝炎ウイルス（HCV）は、世界の人口の3％に影響を及ぼし、慢性肝炎、肝硬変、および肝細胞癌を含む重篤な肝疾患を引き起こす。 HCVは、 フラビウイルス科に属するエンベロープRNAウイルスである。現在の治療は、十分に有効ではなく、有害な副作用を引き起こす。利用可能なHCVワクチンはありません。このように、継続的な努力は、ワクチン、より良い治療法を開発するために必要です。 HCV細胞培養系は、ウイルスの侵入、ゲノム複製、パッケージング、および出口を含むHCV増殖の様々な段階を研究するために重要である。提示現在の手順では、野生型intragenotype 2aのキメラウイルス、FNX-HCV、およびウイルス複製を研究するために、 ウミシイタケルシフェラーゼレポーター遺伝子を担持する組換えFNX-Rlucをウイルスを使用した。ヒト肝癌細胞株（ホ-7ベースの） インビトロでのトランスフェクションのために使用したのHCVゲノムRNAを転写した。無細胞培養上清を、タンパク質溶解物およびtotal RNAは、HCVの増殖を評価するために、トランスフェクション後様々な時点で採取した。 HCVゲノムの複製の状態は、定量的RT-PCRおよびHCVの存在を可視化する二本鎖RNAにより評価した。 HCVタンパク質の発現は、HCV NS3およびNS5Aタンパク質に特異的な抗体を用いてウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによって確認した。培養上清およびウイルス力価に感染性HCV粒子を放出するRNAトランスフェクトされた細胞を測定した。ルシフェラーゼレポーターアッセイはHCVの複製レベルと感染性を評価するために利用した。結論として、我々は、HCVの複製サイクルの異なる段階を特徴付けるための種々のウイルス学的アッセイ法を提示する。

C型肝炎ウイルスはRNAウイルスである。このように遺伝子操作の目的のために、HCVゲノムcDNAを、細菌プラスミドベクターにクローニングされている。 T7 RNAポリメラーゼプロモーター配列は、HCVゲノムの5 &#39;末端の直前に導入した。 HCV分析ワークフローの概要を図1に示す。正確な3 &#39;末端とHCVゲノムRNAを生成するために、プラスミドを含むHCVゲノムは、XbaI制限酵素で切断され生成した一本鎖オーバーハングは、マングビーンヌクレアーゼ消化で平滑化した。線形化されたHCVプラスミドの品質は、アガロースゲル電気泳動（ 図2B）により評価した。 HCV DNAは、インビトロ転写により媒介されるT7 RNAポリメラーゼを施し、得られたRNAは、9.6キロベース（ 図2C）で単一の生成物を得た。 我々はintragenotype 2aは、HCV（ 図の成長速度をテスト60、3）。許-7.5.1細...

C型肝炎ウイルス(HCV)は、肝硬変や癌を含む肝障害を引き起こす主要なヒト病原体です。HCV感染性細胞培養システムは、HCV複製の分子メカニズムを理解し、新しい治療法を開発するために不可欠です。ここでは、HCV複製サイクルのさまざまな段階を調査するためのプロトコルについて説明します。

