Name: マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: 学ぶマウスの細菌性肺炎誘導法。咽頭吸引による非侵襲的なK. pneumoniae接種と肺免疫応答の定量解析手法を解説。感染症・免疫学研究に有用で、技術的負担が少なく初心者にも実施可能です。

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この作業は、国立衛生研究所、国立環境衛生科学研究所(Z01 ES102005)の学内研究プログラムによって部分的に支援されました。

全ての実験は、NIEHSの動物実験委員会による審査の後に実験動物の愛護管理と使用上の動物福祉法と米国公衆衛生サービスポリシーに従って行われました。 K.の調製ニューモニエ文化注意：バイオセーフティーレベル2（BSL2）フードまたは他のBSL2指定された領域内のすべてのステップを実行し、同研究所のBSL2ガイドラインあたりの廃棄物を捨てます。 <ol><li> K.のサスペンション成長のためニューモニエ 、バクテリアのグリセロールストックを解凍し、Kの1ミリリットルを転送することによって作業培養物に接種500ミリリットル以上のフラスコ中のトリプティックソイブロス（TSB）の50ミリリットルに肺炎連鎖球菌株 。 </li><li>培養した対数期Kの900μLを加えることによって、グリセロールストックを作りますニューモニエの滅菌グリセロールを100μlにし、-20℃または-80℃〜で凍結。長期保存のため、-80°Cを推奨します。 </li><li> Sからの培養菌一夜フラスコを振とうすることによって1.1をTEP - 、200から225 rpm.In対数期の成長を促進するために、37℃で（14〜18時間）の午前中に50ミリリットルのTSBを含むフラスコに、この一晩培養1-5 mlで希釈し、 〜2.5時間、37℃で振盪しながら戻って置きます。 </li><li> Kの1ミリリットルを転送2分間、7500×gで1.5ミリリットルチューブとスピンへの最後のステップからの肺炎文化。白いペレットが表示されるはずです。静かに滅菌生理食塩水1mlにピペットを用いて細菌を再懸濁し、ペレットを乱すことなく上清を除去し、2分間7500×gで再びスピン。 <ol><li>この洗浄工程を2回、最終の立ち上げを行い、滅菌生理食塩水1mlにペレットを洗浄しました。 </li></ol></li><li>このきちんとした接種材料のログごとの連続希釈液を実行します。例えば、10 -1 -10 -9希釈系列を作るために、直列の滅菌生理食塩水3.6ミリリットルに接種物の400μlを添加します。 </li><li>洗浄KのOD 600を決定します 肺炎連鎖球菌の1ミリリットルを配置することにより、1：10〜1：100使い捨てキュベットに希釈液および滅菌生理食塩水で最初のブランキングOD 600を測定します 。正確性を確保するため、重複を測定します。 1.0のOD 600が 4-7×10 8 CFU / mlのとほぼ同等です。 ODとCFUの関係/ mlのは線形ではないかもしれないことに注意してください。 <ol><li> Kの濃度を計算するために希釈液からOD 600を使用しますCFU / mlを超える変換、および希釈でのファクタリング：ODを適用肺炎 。 </li></ol></li><li> Kを使用肺炎濃度 （下記参照）のマウスへの送達のために、&lt;100μlの体積で、所望の接種CFUの用量を調製しました。 </li><li>また、10 -6〜10 -9希釈液を100μl、室温で個々のトリプシン大豆寒天（TSA）プレート上に滅菌生理食塩水100μlのプレート。 37℃で一晩インキュベートし、実験に使用し、汚染を制御するために正確な濃度を計算するために細菌コロニーを列挙する。 注：最終接種の実際の細菌濃度は、吸光度によって予測500 CFU / mlの±とすることができます。彼らの個人的な経験に基づいて、CFU / mlの変換：経験的にOD 600を再調整し、マウスの生体内で使用する前にパイロット研究におけるCFU / mlの関係：実験者は、理想的には、OD 600を確認する必要があります。 </li></ol> K. 2.マウス気管内（it）吸引中咽頭からニューモニエ <ol><li>そのマウスを確認を一意にテールマーク、入れ墨、または他の承認された識別子によって識別されます。 </li><li>手続きを迅速化するために、イソフルランからマウスを削除する前にP200ピペットを用いて細菌の接種物を投与描きます。それ吸引で最良の結果を得るために、オーバーフローを防止するために、&lt;100μlの容量を使用します。