Name: 初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: 学ぶ肝臓-オン-チップ技術を用いたB型肝炎ウイルス感染実験法。初代肝細胞とクッパー細胞を用いて生理学的マイクロ環境を再現し、長期的な感染動態とウイルス複製メカニズムを研究する。

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この作品は、CN バイオ技術革新、欧州研究会議 (637304)、Wellcome の信頼賞 (104771/Z/14/Z) からスターターの補助金によって賄われていた。

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PHH の長期的な文化を維持する上での課題は機能の向上と長寿、差分の長所と短所を示す各いくつかの培養モデルの開発を追い出しました。それは今広く認められる PHH の静的 2D 文化が時間の非常に限られた量の肝細胞生物学の特定の側面が模倣されます。したがって、マイクロパターニングゲル cocultures12,13, 回転楕円体文化14,153 D チップ上の肝臓文化16,17は急速にこれらのもっと基本的なシステムを交換します。生理学的な環境を提供するための要件が養殖人間熱帯の頻繁に挑戦的な性質により支えられていますがキノコアリにおける特定の微小を活用する彼らのホストである感染症を勉強して場合は特にC 型肝炎ウイルス、b 型肝炎、マラリアなどの感染症。
3 D の肝臓オンチップ文化を実行する最も重要なステップは、最初に供給された一次電池型の品質です。これらの細胞の遵守能力を試される、成功組織形成と文化の世代を確保するために plateable PHH たくさんのみを使用する必要があります。新鮮単離 PHH を使用ことができます、にもかかわらず、凍結保存は通常複雑であり特別なレート制御の冷凍機が必要です。
従来の静的 2D 文化と対照をなしてホストの遺伝的背景は HBV 感染の感受性に関して無視しすべてここまでテストされた肝細胞ドナーが b 型肝炎ウイルス感染4を確立すること。
にもかかわらず、患者由来 b 型肝炎ウイルスは、3 D 文化の感染を確立、PEG 沈殿を活用することが不可欠だし、ショ糖クッション精製 HBV ウイルス接種の世代線誘導性 HBV プロデューサー セルを使用するたびに。3 D チップ上の肝臓文化のいずれかを介して抑制的な要因または存在の成長因子、肝細胞との互換性がないのための存在に直接適用される細胞培養上清は、感染症で容易に起因しません。また、患者由来のウイルス接種を選択すると、血清のみを使用するのでプラズマは必然的に凝固して文化のプラットフォームのマイクロ流体循環の下駄します。
使用ウイルス菌に関係なく初期の b 型肝炎接種菌の完全な除去を保障し同様、細胞と分化、確保成功した長期的な感染症研究鍵です。これを行う最も便利な方法は、培養期間中のひと血清アルブミン レベルの測定し同様、接種ウイルスの除去に続いて文化をサンプリングです。ノートでは、すべての他の記載されているプラットフォーム、HBV 感染と同様の確立されると、容易に広がっていない、感染していない細胞。この基になるメカニズムは、HBV 感染生体内で容易に感染、肝臓内の肝細胞の大半以来とらえどころのないまま。
PHH とクッパー細胞の共培養系、に関して、すべて市販クッパー細胞の提供者と同じ応答を持っているので、LPS 刺激による、IL6 と tnf α の分泌を評価するクッパー細胞の多くのテストを実行することをお勧めします。
重要なは、すべて薬物治療または HBV に文化の初期感染は、井戸 (1.4 mL) もマイクロ流路 (0.2 mL)、現在の合計量する必要があります考慮する薬物または接種濃度の計算のため。正確な投与を保証するためにマイクロ流路を総理するために b 型肝炎ウイルスや薬物を含む培地で 1 つの洗浄のステップが実行されます。
使用しているプラットフォームにより、足場内多層肝細胞もあたり 600,000 PHH を利用しています。にもかかわらず、セル数を変えることができます、選択したセルの濃度は最適な結果を保証します。版のフォーマットは、36 の足場にアップグレードすることができます 12 足場の合計を保持します。ただし、マイクロ流体の要件によりよく数字が大きいほどにスケール アップは不可能までです。
これらのアプローチを使用して、文化はこれまで異なる肝細胞間の複雑な相互作用の研究し同様、新しい薬剤の候補者を評価する前例のない機会を提供する、少なくとも 40 日間最適な電池の性能を維持できHBV 感染集団。