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

本手順の全般的な目的は、C型肝炎ウイルス（HCV）の複製サイクルのさまざまな段階を調査することです。まず、線状化したHCVプラスミド構築物からHCVゲノムRNA転写物を生成します。次に、細胞にH-C-V-R-N-Aをトランスフェクションします。その後、さまざまなタイムポイントとアッセイに合わせて細胞を播種します。最終ステップとして、ウイルス価を測定するために細胞培養上清を回収し、タンパク質およびRNAのためにトランスフェクションした細胞を回収します。最終的に、逆転写PCR、ウェスタンブロッティング、免疫蛍光アッセイ、およびHCVタイターを行い、堅牢なHCV感染細胞培養システムであることを実証します。この感染性C型肝炎ウイルス（HCV）細胞培養システムの、HCVレプリコンシステムに対する主な利点は、ウイルスの進入、ビリオンの構築、および放出の過程を解析できる点にあります。本プロトコールは、ビリオンの形態形成や宿主と病原体の相互作用など、C型肝炎ウイルス学における重要な課題の解決に寄与します。また、本手法は、ワクチン候補として評価可能な弱毒化ウイルス株の特性解析を可能にするため、ワクチン開発への応用が期待されます。この手法はC型肝炎ウイルスに関する知見を提供しますが、Flaviviridae科に属する他のRNAウイルスにも適用可能です。一般的に、この手法を初めて行う方は、高品質なHCVゲノムRNAを調製するという課題に直面します。ジェノタイプ2AのHCV日本劇症肝炎1分離株の発見により、細胞培養においてHCVの完全な複製サイクルの研究が可能になりました。このアッセイでは分子生物学的および細胞生物学的手法の両方の専門知識が必要となるため、ウイルス学的アッセイを視覚的に実演することが極めて重要です。ウイルス複製を評価するために、遺伝子型内2AキメラウイルスF-N-X-H-C-Vおよびpol-null HCVを用い、2 mLチューブ内でXBA-one制限酵素を用いて既作製のウイルスプラスミドを線状化します。その後、プラスミドをムング豆ヌクレアーゼで処理し、平滑末端を生成します。アニオン交換クロマトグラフィーにより、消化後のプラスミドを精製します。アガロースゲル電気泳動により、線状化プラスミドの完全性を確認します。次に、HCVゲノムRNA転写物を合成するため、T-seven RNAポリメラーゼ反応成分を含む0.2 milliliterチューブに、線状化プラスミドDNAテンプレートを加えます。RNA精製キットを用いて、新たに合成しDNase処理を施したRNAを精製します。次に、アガロースゲル電気泳動によりRNAの生成を確認します。その後、分光光度法を用いてRNAを定量します。トリプシン酵素処理を用いてHuh-7由来の接着細胞を剥離し、50 mLコニカルチューブに回収します。その後、2回の遠心分離を行い、細胞ペレットを冷たい低血清培地で再懸濁します。再度遠心分離を繰り返した後、細胞を1 × 10⁷ cells/mLの密度で低血清培地に再懸濁します。次に、転写されたウイルスRNA合計10 µgと、再懸濁した細胞400 µLを、あらかじめ冷却した0.4 cmエレクトロポレーションキュベットに混合します。270 V、100 Ω、950 µFのエレクトロポレーション条件下で、ウイルスRNAを細胞内に導入します。完了後、エレクトロポレーション後の細胞を15% FBSを含む完全増殖培地10 mLで再懸濁します。この時点で、細胞をT 25フラスコ（1フラスコあたり約1.2 × 10⁶ cells）および48ウェルプレート（1ウェルあたり1 × 10⁴ cells）に播種し、4時間、48時間、96時間のタイムポイントで準備します。トランスフェクションの4〜8時間後に、培地を10% FBSを含む新鮮な補充増殖培地に交換し、培養フラスコおよびプレートから死細胞の残骸を除去します。セロロジカルピペットを用いて、48時間後および96時間後の時点で細胞培養上清を15 mLコニカルチューブに回収します。次に、回収したサンプルを4°C、15,000 rpmで10分間遠心分離し、細胞残渣を除去します。遠心分離後、細胞除去後の上清を-80°Cで保存します。指定したタイムポイントで、ウェスタンブロットおよび逆転写定量PCR（RT-qPCR）によるタンパク質およびRNA解析のために細胞を溶解します。0.2 mLチューブ内で、逆転写酵素と5'非翻訳領域に結合するHCVセンス鎖特異的プライマーを用いて、1 µgの全細胞RNAを逆転写します。また、既知のゲノムコピー数のF-N-X-H-C-V-R-N-Aを、HCVセンス鎖プライマーを用いて同様に逆転写します。リアルタイムPCRシステムを用い、得られたcDNA 50 ng、HCV特異的プライマー、およびDNA結合グリーン色素含有qPCRスーパーミックスを使用してqPCRを行います。H-C-V-R-N-Aコピー数を決定するためのqPCR実行時には、以下の条件を使用してください。qPCR後、ウイルスRNAを導入した96時間後の細胞溶解液をSDS-PAGEで分離します。次に、ゲル内で分離したタンパク質を、Trans-Blot Turbo法によりポリビニリデンフルオリド（PVDF）膜に転写します。