ここで、Kの2000 CFU / 50μLを使用しますニューモニエ 。 </li><li>イソフルランガス（1L /分の流速で、例えば 、2％イソフルラン）と透明なチャンバ又はinstitに従ってマウスを麻酔utionalガイドライン。一緒に麻酔するマウスの数は、典型的には1〜2時間で、実験者の快適さのレベルによって決定されます。呼吸を観察し、深呼吸が表示され、2-3秒の呼吸の間でカウントすることができたら、麻酔のレベルを確認します。 注：揮発性（吸入）麻酔薬の可能交絡影響が懸念される場合には、麻酔はケタミン/キシラジンの腹腔内注射で代わりに実現することができます。上述の方法では、深い麻酔は数分続きます。より長時間の麻酔が誘導された場合に、眼軟膏、眼の乾燥を防ぐために使用されるべきです。 </li><li>マウスを麻酔した後、傾斜プレキシガラスボード上のペグ（ 図1）間に張らゴムバンドからの上顎切歯によって中断半横臥仰臥位、でそれを配置します。 </li><li>優しくP200 pipettと口腔内鈍非隆起し鉗子および預金量一対の側にマウスの舌を引っ張ります電子。舌や咽頭のいずれかに外傷を誘導することを避けるために細心の注意を払います。 </li><li>引き込ま舌を維持したまま、マウスが吸入されるまで、そっと手袋をはめた指で鼻を塞ぎます。マウスが2以上の吸入をとっている、と液体が口腔内に表示されなくなるまで鼻をカバーするために続けます。鼻を覆うことマウスが必須の鼻ブリーザーあるように、マウスは、肺に細菌を吸い込むことを確実にするのに役立ちます。 </li><li>接種ボードからマウスを削除し、そのケージに戻って、マウスが麻酔から回復している間に鼻孔をブロックから寝具や破片を防ぐために、その背中の上でマウスを置きます。 </li><li>一旦、全てのマウスが投与されており、麻酔から目覚めてきた、Kを投与されてきたマウスのみを含むキュービクル/客室内に家のマウス48時間後に感染を越えて行く場合ニューモニエ。体重を含め、毎日マウスを監視します。 </li><li>マウスは48を超えて行くことを許可する場合は、毎日マッシュおよび/または補足熱を使用してください時間。 </li></ol> 3.気管支肺胞洗浄液（BALF）の収集と分析<ol><li>機関のガイドラインあたりのマウスを安楽死させます。これはCO 2吸入と頸椎脱臼に関連した肺への可能な合併症を回避するようにここでは、失血に続いて150ミリグラム/ kgのペントバルビタールナトリウムや商業安楽死ソリューションの等価線量の致死注射を使用します。 </li><li>バックの位置でマウスとは、特に胸や首の領域にわたって70％エタノールで毛皮を噴霧することにより、マウスを滅菌します。 </li><li>その後、鉗子で胸骨を保持し、ちょうど胸骨の下の縦方向のカットを行い、ニック横隔膜、肺が戻って胸腔内に落下することができます。気管を露出させ、血管系のいずれかの側に胸腔を通ってカットした後、首を通ってアップ。 </li><li>気管がいずれかの側に縦走筋に囲まれているように、注意深くとして、中央から切断され、側面に組織をプッシュこれは、気管内に血液を導入することができ、周囲の血管系を、切削避けることができます。血管系がニックを入れている場合は、気管内腔にアクセスする前にガーゼで周囲を清掃してください。 </li><li>ニックに気管ダウンヘッドからの道の1/4程度を手術用ハサミや針を使用し、尾側に気管内に1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）1mlでプリロード1mlシリンジに取り付けられたカニューレを挿入します。マウス&lt;8週齢または女性を使用している場合は、600〜800μlにlavaging量を減らします。 </li><li>すべてのローブは膨らませると、その後3回繰り返し、注射器でバックボリュームを引き出しできるように、ゆっくりと肺にボリュームを押してください。 PBSは、鼻孔から出てくるされている場合はカニューレを気管に十分に押されていないか、またはインフレがあまりにも急速に発生しています。肺が十分に膨張されていない場合は別の方法として、カニューレはあまりにも遠くに押されたので、少し撤回します。 </li><li>氷上で15 mlのチューブ内のプールされた洗浄液を収集します。 </li><li>スピン5分間1,200×gで空域洗浄液を1.5 mlチューブに上清を回収し、-80℃で凍結します。続いて、タンパク質を測定するため、サイトカイン、および他の様々な生化学的アッセイのために上清（ 即ち 、BALF）を使用します。