B 型肝炎ウイルスの研究開始感染1セルあたり HBV ゲノム コピーの数千に数百を必要とする文化システムの感受性に乏しいによって複雑にされています。また、ひと肝細胞は一般に非常に壊れやすい、従来の文化2の間に急速に脱分化します。これは、平坦で、ハード プラスチックの表面は肝臓とマイクロ流体循環の不在で文化の酸素化の一般的な欠如内で見つかった自然細胞環境を模倣しないという事実が主に原因です。コラーゲン被覆板に従来の静的な肝細胞培養は急速に脱分化し、HBV 感染3感受性を失います。ここでは、セットアップと拡張機能的な代謝能力によりコラーゲン被覆板従来 2次元静的 PHH 文化非常に有利であるが、3 D の肝臓オンチップ文化で育った PHH の感染について述べる促進少なくとも 40 日間4の長期的な文化。このシステムは、PHH は細胞に酸素と栄養を供給する培地で継続的に潅流されたコラーゲン被覆の足場にシードされます。マウス線維芽細胞または回転楕円体の 3 D の成長の複雑な共培養系が検証され、セル、3 D あたり 500 ゲノム相当 (GE) HBV の感染を使用して HBV 感染に敏感であるにもかかわらず PHH の代替文化システムに基づいて肝臓オンチップ文化 0.05 を受けやすい唯一の in vitro モデル システムのまま HBV GE セル4あたり。これまたにより支えられています HBV 感染を確立し高濃度のジメチルスルホキシド (DMSO) とポリエチレング リコール (PEG) を使用しての必要性これらの文化で 3 D の肝臓オンチップ培養システムの感染症のため不可欠であるであります。4します。 b 型肝炎ウイルスの主な特徴の一つ感染症は cccDNA プールは、de novo-生成粒子5,6の転写のテンプレートとして機能します。CccDNA は、従来肝細胞文化7,8で検出することができます、にもかかわらずかどうか cccDNA の規制とその除去を目指した治療上のアプローチは、要約で部分的に不明のままか完全に脱分化型肝細胞。私たちはその cccDNA 3 D チップ上の肝臓文化で形作られる機能的生理学的刺激に応答する、cccDNA ゲノム4転写マシナリーのアクセシビリティとの干渉によってターゲットすることができますを示しています。
HBV 感染患者、治療成功と同様、感染症のためのバイオ マーカーの同定を有効にすることで 3 D の肝臓オンチップ模倣 HBV 感染への応答をホストします。肝臓にチップ文化のユニークな機能の中では PHH とクッパー細胞4、星状細胞9、正弦波の肝など肝臓内の他の実質細胞の長期のホスト応答を評価する能力内皮細胞10,11。これは、複雑な 3次元微小環境におけるセル/セル相互作用を評価するユニークな機会を提供しています。
さらに、このプラットフォームの拡張の培養期間は従来肝細胞培養システムでは不可能な連続的な薬物治療の評価および HBV の持続性に与える影響を促進します。
このプロトコルを記述する方法 3 D 肝臓-オン-チップ PHH のモノカルチャーのためまたは PHH のクッパー細胞と共培養系の文化が生成されます。さらに、ホストとウイルスの応答の後の分析と同様、低感染多様性研究、浄化された HBV の生産について述べる。

