エアロゾル化リポ多糖を使用して生成肺好中球増加のための方法

この手順の全体的な目標は、エアロゾル化されたLPSへの曝露により、一貫性があり再現性のある気道好中球増加症を生成することです。これは、最初に生理食塩水に懸濁したLPSを露光チャンバーに接続されたネブライザーにロードすることによって達成されます。次に、マウスをエアロゾル化されたLPSに曝露し、次に気管支肺胞洗浄液を採取し、洗浄液中の炎症細胞を列挙します。

最後に、肺組織を固定し、正式には埋め込みと切片化、および免疫組織化学分析を行います。最終的に、気管支肺胞洗浄の総細胞数と微分細胞数を使用して、肺への好中球の動員を評価できます。気管内LPSの投与のような既存の方法上のこの技術の主な利点は、肺全体のエアロゾル化されたLPSの均一な分布、パフォーマンスの容易さ、および成功したアプリケーションに必要な最小限のトレーニングです適切なPPEを使用してLPSエアロゾルを生成し、換気されたレベル2のバイオハザードフード内では、ネブライザーに赤い入口を挿入し、ネブライザーを加圧された室内空気に接続することによって開始されます。生産者。

次に、エアフィルターを使用してネブライザーの出口を質量流量計に接続し、次に質量流量計を電源に接続します。圧力を1〜2バールに保ちながら、空気の流れを毎分5リットルに調整してから、質量流量計を取り外して空気の流れを切断します。次に、ネブライザーの出口を、取り外し可能な蓋が取り付けられた15.9 1 50 x 1 63 x 2 0 5ミリメートルのプレキシガラスボックスに接続された分岐チューブに接続します。

各ボックスには、圧力の蓄積を防ぐために、入口の反対側に5mmの穴を開ける必要があります。次に、各ボックスに最大5匹のマウスを入れ、蓋を閉めます。次に、ネブライザーを開きます。

生理食塩水または生理食塩水ビヒクルのみに溶解した4〜8ミリリットルのLPSをインサートに充填し、入口を空気供給に再接続します。エアロゾルが閉じたプレキシガラスボックスに流れ込むのを許し、動物を継続的に監視し、エアロゾル化中に空気供給がネブライザーの入口にしっかりと固定されていることを確認します。10分後、空気の供給を切断し、動物をプレキシガラスの箱にさらに2分間放置します。

次に、蓋を開けます。エアロゾルを分散させ、実験エンドポイントでマウスをケージに戻します 各動物について順番に、最初にハサミを使用して胸部を露出させるための単一の前方後部カットを作成します。次に、胸骨の前方の先端で胸郭を持ち上げ、肺組織に切らずに最も腹側のポイントで横隔膜を穿刺します。

次に、顎の下を前後方向に交わる2つのカットで胸郭を開きます。胸郭が開いたら、鉗子を使用して胸郭をそっと引き離し、喉頭の下の気管を切断します。次に、気管を持ち上げ、肺葉と胸腔をつなぐ靭帯を切断します。

次に、肺と気管をゆっくりと引き上げて脂肪と心臓組織から離し、シリンジパッケージ紙の上に置きます。次に、0.965ミリのポリエチレンチューブを気管に挿入し、絹糸の紐で固定します。マルチローブも絹糸で結び、23ゲージの針をポリエチレンチューブに挿入します。

次に、気管支肺胞洗浄液を採取するために、1ミリリットルの注射器を使用して、滅菌PBSと呼ばれる250マイクロリットルの氷をシングルローブにゆっくりと注入し、肺を慎重に軽くたたいて作業台の表面に30回液体を戻し、液体を注射器に戻し、200マイクロリットルの新鮮なPBSで手順を繰り返した後、チューブに収集します。 気管支肺胞洗浄液を氷の上に置いて、後で分析します。.組織学的分析のために肺組織を固定するには、マルチローブを取り外してスナップします。ドライアイスで冷凍します。

ローブは摂氏マイナス80度で保管します。組織学的分析のために組織を固定するには、プランジャーなしの60ミリリットルのシリンジを金属製の支持スタンドに取り付け、シングルローブにホルマリンを5分間注入します。次に、針を外して絹糸を引っ張って、ポリエチレンチューブと一緒に気管から取り出します。

気管を閉じると同時に、肺の圧力を保持します。次に、ローブをホルミンに摂氏4度で24時間沈めます。翌日、固定したティッシュを70%エタノールで毎回少なくとも20分間3回洗浄します。

脱水組織をパラフィルムに包埋した後、ローブを4〜5ミクロンの切片に切断し、組織学的評価のためにヘマチンとエオインで切片を染色します。ビヒクルのみで生成されたエアロゾルに曝露されたマウスの気管支肺胞洗浄液中の総細胞数は、通常、約200, 000細胞以下です。細胞は95〜100%の単核細胞で構成され、リンパ球はわずかで好中球はありません。

マウスは、エアロゾル化して1ミリグラムあたり1ミリグラムで挑戦しました。組合。しかし、気管支肺胞洗浄液中の総細胞数の増加を示し、通常は6時間後に500,000細胞を超え、細胞浸潤は24時間後も高いままであり、細胞プロファイルは好中球の優勢にシフトしています。同様の炎症性細胞プロファイルと肺好中球増加症は、LPSあたり5ミリグラムの噴霧でも観察されます。

好中球は、LPSチャレンジの6時間および24時間後に、上皮粘膜下組織、および伝導性気道および血管の周囲の空間で観察されましたが、制御されていませんでした。生理食塩水処理マウス。LPSチャレンジマウスの気管支肺胞洗浄液中の総タンパク質含有量は、生理食塩水に曝露されたマウスと比較して増加し、好中球化学療法誘引剤ケモカインc、XCL one、およびC XCL 2の発現もLPSチャレンジマウスで増加します。

しかし、この方法では、LPが誘発する肺の炎症についての洞察を得ることができます。また、エアロゾル化された蒸気をさまざまな課題に対応するように適応させることができるため、細菌感染やウイルス感染などの他の疾患モデルにも適用できます。