ペレットは、気管支空間から細胞を表します。 </li><li>赤血球（RBC）の色に基づいて細胞ペレットに明らかである場合は、1分間のACK溶解緩衝液1 mlの溶解は、溶解反応を停止し、バッファに希釈し、1×PBS 5mlを加えました。 ACK溶解緩衝液で処理かのいずれかで、同一の全ての検体を取り扱います。 </li><li>スピン細胞を5分間、1200×gで、上清をデカントし、1×1mlのPBSに細胞を持ち出します。 </li><li>総空域細胞の計数のための血球計数器上の細胞をボルテックスし、数えます。 </li><li>細胞の密度に基づいて、サイトスピン遠心分離機にスライドチャンバーに約80から150マイクロリットル（感染したマウスとナイーブマウスのための〜150のための〜80μl）を追加します。スピンセル顕微鏡への細胞の差動集団を決定するために、その後の染色のためにスライドします。 </li><li>細胞は一晩スライド上で乾燥することができます。ステインスライドを固定液で7回、汚れ1で9回、ステイン2で7回（汚れの間にはリンス）を浸漬することによってトライ染色で細胞（ 例えば 、ヘマ3 [表を参照]）、および乾燥することができます。汚れが乾燥した後、手動でカバースリップのスライドとは、顕微鏡による差を数えます。一般的には、好中球および単球/マクロファージは、簡単にそれらのサイズおよび核形態によって区別されます。 </li></ol> 4.肺および末梢組織における細菌負荷を決定<ol><li>始める前に：血のために、肺および脾臓のために1×PBS900μlの希釈用チューブを準備し、1×PBS90μlの。細菌を培養するため、室温で設定されたラベルプレート。組織が収集された後、したがって、時間が細菌増殖のための均質化とメッキとの間に最小化されます。 注：これにより、不均一deposiに吸引で発生する可能性が肺の中の細菌の化は、個々のマウスは、総気道細胞性または合計（二国間）肺細菌負荷のいずれかの分析に使用することをお勧めします。 </li><li>ステップ3.1に従ってマウスを安楽死させると、その後凝固を避けるために、ヘパリン処理したチューブ内に配置し、左心室から血液を採取。 1×PBSの2ミリリットルに脾臓と配置を除去し、1×PBSの5ミリリットルを含む15mlチューブ内のすべての肺葉と場所を削除してください。氷の上にチューブを入れます。各組織/マウスとの間にエタノールで楽器をきれいにするために注意してください。 </li><li>好ましくは、各サンプル間で変化させることができる使い捨てホモジナイザーで、氷上で組織をホモジナイズします。使い捨てホモジナイザーヒントは実験間の再利用のためにオートクレーブ処理することができます。 </li><li>組織が均質化された後、連続希釈液とプレートを実行します。プラスチック上の分割線を描くことによって、単一のTSAプレート上に二重に所定の組織/希釈のプレートサンプル。めっきおよびジリューションの提案は以下の通りです（すべてのケースでは、10μlのサンプルをプレート上に広げる）および24時間感染後の剖検に基づいています。 48〜72時間の試料を分析する場合は、希釈液のより大きな数は、後の時点で増加細菌負荷にメッキされる必要があるかもしれません。 <ol><li>ブラッドのために - 滅菌1×PBS90μlの中に血液を10μlを添加することにより、1:10に希釈します。プレートきちんとして重複した中で1:10に希釈した試料。血液がメッキされた後、サイトカインおよびケモカインの測定のために血漿を抽出するために10分間、9,300×gでの残留血液をスピン。 </li><li>シリアル滅菌1×PBS900μlの中に均質化された肺の100μLを添加することにより、100：肺のために - 1 - 1:10希釈します。プレートきちんとホモジネートと重複ですべての希釈。 </li><li>シリアル滅菌1×PBS900μlの中に均質化された脾臓100μlを加えることにより、100：10-1： - 脾臓のために1を希釈します。プレートきちんとホモジネートと重複の両方の希釈液。 </li></ol></li><li>スプレッドサンプルを簡単に乾燥することができます。 </li&gt; <li>一晩静37℃のインキュベーターにTSAプレートと場所を反転。 </li><li>プレートの両側から、各希釈から細菌コロニーを平均化することにより、コロニー形成細菌の数を決定します。全組織のCFUを決定するために、肺のために5ミリリットルおよび脾臓のための2ミリリットルの初期希釈液の要因。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