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウィリアムズEミディアム、フェノールレッドなし</td><td>GIBCO</td><td>A12176-01</td><td></td></tr><tr><td>肝細胞解凍培地</td><td>GIBCO</td><td>CM7500</td><td></td></tr><tr><td>一次肝細胞解凍およびプレーティングサプリメント</td><td>GIBCO</td><td>CM3000</td><td></td></tr><tr><td>一次肝細胞維持サプリメント</td><td>GIBCO</td><td>CM4000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>GIBCO</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12491023</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸 (NEAA) 100x</td><td>GIBCO</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、米国産、熱不活化、滅菌ろ過、細胞培養に適しています</td><td>SIGMA</td><td>12106C</td><td></td></tr><tr><td>ヒドロコルチゾン</td><td>SIGMA</td><td>H0888</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>メルク</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>子牛の皮膚からのコラーゲン</td><td>メルク</td><td>C9791</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>シグマ</td><td>G418-RO</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン</td><td>シグマ</td><td>T3258</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール8000</td><td>SIGMA</td><td>P2139</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>SIGMA</td><td>SO389</td><td></td></tr>炭酸<tr><td>ナトリウム無水SIGMA</td><td></td><td>451614-25G</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>SIGMA</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>SIGMA</td><td>S2002-5G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸、99.999%</td><td>SIGMA</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>SIGMA</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>SIGMA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>SIGMA</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン (ヒト)</td><td>SIGMA</td><td>A9731</td><td></td></tr><tr><td>Fisher BioReagent&nbsp;ウシ血清アルブミン、フラクションV、ヒートショック処理</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP9701-100</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止マウンタント</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal Master Mix II, no UNG</td><td>Applied Biosystems</td><td>4440040</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Select Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4472903</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide from Escherichia coli K12</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-eklps</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>キット/消耗品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌膜</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip灌流細胞培養プレート</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC12</td><td></td></tr><tr><td>LiverChip培養プレートの蓋</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>滅菌丸型濾紙</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>細胞付着足場</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>リテーニングリング</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-SC</td><td></td></tr><tr><td>滅菌プランジャー</td><td>CN Bio innovations</td><td>LC-ST</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy血液&組織キット</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td></td></tr><tr><td>Rneasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Human Magnetic Luminexアッセイ</td><td>R&D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate Solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Accessory Set</td><td>Qiagen</td><td>1048147</td><td>Containing RNA carrier</td></tr><tr><td>Millicell HY 5-layer cell culture flask, T-1000, sterile</td><td>Millipore (Merck)</td><td></td><td></td>バーコード付きPFHYS1008</tr><tr><td>MicroAmp光学式384ウェル反応プレート</td> ライフ<td>テクノロジー</td><td>4309849</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp光学接着フィルム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>クリアフラットボトムイムノ非滅菌96ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>96</td>ウェルプレート用442404<td></td></tr><tr><td>シーリングテープ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15036</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 滅菌ディスポーザブルボトルトップフィルター PES メンブレン付き</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>295-3345</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Microscopic