5%脱脂粉乳と0.2%Tween-20を含むPBSブロッキング溶液を用いて膜をブロッキングし、容器内に静置します。4°Cの低温室にて、1/1000に希釈したマウス抗NS3モノクローナル一次抗体および1/5,000に希釈したβ-actin一次抗体でメンブレンをインキュベートします。インキュベーション後、1/5,000に希釈した西洋ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス免疫グロブリンG（IgG）を加え、化学発光により検出します。この時点で、免疫蛍光染色のために、H-C-V-R-N-Aをトランスフェクションした細胞をメタノールを用い-20 °Cで30分間固定します。固定後、細胞をPBSで3回洗浄します。免疫蛍光染色用ブロッキングバッファーでブロッキングした後、ウサギポリクローナルanti-NS5A一次抗体とマウスモノクローナルanti-DSRNA抗体J2を1:200に希釈して加え、4 °Cの低温室で5時間から一晩インキュベートします。一次抗体のインキュベーション後、細胞をPBSで3回洗浄します。次に、ヤギanti-rabbit immunoglobulin-G 488ポリクローナル二次抗体とヤギanti-mouse immunoglobulin 594ポリクローナル二次抗体を1:1000に希釈して加え、室温のテーブルトップロッカー上で1時間インキュベートします。細胞をPBSで3回洗浄した後、Hoechst染料を用いて核を染色し、蛍光顕微鏡で観察します。次に、96ウェルプレートを用い、1ウェルあたり約3×10³個の未感染Huh7.5.1細胞を播種します。翌日、増殖培地を用いて、HCV RNAをトランスフェクションした細胞から回収した無細胞培養上清を10倍段階希釈し、Huh7.5.1細胞に3ウェルずつ接種します。感染から72時間後、-20°Cで30分間メタノールを用いて細胞を固定します。フリーザーから細胞を取り出した後、前述の条件に従い、HCV NS5Aタンパク質を免疫染色します。蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス希釈倍率が最も高いウェルのNS5A陽性細胞フォーカス数をカウントし、1mLあたりの平均フォーカス形成単位（FFU）数を算出します。線状化したHCVプラスミドの品質をゲル電気泳動により評価した。H-C-V-D-N-AをT7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写に供したところ、9.6 Kilobasesの単一のRNA産物が得られた。RT-qPCRの結果から、野生型ウイルスはゲノムを効率的に複製することが示された。野生型は、pol-nullウイルスと比較して、ゲノム複製のレベルが1〜3 log高いことを示した。野生型ウイルスは、ウイルス蛋白質の切断およびゲノム複製に関与するNS3蛋白質を産生しました。また、野生型ウイルスはNS5A蛋白質を発現し、野生型を transfection した細胞の細胞質においてNS5A蛋白質と二本鎖RNAが共局在したことから、ウイルス複製が活性化していることが示唆されました。ウイルスタイターの測定により、野生型ウイルスは感染性を持ち、感染性粒子1 mLあたり10,000個以上の foci forming units を産生することが示されました。transfection の6時間後には、野生型ウイルスと pol-null ウイルスの両方で同様のルシフェラーゼ活性が認められ、transfection されたRNAの導入レベルが同等であり、翻訳されたことが示されました。しかし、transfection の48時間後および96時間後には、野生型ウイルスは pol-null ウイルスと比較してゲノム複製レベルの上昇を示しました。また、野生型ウイルスはウイルスNS3蛋白質を産生しました。pol-null ウイルスは基底レベルのルシフェラーゼ活性を示したのに対し、野生型ウイルスは pol-null レポーターウイルスと比較して2〜3 log高い複製レベルを示しました。C型肝炎ウイルスのウイルス学的アッセイは、習熟し適切に実施すれば2週間で完了させることができます。本手順を行う際は、頑健な細胞と高品質なHCVゲノムRNA転写産物を用いることが重要です。本手順に従い、特性解析されたHCV株を動物モデルシステムで検証することで、in vivo での適応度や宿主と病原体の相互作用を調査することが可能です。感染性HCV細胞培養システムの開発により、研究者はHCV複製サイクルのビリオン形態形成およびウイルス放出のステップを探索することが可能になりました。このビデオを視聴することで、C型肝炎ウイルス複製サイクルのさまざまな段階を特性評価するための、さまざまなウイルス学的アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。C型肝炎ウイルスの取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用などの安全対策を常に講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、条件は、次の2つの方法について説明します。...

