マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

この実験プロトコルの全体的な目的は、マウスにおいて細菌性肺炎を誘発し、それに続く肺内でのin vivo宿主防御反応を定量化するための、非侵襲的かつ技術的負荷の少ない手順を提供することです。この手法は、感染症および免疫学の分野において、感染に対する宿主応答を制御する遺伝子や分子経路に関する重要な疑問への回答に寄与します。この肺感染法の主な利点は、技術的な簡便さにあります。

これにより、肺の手技に関する専門知識が少ない研究室であっても、肺の自然免疫応答を研究することが可能になります。バイオセーフティレベル2の施設において、K.pneumoniaeのグリセロールストックを融解し、細菌1 mLを50 mLのTryptic Soy Brothを含む500 mLの培養フラスコに転移します。この懸濁培養液を37 °C、200～225 RPMで一晩インキュベートします。

翌朝、1〜5 mLの細菌培養液を、50 mLのトリプチケースソイブイヨンを含む新しいフラスコに希釈し、対数増殖期に達するまで、シェーカーを用いて37 °Cでさらに2.5時間培養します。2回目の培養終了後、2番目の培養液から1 mLの細菌を1.5 mLチューブに移し、遠心分離を行います。ペレットを乱さないように上清を除去し、1 mLの滅菌生理食塩水で細菌を緩やかに再懸濁させ、この洗浄工程を3回繰り返します。

3回目の洗浄後、細菌をさらに1 mLの滅菌生理食塩水に再懸濁し、接種液の対数段階希釈系列を作成します。洗浄したK.pneumoniaeのOD600を決定するため、10倍希釈および100倍希釈液をそれぞれ1 mLずつ使い捨てキュベットに分注し、2回ずつ測定します。OD600が1.0であることは、おおよそ1 mLあたり4～7 × 10⁸ CFUに相当します。

各希釈液中の細菌濃度を算出した後、8〜12週齢の受容動物1匹あたり50〜60 µLの滅菌生理食塩水に、目的の接種用CFU量を再懸濁します。動物に細菌を投与するには、投与用接種液をP200ピペットチップで吸い上げ、麻酔したマウスを、傾斜させたPlexiglasボードのペグ間に張ったゴムバンドで上顎切歯で吊り下げ、半臥位の仰向けの状態にします。鈍端の溝のないピンセットを用いて、舌を優しく横に寄せ、舌や口腔咽頭に外傷を与えないように注意しながら、動物の口腔内に投与量を注入します。

舌を後方に引いたまま、マウスが2〜3回吸入するまで、手袋を着用した指で優しく鼻を塞ぎます。口腔内に液体が見えなくなったら、マウスが回復する間に鼻孔が塞がるのを防ぐため、接種ボードからケージへ仰向けの状態のまま移動させます。胸骨の直下を縦方向に切開します。

次に、ピンセットで胸骨を持ち上げ、横隔膜に切り込みを入れ、肺が胸腔内に戻るようにします。血管系の両側から胸腔に向かって切開を続け、頸部まで進めます。気管が見えたら、頸部の中央を慎重に切断し、周囲の血管系を傷つけないよう組織を横に押し除けます。

次に、頭部から約4分の1の位置で気管に切り込みを入れ、1 mLのPBSをあらかじめ充填した1 mLシリンジに接続したカニューレを気管に尾側方向に挿入します。肺のすべての葉が膨らむように、ゆっくりと液体を注入してください。その後、シリンジで液体を回収し、回収した洗浄液を氷上の15 mLチューブにまとめます。

適切な実験終了時点で、凝固を防ぐために左心室から血液を採取し、ヘパリン処理済みのチューブに移します。次に、すべての肺葉を5 mLのPBSを含む15 mLチューブに、脾臓を2 mLのPBSを含む15 mLチューブにそれぞれ採取します。続いて、サンプルごとに使い捨てのホモジナイザーを用い、氷上で組織をすり潰した後、組織懸濁液を段階希釈します。

希釈液を1枚のTSAプレートの両側にそれぞれ2連（duplicate）で播種し、サンプルを短時間乾燥させます。次にプレートを反転させ、37 °Cの静置インキュベーターで一晩培養し、翌朝、プレートの両側および各希釈段階から細菌コロニー数を算出して平均値を求めます。K.pneumoniaeが2000 CFUの場合、通常、感染後12〜24時間でマウスに臨床症状が現れ始めます。

48時間から72時間以内に、多くの動物が疾患および罹患の症状を示し、通常はその前に平均20％の体重減少が見られます。しかしながら、LD50用量を用いることで、実験群内における生存率の相対的な上昇および低下の両方を検出できるため、長期的な研究にはこちらが好まれる場合があります。K.pneumoniaeによる下気道感染では、感染後6時間以内に白血球が気道へ強力に流入し、24時間でピークに達し、その大部分を好中球が占めることが特徴です。

K.pneumoniae感染後の24時間および48時間の両方の時点で、気管支肺胞洗浄液中にサイトカインが検出され、これにより肺の微小環境および細菌侵入に応答した免疫細胞の自己動員に関する知見が得られます。また、肺、血液、および脾臓における細菌量も、感染後24時間から48時間にかけて劇的に増加します。経口咽頭吸引による肺感染手法を習得し、適切に実施すれば、マウス1匹あたりわずか1〜2分で完了させることができます。

この手順を行う際は、吸引量を多くしすぎないことが重要です。生後8～12週のマウスでは、通常50～60 µLの量が適切です。本手順の後、肺および末梢組織に対してさまざまな解析法を実施することで、病原体排除における免疫応答の定量が可能となります。

このビデオを視聴することで、経口咽頭的な病原体投与による実験的細菌性肺炎の誘発方法と、マウスにおける病原体量の測定方法について十分に理解することができます。微生物を扱う際は危険が伴うため、この手順を実行する際は常に基本的なBSL-2の予防策と慣行を遵守してください。