Slides with Ground Edges, Twin Frost</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB58628</td><td></td></tr><tr><td>Tube, 薄壁, ウルトラクリア, 38.5 mL, 25 x 89 mm</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社<名/strong></td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>初代細胞 / 細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Plateable Hepatocytes, Transporter Qualified</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HMCPTS</td><td></td></tr><tr><td>凍結保存されたヒトKupffer</td>細胞 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HUKCCS</td><td></td></tr><tr><td>HepDE19細胞株</td><td>Haitao Guo (Indiana University, IN, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>プライマー/プローブ/スタンダード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBV DNAフォワードプライマー</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GTGTGCGGCGTTTTATCA-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNAリバースプライマー</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GACAAACGGGCAACATACCTT-3'HBV</td></tr> <tr><td>DNAプローブ</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'FAM-CCTCTKCATCCTGCTGCTATGCCTATGCCTCATC-3'TAMRA</td></tr><tr><td>pgRNA フォワードプライマー</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3'pgRNA</td></tr> <tr><td>reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3'RPS11</td></tr> <tr><td>forward primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-GCCGAGACTATCTGCACTAC-3'RPS11</td></tr> <tr><td>reverse primer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>5'-ATGTCCAGCCTCAGAACTTC-3'pCMV-HBV</td></tr> <tr><td></td><td>Professor Christoph Seeger (Fox Chase Cancer Centre, PA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗B型肝炎ウイルスコア抗原IgG分画(ポリクローナル)</td><td>DAKO</td><td>販売終了</td><td>Lot 10102505</td></tr><tr><td>ヒトアルブミン抗体 A80-129A</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-129A</td><td></td></tr><tr><td>Human Albumin cross-adsorbed Antibody, A80-229P</td><td>Bethyl Laboratories. inc</td><td>A80-229P</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>#&nbsp;A-11072</td><td>ロット1431810</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChip真空ポンプ</td><td>CNバイオイノベーション</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>リバチップ空気圧フックアップ</td><td>CNバイオイノベーション</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>LiverChipプラットフォーム</td><td>CNバイオイノベーション</td><td>LC-PN</td><td></td></tr><tr><td>リバチッププレート洗浄ドック</td><td>CNバイオイノベーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オートクレーブ可能な金属鉗子</td><td>VWR</td><td>232-0106</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスジーニー2</td><td>科学産業</td><td>SKU:SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>オプティマXPN-80超遠心分離機</td><td>ベックマンコールター</td><td>A95765</td><td></td></tr><tr><td>ヘレウス マルチフュージ X3R 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004500</td><td></td></tr><tr><td>SAM-12 医療用吸引 高真空 高流量</td><td>MGE ワールドワイド</td><td>&nbsp;SAM12/01010101</td><td></td></tr><tr><td>NUAIRE 5800シリーズインキュベーター</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5841</td><td></td></tr><tr><td>自動精密トルク</td><td>CN バイオイノベーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手動トルク</td><td>CNバイオイノベーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiverChipコンプレッサー</td><td>CNバイオイノベーション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminex LX-200 xPONENT 3.1</td><td>Luminex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>付き機器Milliporeハンドヘルド磁気セパレーターブロック</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Millipore&trade; 40-285</td><td></td></tr><tr><td>FluoStar OptimaプレートリーダーBMG</td><td>Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOLVER 精密電動ドライバー</td><td>VTECH ltd</td><td>FAB10RE/FR</td><td></td></tr><tr><td>KOLVER 電源</td><td>VTECH ltd</td><td>EDU1FR</td><td></td></tr><tr><td>BAMBI VTS75D</td><td>Air Equipment</td><td>販売終了</td><td></td></tr><tr><td>Integra Vacuboy</td><td>INTEGRA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA 7 リアルタイム PCR システム、384 ウェルブロック</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4453536</td><td></td></tr></tbody></table>

