マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

この実験プロトコルの全体的な目標は、マウスに細菌性肺炎を誘発するための非侵襲的で技術的に非集中的な手順を提供し、その後の肺におけるin vivo宿主防御応答の定量化を提供することです。この方法は、感染症や免疫学の分野における、感染に対する宿主の応答を制御する遺伝子や分子経路に関する重要な疑問に答えるのに役立ちます。この肺感染法の主な利点は、その技術的な単純さです。

これにより、肺の処置にほとんど専門知識がない研究室でも、肺の自然免疫応答を研究することができます。バイオセーフティレベル2の施設で、K.pneumoniaeのグリセロールストックを解凍し、1ミリリットルの細菌を50ミリリットルのトリプシン大豆ブロスを含む500ミリリットルの培養フラスコに移します。懸濁液培養物を摂氏37度、200〜225RPMで一晩インキュベートします。

翌朝、50ミリリットルのトリプシン大豆ブロスを含む新しいフラスコで1〜5ミリリットルの細菌培養物を希釈し、シェーカー内で培養物を摂氏37度でさらに2.5時間インキュベートして、対数相を達成します。2回目のインキュベーションの終わりに、2回目の培養物から1ミリリットルの細菌を1.5ミリリットルのチューブに移して遠心分離します。パレットを乱さずに上清を取り除き、1ミリリットルの滅菌生理食塩水に細菌を穏やかに再懸濁して、3回に分けて洗浄します。

3回目の洗浄後、細菌を別のミリリットルの滅菌生理食塩水に再懸濁し、接種物のlogwise段階希釈を設定します。使い捨てキュベットで1〜10と1〜100の希釈液の1ミリリットルを二重に測定し、洗浄した肺炎菌のOD600を決定します。OD600 が 1.0 の場合、1 ミリリットルあたり 10 から 8 CFU の 4 倍から 7 倍にほぼ相当します。

各希釈液中の細菌の濃度を計算した後、8〜12週齢のレシピエント動物あたり50〜60マイクロリットルの滅菌生理食塩水に所望の接種CFU用量を再懸濁します。細菌を動物に送達するには、投与接種物をP200ピペットチップに引き込み、麻酔をかけたマウスを上顎切歯で吊り下げられた半横臥位に置き、傾斜したプレキシガラスボードのペグの間に張られた輪ゴムから下顎切歯で吊り下げます。鈍く隆起していない鉗子のペアを使用して、舌をそっと横に引っ張り、舌や口腔咽頭に外傷を誘発しないように注意しながら、動物の口腔に用量を沈着させます。

舌を引っ込めたまま、手袋をはめた指で鼻をそっと閉め、家が2〜3回吸い込むまで。口腔内に液体が見えない場合は、マウスを接種ボードからケージに仰臥位で移し、マウスの回復中に鼻孔が詰まらないようにします。胸骨のすぐ下に縦方向に切り込みを入れます。

次に、鉗子で胸骨を持ち上げ、横隔膜に傷をつけ、肺を胸腔に戻します。血管系の両側の胸腔を通って首まで切開を続けます。気管が見えたら、首の中央を慎重に切り取り、周囲の血管を損傷しないように組織を側面に押します。

次に、頭から約4分の1のところで気管に切り込みを入れ、1ミリリットルのPBSをあらかじめ装填した1ミリリットルの注射器に取り付けられたカニューレを気管に尾側に挿入します。ボリュームをゆっくりと肺に押し込み、すべての葉が膨らむようにします。次に、シリンジでボリュームを引き出し、収集した洗浄液を氷上の15ミリリットルのチューブにプールします。

適切な実験エンドポイントで、左心室から血液を採取し、凝固を避けるためにヘパリンチューブに移します。.次に、5ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルのチューブですべての肺葉を採取し、2ミリリットルのPBSを含む15ミリリットルのチューブで脾臓を採取します。次に、サンプルごとに個別の使い捨てホモジナイザーを使用して、氷上で組織を浸軟させ、続いて組織スラリーを段階希釈します。

希釈液を1枚のTSAプレートの別々の面に二重にプレートし、サンプルを短時間乾燥させます。次に、プレートを反転させ、静的な摂氏37度のインキュベーターでサンプルを一晩培養し、プレートの両側と翌朝の各希釈から細菌コロニーを平均化します。K.pneumoniaeの2000CFUでは、マウスは通常、感染後12〜24時間で臨床症状を示し始めます。

48〜72時間以内に、多くの動物は病気や罹患率の症状を示し、通常は平均20%の体重減少が先行します。ただし、LD50用量は、実験群内の比較的増加した生存期間と減少した生存期間の両方を検出できるため、長期的な研究に適している可能性があります。K.pneumoniaeによる下気道感染症は、感染後6時間以内に白血球が気道に大量に流入することを特徴とし、そのピークは24時間で、主に好中球によって表されます。

サイトカインは、K.pneumoniaeに感染してから24時間後と48時間後の両方で気管支肺胞洗浄液中に検出でき、細菌の侵入に応答した肺の微小環境とその免疫自己動員に関する洞察を提供します。肺、血液、脾臓の細菌負荷も、感染の24時間から48時間の間に劇的に増加します。肺感染症の中咽頭吸引法は、一度習得すれば、適切に行えばマウス1匹あたりわずか1〜2分で行うことができます。

この手順を試みるときは、過度の吸引量を使用しないことを覚えておくことが重要です。50〜60マイクロリットルの容量は、通常、8〜12週齢のマウスに適しています。この手順に続いて、肺組織および末梢組織に対してさまざまな方法を実行して、病原体クリアランスにおける免疫応答の定量化を可能にすることができます。

このビデオを見れば、中咽頭病原体送達による実験的細菌性肺炎の誘発方法と、マウスの病原体負荷の判定方法について十分に理解できるはずです。微生物を扱う作業は危険な場合があり、この手順を実行する際には常に基本的なBSL-2の予防措置と実践を行う必要があることを忘れないでください。