細菌性肺炎のマウスモデルは、遺伝子ターゲティングでおよびin vivo生物学的および薬理学的な介入で提携し、肺の宿主防御応答に重要な洞察を提供しています。大きな進歩は、感染した空域10,11に好中球の動員を支配するケモカインおよび接着分子の我々の理解に特になされてきた。肺炎のインビボのモデルを、細胞ベースまたは代替的なアプローチとは異なり、また、内分泌へのキーの洞察を提供してきました感染した肺と肝臓（急性期応答）などの他の臓器との間で発生する通信12および副腎（ストレスグルココルチコイド）13。最後に、in vivoでの肺炎モデルによって明らかにされ、臨床的に重要かつ関連性の高いポイントが成功した病原体のクリアランスがホストの成功に等しいではないということです。多くの場合、過剰に豊富な免疫応答は、宿主の死につながる可能性がありでも成功した病原体のクリアランス8,14の顔における過度のバイスタンダー肺損傷に起因。この指定された、病原体のクリアランス及び免疫応答の並列測定が一般的に最...

市中肺炎は、ワクチン接種の改善および抗生物質戦略1,2にもかかわらず、過去40年間の死亡率にはほとんど全体的な変化で、米国での感染による死亡の主要な原因のまま。公衆衛生レベルでの知覚進歩性の欠如にもかかわらず、近年の飛躍的な進歩は、前方肺感染症のマウスモデルを使用することによって可能になったこれらのステップの多くは、肺炎の分子や細胞病因の我々の理解で行われています。マウスの遺伝的扱いやすさは、マウスおよびヒトの免疫システム、及び商業的に利用可能になっているネズミ標的免疫学的試薬の広大な配列の類似性は、一緒にフィールドの急速な進歩を促進しました。 文献に記載された細菌性肺炎のマウスモデルは、一般的に病原体接種のための4つの技術的な経路の1つに依存してきた：ⅰ）エアロゾル化。 ⅱ）INTRanasal配達; ⅲ）経口配信。およびiv）外科的気管内注入（ すなわち 、気管切開）3。感染のすべてのルートは、長所と短所3を持っています。口鼻内細菌叢、全身麻酔のための要件の混合物のための特定の、相対的な上気道の暴露、潜在的には、遠位の肺に送達接種材料、配信病原体の葉の分布、技術的専門知識の要件、および手続き罹患率の変動は、これらの全体に広く変化しますアプローチ。 一般的に使用される経口感染手法は「ブラインド」（非可視化）の手法のいずれかを経由して、または直接喉頭可視化3-5の下で気管内（translaryngeal）カニュレーションが含まれます。どちらの方法は、堅牢ながら、かなりの訓練を必要とし、また、上気道に外傷が生じるおそれがあります。本報告書では、wは、経口感染の技術的、非集中的な非侵襲的、安価で、かつ迅速な方法を記述するここに細菌（提供された例で肺炎桿菌 ）、麻酔したマウスの中咽頭内にピペットを吸引（ すなわち 、吸入）を経由して肺に送達されています。我々と他の人が成功し6-9誤嚥性肺炎の技術を使用しています。この汎用性と簡単に学習した肺の配信方法は、サイトカインおよび他のタンパク質、病原体関連分子（ 例えば 、リポ多糖）、細胞（ すなわち 、養子移入）を含む肺に多くの追加の非苛性薬剤の送達に拡張することができますおよび毒素（ 例えば 、ブレオマイシン）。重要な技術的な考慮事項を議論することに加えて、我々はまた、下流の細菌クリアランスの測定（ すなわち 、コロニー形成単位[CFU]肺及び末梢器官における定量化）および白血球を含む、肺炎に続いて宿主応答を評価するための統合された、定量的アプローチを説明します空域における蓄積。