初代肝細胞とクッパー細胞 b 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

にもかかわらず、実験感染したチンパンジーの慢性、唯一の 3 つのウイルスのゲノムを使用することが、生体内で、B 型肝炎ウイルス (HBV) の例外的な感染性の in vitro モデル最も必要でセルごとのウイルスのゲノムの数千に数百一過性感染を開始する順序。また、ひと肝細胞 (PHH) 静的 2D 文化は彼らの急速な脱分化による短期的な研究のみを許可します。ここでは、モノカルチャーまたは他の実質の肝臓居住者細胞と共培養系、PHH の 3 D の肝臓オンチップ文化について述べる。これらは生理的ホスト細胞応答と長期的な HBV 感染症の勉強に重要な改善を提供しています。薬剤の有効性の研究、毒性学的分析、および病因の捜査を促進する、に加えてこれらマイクロ培養装置は、HBV 感染した閉鎖を排除することを目的とした根治的治療法の評価を有効にします。円形 (ccc) DNA。これはメソッドが提示は PHH モノカルチャー ・ PHH/クッパー細胞共培養、精製の HBV の感染宿主反応の解析の設定について説明します。このメソッドは、特に HBV 感染、治療の組み合わせと病因の長期的影響の評価に適用されます。

プライマリ人間クッパー細胞や肝細胞と b 型肝炎ウイルスの感染の長期培養のためのシンプルで汎用性の高いプラットフォームについて述べる。ひと初代細胞が連続的に (図 1 a) 培地で細胞を perfuses マイクロ プレート アセンブリ内でコラーゲン被覆ポリスチレン足場でシードされます。
通常のみ安定した時間の限られた量のためにある従来の培養系、PHH は長時間の機能的保持ことができます。機能性肝細胞から分泌されると肝臓代謝の評価の最高のマーカーである、アルブミン安定化によって表されます 3 D 文化日 40 後播種 (図 2) まで。共培養系、(例えば、IL6 と tnf α) 特定のサイトカインの分泌物による Kupffer 細胞機能および生存率を評価できます。サイトカイン産生を測定するには、LPS 刺激による共培養系のキャプチャ ベース検出手段の使用は (図 3) をお勧めします。
細胞は、通常の機能胆細管と完全な細胞の極性形成 (図 2) を示す PHH の播種 3 日以内肝への放射能を形成します。彼らの生理学的な細胞の代謝を保持に加えてこれらの文化は HBV 感染に非常に敏感になります。HBV DNA および他の文化のシステムと対照をなして、他のウイルス マーカーとなって感染後 2 日目 (図 4) から容易に検出できます。肝細胞を含む足場の文化から取得、ウイルス抗原の免疫蛍光検出に使用ウイルス感染の分泌マーカーだけでなく (例えば、 HBsAg、HBcAg) (図 4)。従来の肝細胞培養を必要とするセルと 2 %dmso 添加あたりの少なくとも 500 の HBV GE 接種、4 %0.05 HBV GE ほどペグが DMSO やペグ (図 4) の必要がなく 3次元文化に感染を開始することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig1.jpg"> 図 1: 3-D 肝臓オンチップ文化のセットアップ。(、) これは培養プレートのアセンブリのスケマティック レイアウト マイクロ流体循環の確立を図る。(b) このパネルに表示されますを含む文化井戸のクローズ アップ ビュー フィルター ペーパー、足場、止め輪。(c) このパネルが文化を播種する前に板の平衡化のプロセスを示しています。次の 2 つのパネルは、播種肝モノカルチャーの (d) と (e) 肝細胞/Kupffer 細胞共培養系のプロセスを示します。(f) このパネル手順を示します、洗濯中の変更に関連します。(g) このパネルは菌の除去を含む HBV 感染セットアップを示しています。スウェン播種培地、MM の = = メンテナンス中。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig2.jpg"> 図 2: 肝微少形成と肝細胞生存します。次の微少形成を示す 3 D 肝モノカルチャーの縦方向の明視野画像を示しています (、) のこのパネル播種します。(b) このパネルを示します核 (ブルー) 文化の蛍光イメージングとアルブミン (緑)。(c) このパネル縦合計アルブミンを示していますと同様セルあたり肝モノカルチャーの 40 日の間に、アルブミンの生産を調整する elisa 法によって決定されます。表示されるデータは、平均 ± SD.この図は、オルテガ プリエトら4から適応されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig3.jpg"> 図 3: 3次元共培養系におけるクッパー細胞機能します。これらのパネルの表示 (、) IL6 の分泌、および (b) tnf α で肝細胞のモノカルチャーと肝細胞/Kupffer 細胞 cocultures 人間磁気を使用して決定される 9 日ポスト播種、外因追加 LP への応答における播種後 11 日Luminex 試金。この図は、オルテガ プリエトら4から適応されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58333/58333fig4.jpg"> 図 4: 肝臓オンチップ培養における HBV 感染。(、) このパネルに表示されます HBcAg (赤), HBsAg (緑) と核 (青) の蛍光顕微鏡による検出 HBV に文化の伝染の後の 10 日。(b) このパネルは、文化の培養上清中の HBV DNA の定量化により感染の異なる多重度を用いた b 型肝炎ウイルス感染に対する感受性を示しています。(c) このパネルには、ハウスキーピング遺伝子 RPS11 を基準にして b 型肝炎 pgRNA の縦の蓄積の数量が表示されます。表示されるデータは、平均 ± SD.この図は、オルテガ プリエトら4から適応されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58333/58333fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