HCVの制限要因を発見するヘテロカリオンの形成の2つの方法

Source: Allaire, A., et al. Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus. J. Vis. Exp. (2015).The video demonstrates the procedure for preparing cells to assess the intracellular uptake and activity of an antiviral agent against the hepatitis C virus.

Preparing Cells to Analyze Intracellular Uptake and Activity of an Antiviral Agent

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates the procedure for quantifying Hepatitis C viral RNA using quantitative reverse transcription PCR to measure viral load in infected cell cultures.

Measuring Hepatitis C Viral Load Using Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Source: Ren, S., et al. A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication. J. Vis. Exp. (2014).This video demonstrates an immunofluorescence-based method to detect Hepatitis C virus replication in infected hepatoma cells. The protocol involves cell fixation, antibody staining for viral protein and double-stranded RNA, and visualization using fluorophore-tagged secondary antibodies. Dual signal detection under a fluorescence microscope confirms active viral replication within the host cells.

Immunofluorescence Assay to Detect Hepatitis C Virus Replication Complexes in Infected Cells

このビデオでは、抗ウイルス化合物をスクリーニングするためのウイルス付着アッセイを実演しています。遺伝子組み換えC型肝炎ウイルスとルシフェラーゼを用いて、ウイルス単独のウェルと比較して、共治療したウェルの光強度が低いことからわかるように、ウイルス付着に対する阻害効果を評価します。...

抗ウイルス化合物のスクリーニングのためのウイルス付着アッセイ

このビデオは、ウイルスが宿主細胞に侵入し、エンドソームと融合する特定のステップを標的とする抗ウイルス剤を評価するためのアッセイを示しています。細胞を低温でインキュベートした後、HCVに感染させます。低温は宿主細胞へのウイルスの結合を可能にしますが、エンドサイトーシスによる内在化を阻害します。試験用抗ウイルス化合物を添加し、細胞を生理的温度でインキュベートします。この高温へのシフトにより、ウイルスの侵入が容易になり、エンドソームとのウイルスエンベロープ融合に対する試験化合物の影響を評価できます。...

宿主細胞へのウイルス侵入と融合に対する被験化合物の影響を評価するためのアッセイ

ここでは、HBVのライフサイクルの初期段階をモニターするために新たに開発されたB型肝炎ウイルス（HBV）レポーター系を記載します。 インビトロ系簡略化これは、高スループットの戦略を用いて、抗HBV薬のスクリーニングに役立ちます。...

複製サイクルの初期段階を監視するためにB型肝炎ウイルスのレポーターシステムの開発

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

我々 はここで B 型肝炎ウイルス感染システムを介して HBV DNA の体外生成を記述して、逆行列を用いて、(1-2 コピー) 統合の高感度検出に PCR...

低コピーの検出数は B 型肝炎感染培養によって形成された統合ウイルス DNA

このプロトコルの目標は、B 型肝炎ウイルスと 3-D「肝臓-オン-チップ」感染実験を実行するステップ バイ ステップ...

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10...

ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

学ぶC型肝炎ウイルス複製サイクルの解析法。プラスミドからHCVゲノムRNAを合成し、細胞にトランスフェクションして感染性細胞培養系を構築する。RT-PCR、ウエスタンブロッティング、免疫蛍光法を用いてウイルス複製を定量的に評価できる。

C型肝炎ウイルスの複製を分析するためのプロトコル

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