<table><tbody><tr><td>肺炎桿菌、血清型 2</td><td>ATCC</td><td>43816</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン大豆ブロス</td><td>ベクトン ディッケンソン</td><td>211825</td><td></td></tr><tr><td>エクセル セーフレット IV カテーテル、18 G x 1 1/4 インチ</td> <td>クラフリン医療機器</td><td>MEDC-031122</td><td></td></tr><tr><td>ヘマ 3 ソリューション 1</td><td>フィッシャー</td><td>23-122-937</td><td></td></tr><tr><td>ヘマ 3 ソリューション 2</td><td>フィッシャー</td><td>23-122-952</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 固定剤</td><td>Fisher</td><td>23-122-929</td><td></td></tr><tr><td>27&frac12; ゲージ ツベルクリン注射器</td><td>Fisher</td><td>14-826-87</td><td></td></tr><tr><td>リチウム ヘパリン プラズマコレクター</td><td>Fisher</td><td>2675187</td><td></td></tr><tr><td>L 字型使い捨てスプレッダー</td><td>Lab Scientific</td><td>DSC</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS、pH 7.4</td><td>社内で調製</td><td>n/a</td><td>蒸留水(5L)、NaCl(40g)、KCl(1g)、Na2HPO4(5.75g)、KH2PO4(1g)&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td></td><td>NH4Cl(4.145g)、KHCO3(0.5g)、EDTA(18.6mg)を社内で調製したACK溶解緩衝液、蒸留水およびpH7.4で最大500mlに</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

市中肺炎は、主要な公衆衛生問題のままであるが、細菌性肺炎のマウスモデルは、最近、基礎となる細胞および分子病態の理解に重要な前臨床の進歩を促進した。 インビボのマウスモデルがで宿主防御応答の統合生理学と回復力をキャプチャ代替によって明らかにされていない方法は、ex vivoでのアプローチを簡素化。いくつかの方法が「ブラインド」と条件を可視化し、経皮的気管内挿管下エアロゾル、鼻腔内送達、経口気管内挿管を含むマウスにおける細菌の肺内接種のための文献に記載されています。すべてのメソッドは、相対的なメリットと制限があります。ここで、我々は、詳細には、マウスによって吸引（ すなわち 、吸入）含む細菌の気管内送達のための、非侵襲性の技術的、非集中、安価で、かつ迅速な方法を記載します一方、全身麻酔下咽頭内にピペット感染性接種物の。この方法は、非苛性生物・化学物質の多種多様の肺送達のために使用され、さらに肺の手順で最小限の経験と研究室のために、学ぶことは比較的容易であることができます。誤嚥性肺炎の方法を説明することに加えて、我々はまた、特に、in vivoでのマウスの肺の先天性免疫応答、後続をアッセイするためのステップバイステップの手順を提供し、細菌排除し、感染気道の細胞性免疫応答を定量する方法。肺炎の評価にこの統合とシンプルなアプローチは、肺先天性免疫の際に遺伝的および環境的操作の効果の迅速かつ堅牢に評価することができます。