このプロトコルの目標は、B 型肝炎ウイルスと 3-D「肝臓-オン-チップ」感染実験を実行するステップ バイ ステップ ガイドを提供することです。

初代肝細胞とクッパー細胞 B 型肝炎ウイルス感染の「肝臓-オン-チップ」文化

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

この方法は、肝刺激性感染症や肝疾患分野での主要な質問に答えることができます。肝臓に居住する細胞集団の寄与など、ウイルス病原性、縦方向感染運動、ウイルス複製のメカニズム、免疫浸潤、生理モデルシステムおよび薬物検査研究において。この技術の主な利点は、肝微小環境を再現する能力です。これは長期間維持することができ、自然に生理学的関連レベルでB型肝炎感染の影響を受けやすい。これは以前、B型肝炎分野における基本的な制約でした。薬物検査の研究は長期間にわたって生理学的プラットフォームで行うことができるため、この技術の意味はHBV感染の治療または診断に及ぶ。これにより、既存および新規の治療法戦略の有効性を分析するとともに、逐次的な薬物治療の評価が可能になります。この方法は、B型肝炎への理解を提供することができます, また、疾患の他の研究に適用することができます, 他の肝性感染症を含みます, 肝臓病, または薬物代謝研究.一般的に, この方法に新しい個人は苦労します, それは長期間の肝臓組織の正常な維持を可能にするために特定の詳細に注意を必要とするため、.また、特殊な工具や機器にも親しまれています。この方法の視覚的なデモンストレーションは重要です。プレートのアセンブリを含むだけでなく、細胞の解凍と播種。肝臓由来細胞の長期培養に関与するステップは、新規培養系を使用する場合に困難であるため.まず、肝臓チッププラットフォームに関連付けられたコンプレッサーと真空ポンプの両方をオンにします。プレートを組み立てて平衡化するために、ガラス管キャビネットに進みます。プレートベースに滅菌膜を置き、微小流体プレートを無菌で組み立て始めます。無菌膜がベースプレートの2本のピンに滑らかにかかっていることを確認する。次に、よく含有するトッププレートを追加します。滅菌プレート蓋を追加します。33ポンドに設定された自動精密トルクを使用します。スパイラル締め付けシーケンスを使用して、プレートの基部のネジを締めます。手動トルクを使用して、すべてのネジが35ポンドに締め付けされていることを確認してください。次に、肝細胞播種培地をプライミング前に摂氏37度に予熱する。完全に組み立てたプレートを洗濯ドックに入れます。そして、プレートが完全にスナップすることを確認してください。各ウェルのリザーバー側に400マイクロリットルの肝細胞播種培地を加え、プレートを盛り付けます。この後、毎秒1マイクロリットルで3.5分間上向き方向に流れを開始します。プレートの側面にある赤色のインジケーターは、マイクロ流体循環が正常に機能しているかどうかを示します。培地がプレートの細胞増殖側に送り込まれたら、さらに1.2ミリリットルの肝細胞播種培地を加える。37°Cと5%CO2で加湿インキュベーター内のドッキングステーションにプレートを慎重に移します。16時間、毎秒1マイクロリットルの流量で上向き方向に流れを開始します。この後、プレートを洗濯ドックに移します。気泡を除去するために上下にピペットを軽く。滅菌鉗子を使用して、各ウェルに無菌丸いろ紙を加える。次に、セルアタッチメントスキャフォールドと保持リングを各ウェルに追加します。滅菌プランジャーを使用して各井戸を押し下げ、保持リングと足場を所定の位置にロックします。次に、すべての培地を吸引する。そして、足場の上に温め込まれた肝細胞播種媒体の400マイクロリットルを静かに加えます。1秒当たり1マイクロリットルで3分の1分間、下方向に流れを開始します。プレートの貯留部側からポンプで送り出されたすべての媒体を吸引する。各ウェルに1.4ミリリットルの肝細胞播種培地を加えます。その後、ドックにプレートを戻し、井戸あたりの総体積を最大1.6ミリリットルにします。まず、肝細胞解凍培地と肝細胞播種培地を摂氏37度に予め温める。次に、サプライヤーの指示に従って、主要なヒト肝細胞のバイアルを解凍します。ガラス管キャビネット内で、細胞を肝細胞の播種培地の1ミリリットルに再懸濁させる。その後、再懸濁した細胞を氷の上に置きます。トリパンブルーを使用して、細胞の生存率が90%を超えることを確認するために細胞を数え、完全に組み立てられたプレートを洗浄ドックに移します。そして、井戸からすべての媒体を吸引します。氷から細胞を取り出し、500マイクロリットルの肝細胞播種培地で各ウェルに600,000個の肝細胞を加える。