C57BL / 6マウスを、K. 2000 CFUを感染させました肺への口腔咽頭吸引を経由してニューモニエ 43816（血清型2）。この用量では、マウスは通常、嗜眠、フリル毛皮、5〜10％の重量損失（ 図2A）を含む臨床症状12-24時間後に感染を示し始めます。 48~72時間後、感染内、マウスの多くは、典型的には、減少した活性を有する猫背姿勢の20％減量し、その結果の平均値が先行し、刺激に対する応答性を低下させる疾患及び病的状態の症状を示します。長い期間の研究は、Kの低用量を必要とするかもしれませんニューモニエ 。 Kの500 CFUの感染肺炎は、回復と体重増加は一日5-6（ 図2B）で始まると10〜15％の重量減少により特徴付けられる3-5 D感染後のピークより穏やかな病気をもたらします。体重を20％希の重量損失と、しばしば生存を予測しますLY回復に関連付けられています。 <p cla...

いくつかの方法は、マウスにおける細菌性肺炎をモデル化するための文献に記載されています。ここで、我々は、中咽頭にピペット細菌接種の吸引（ すなわち 、吸入）を介して肺炎を誘導するための非侵襲性の、安価で迅速な方法を記載します。肺の先天性免疫応答を評価するための下流の方法も詳しく説明されています。