1マイクロリットル/秒の流量で下向き方向への流れを開始します。各ウェルに900マイクロリットルの肝細胞播種培地を加え、各ウェルの総容量を1.6ミリリットルにします。37°Cで5%CO2で加湿インキュベーター内のドッキングステーションにプレートを移します。8時間、毎秒1マイクロリットルの流量で下向き方向に流れを開始します。この後、8時間毎秒1マイクロリットルの流量で上向き方向に流れを逆にします。その後、プレートを洗浄ドックに移し、ウェルからすべての培地を吸引する。各ウェルに肝細胞維持培地400マイクロリットルを加えます。そして、3 1/2分間、毎秒1マイクロリットルの流量で下向き方向に流れを開始します。次に、貯留槽からすべての培地を吸引し、1.4ミリリットルの肝細胞維持培地を加える。37°Cと5%CO2で加湿インキュベーター内のドッキングステーションにプレートを移します。毎秒1マイクロリットルの流量で48時間上向きに流れを開始します。48時間後、洗浄ドックに移してプレートを洗います。井戸からすべての媒体を吸引する。そして、メンテナンス媒体の400マイクロリットルを追加します。そして3.5分間、毎秒1マイクロリットルで下方向に流れを開始します。その後、井戸の貯留側に現れるすべての培地を吸引する。肝細胞維持培地を1.4ミリリットル加えます。次に、プレートを加湿インキュベーターのドッキングステーションに戻します。毎秒1マイクロリットルの流量で48時間上向きに流れを開始します。この洗浄・交換プロセスを48時間ごとに使用して、培地を交換してください。一次ヒト肝細胞は、通常、従来の培養システムを使用する場合、限られた時間だけ安定している。ただし、ここで説明するプロトコルを使用すると、機能を長期間にわたって維持できます。ヒトアルブミンは機能的肝細胞によって分泌され、肝機能を評価するための最良のマーカーであると考えられている。アルブミンは、少なくとも40日目のポストシードまで、3D文化によって安定して高く表現されている。共培養の場合、クッパー細胞の機能性と生存率は、特定のサイトカインの分泌を測定することによって評価される。ここで見られるように、IL-6およびTNFアルファの測定されたレベルは、細胞が機能的に維持され、生存可能であることを示す。生理的細胞代謝を維持することに加えて、これらの培養物はHBV感染の影響を非常に受けやすくなった。HBV DNAおよび他のウイルスマーカーは、2日目の感染後から容易に検出可能である。従来の培養では、DMSOおよびPEGを補う少なくとも500個のHBVゲノム相当量を接種する必要がありますが、これらの3D培養物は、わずか05個の未補充ゲノム相当物に感染しています。ウイルス感染の分泌マーカーに加えて、肝細胞含有足場はこれらの培養物から取り出される。免疫蛍光顕微鏡は、これらの足場がウイルス抗原を含んでいる事を明らかにする。この手順を試みる間、細胞死を避けるために播種する前に肝細胞を扱うときに穏やかにすることが重要です。さらに、プレートが正しく組み立てられ、すべてのフローチャネルが肝細胞を播種する前に正しいメディア循環を可能にすることを確認することが不可欠です。この手順に従って、免疫蛍光のような他の方法は、追加の質問に答えるために行うことができる。組織内の感染細胞の位置と頻度を含む。肝細胞の生理的状態はまた、緊密な接合タンパク質ZO-1を含むアルブミンまたは肝構造の染色によって評価することができる。この開発の後、この技術は、ウイルス学の分野の研究者が生理学的3DモデルシステムにおけるB型肝炎感染および免疫応答を探求する道を開く。B型肝炎ウイルスの使用は危険であり、以前のワクチン接種、適切なPPEの使用、適切なバイオセーフティガイドラインの下での作業などの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。

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Research

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Immunology and Infection

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学ぶ肝臓-オン-チップ技術を用いたB型肝炎ウイルス感染実験法。初代肝細胞とクッパー細胞を用いて生理学的マイクロ環境を再現し、長期的な感染動態とウイルス複製メカニズムを研究する。

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