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

この実験プロトコルの全体的な目的は、マウスにおいて細菌性肺炎を誘発し、それに続く肺内でのin vivo宿主防御反応を定量化するための、非侵襲的かつ技術的負荷の少ない手順を提供することです。この手法は、感染症および免疫学の分野において、感染に対する宿主応答を制御する遺伝子や分子経路に関する重要な疑問への回答に寄与します。この肺感染法の主な利点は、技術的な簡便さにあります。これにより、肺の手技に関する専門知識が少ない研究室であっても、肺の自然免疫応答を研究することが可能になります。バイオセーフティレベル2の施設において、K.pneumoniaeのグリセロールストックを融解し、細菌1 mLを50 mLのTryptic Soy Brothを含む500 mLの培養フラスコに転移します。この懸濁培養液を37 °C、200～225 RPMで一晩インキュベートします。翌朝、1〜5 mLの細菌培養液を、50 mLのトリプチケースソイブイヨンを含む新しいフラスコに希釈し、対数増殖期に達するまで、シェーカーを用いて37 °Cでさらに2.5時間培養します。2回目の培養終了後、2番目の培養液から1 mLの細菌を1.5 mLチューブに移し、遠心分離を行います。ペレットを乱さないように上清を除去し、1 mLの滅菌生理食塩水で細菌を緩やかに再懸濁させ、この洗浄工程を3回繰り返します。3回目の洗浄後、細菌をさらに1 mLの滅菌生理食塩水に再懸濁し、接種液の対数段階希釈系列を作成します。洗浄したK.pneumoniaeのOD600を決定するため、10倍希釈および100倍希釈液をそれぞれ1 mLずつ使い捨てキュベットに分注し、2回ずつ測定します。OD600が1.0であることは、おおよそ1 mLあたり4～7 × 10⁸ CFUに相当します。各希釈液中の細菌濃度を算出した後、8〜12週齢の受容動物1匹あたり50〜60 µLの滅菌生理食塩水に、目的の接種用CFU量を再懸濁します。動物に細菌を投与するには、投与用接種液をP200ピペットチップで吸い上げ、麻酔したマウスを、傾斜させたPlexiglasボードのペグ間に張ったゴムバンドで上顎切歯で吊り下げ、半臥位の仰向けの状態にします。鈍端の溝のないピンセットを用いて、舌を優しく横に寄せ、舌や口腔咽頭に外傷を与えないように注意しながら、動物の口腔内に投与量を注入します。舌を後方に引いたまま、マウスが2〜3回吸入するまで、手袋を着用した指で優しく鼻を塞ぎます。口腔内に液体が見えなくなったら、マウスが回復する間に鼻孔が塞がるのを防ぐため、接種ボードからケージへ仰向けの状態のまま移動させます。胸骨の直下を縦方向に切開します。次に、ピンセットで胸骨を持ち上げ、横隔膜に切り込みを入れ、肺が胸腔内に戻るようにします。血管系の両側から胸腔に向かって切開を続け、頸部まで進めます。気管が見えたら、頸部の中央を慎重に切断し、周囲の血管系を傷つけないよう組織を横に押し除けます。次に、頭部から約4分の1の位置で気管に切り込みを入れ、1 mLのPBSをあらかじめ充填した1 mLシリンジに接続したカニューレを気管に尾側方向に挿入します。肺のすべての葉が膨らむように、ゆっくりと液体を注入してください。その後、シリンジで液体を回収し、回収した洗浄液を氷上の15 mLチューブにまとめます。適切な実験終了時点で、凝固を防ぐために左心室から血液を採取し、ヘパリン処理済みのチューブに移します。次に、すべての肺葉を5 mLのPBSを含む15 mLチューブに、脾臓を2 mLのPBSを含む15 mLチューブにそれぞれ採取します。続いて、サンプルごとに使い捨てのホモジナイザーを用い、氷上で組織をすり潰した後、組織懸濁液を段階希釈します。希釈液を1枚のTSAプレートの両側にそれぞれ2連（duplicate）で播種し、サンプルを短時間乾燥させます。次にプレートを反転させ、37 °Cの静置インキュベーターで一晩培養し、翌朝、プレートの両側および各希釈段階から細菌コロニー数を算出して平均値を求めます。K.pneumoniaeが2000 CFUの場合、通常、感染後12〜24時間でマウスに臨床症状が現れ始めます。48時間から72時間以内に、多くの動物が疾患および罹患の症状を示し、通常はその前に平均20％の体重減少が見られます。しかしながら、LD50用量を用いることで、実験群内における生存率の相対的な上昇および低下の両方を検出できるため、長期的な研究にはこちらが好まれる場合があります。K.pneumoniaeによる下気道感染では、感染後6時間以内に白血球が気道へ強力に流入し、24時間でピークに達し、その大部分を好中球が占めることが特徴です。K.pneumoniae感染後の24時間および48時間の両方の時点で、気管支肺胞洗浄液中にサイトカインが検出され、これにより肺の微小環境および細菌侵入に応答した免疫細胞の自己動員に関する知見が得られます。また、肺、血液、および脾臓における細菌量も、感染後24時間から48時間にかけて劇的に増加します。経口咽頭吸引による肺感染手法を習得し、適切に実施すれば、マウス1匹あたりわずか1〜2分で完了させることができます。この手順を行う際は、吸引量を多くしすぎないことが重要です。生後8～12週のマウスでは、通常50～60 µLの量が適切です。本手順の後、肺および末梢組織に対してさまざまな解析法を実施することで、病原体排除における免疫応答の定量が可能となります。このビデオを視聴することで、経口咽頭的な病原体投与による実験的細菌性肺炎の誘発方法と、マウスにおける病原体量の測定方法について十分に理解することができます。微生物を扱う際は危険が伴うため、この手順を実行する際は常に基本的なBSL-2の予防策と慣行を遵守してください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

インフルエンザウイルスとの同時感染は無症候性の中に侵襲性肺炎球菌疾患の誘導に関与する要因の一つです。...

の間に相乗効果を調査するために生物発光イメージングを使用して肺炎球菌幼児マウスで>とインフルエンザウイルス

出典: Mendspacher, J. H. および Fessler, M. B.マウスにおける実験的な細菌性肺炎の誘導および表現型解析のための非侵襲的かつ技術的に非集中的な方法です。 J. Vis. Exp.

感染研究のためのマウス脾臓における細菌負荷の評価

このビデオは、免疫適格なげっ歯類モデルで、挿管と肺葉への細菌懸濁液の設置による肺感染の確立を示しています。このモデルにより、免疫適格動物での抗菌効果試験が可能になります。...

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肺炎球菌は、重症市中肺炎、世界中200万人以上の死亡の原因を引き起こす主要な病原体である。フィットネスまたは病原性に関与する細菌性因子の影響は、生物発光細菌を用いて、マウスの急性肺炎または菌血症モデルにおいてリアルタイムでモニターすることができる。...

生物発光細菌を使用してリアルタイムに急性肺炎のマウスモデルにおける肺炎球菌の毒性因子の影響を以下の

病原体感染に対する宿主の免疫応答が厳密に調節されたプロセスである。マウスにおけるリポ多糖肺露光モデルを利用し、それは疾患の病因に関連付けられている複雑な機構の高解像度の評価を実施することができる。...

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

マウスの下気道へのインフルエンザ菌の気管内接種手順を実演します。これは、マウスモデルで気道の炎症を調節するシグナル伝達経路を研究するための非常に有用なツールです。...

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

免疫能力のあるげっ歯類における肺感染症の確立方法が説明されています。熟練度があれば、この方法は迅速かつ容易に実行でき、肺炎球菌、インフルエンザ菌、緑膿菌、肺炎菌、バウマニー菌の多くの分離株で安定した感染を誘発することができます。...

免疫担当げっ歯類で堅牢な肺炎モデルはに対して抗菌有効性を評価するために<i&gt; S。ニューモニエ</i&gt;、<i&gt; H。インフルエンザ</i&gt;、<i&gt; K。ニューモニエ</i&gt;、<em&gt; P。緑膿菌</em&gt;または<em&gt; A。バウマニ</em

感染性肺炎は人間の最も一般的な感染症の一つです。生体内で適切なモデルは、疾患病態の理解と治療の有効性をテストに不可欠です。このマウスの咽頭吸引性肺炎モデル病態とこれらの致命的な感染症に対する新しい治療法を調べることが 1...

人工呼吸器関連および院内の細菌性肺炎のマウスの咽頭吸引モデル

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

ここでは、病原体の回復と転写解析に続いて下気道への浸入経路を非侵襲的に提供することにより、二次細菌性肺炎研究を改善する方法を提示する。これらの手順は再現可能で、カニューレ、ガイドワイヤー、光ファイバケーブルなどの特殊な機器なしで実行できます。...

二次細菌性肺炎のマウスモデルに対する精密病原体送達と回復システム

この原稿では、マウスにおける肺炎の感染モデルの確立と、それぞれの損傷解決の特徴付け、および細菌の増殖と気管内注入の方法について説明しています。また、高次元フローサイトメトリーを用いた免疫状況の評価に関する新しいアプローチについても説明します。...

肺炎の治安を評価するための実験モデル

学ぶマウスの細菌性肺炎誘導法。咽頭吸引による非侵襲的なK. pneumoniae接種と肺免疫応答の定量解析手法を解説。感染症・免疫学研究に有用で、技術的負担が少なく初心者にも実施可能です。

マウスにおける実験的細菌性肺炎の誘導と表現型のための非侵襲的および技術的に非集中的な方法

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