タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別
February 25th, 2012
タンデムアフィニティー精製は、タンパク質の結合パートナーを同定するための堅牢なアプローチである。コンセプトの証明として、この方法論は、翻訳開始に関与する共沈物宿主細胞因子に十分に特徴付けられた翻訳開始因子eIF4Eに適用した。このメソッドは、簡単に任意の細胞またはウイルスのタンパク質に適合されている。
この手順の全体的な目標は、タンデムアフィニティー精製として知られる方法を使用して、タンパク質結合パートナーを単離することです。こんにちは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのウイルス学部門のdLANベイリーです。私たちの研究室では、ウイルスファミリーのさまざまなメンバーのウイルス宿主の相互作用に取り組んでいます。
他の細胞タンパク質やウイルスタンパク質と相互作用するタンパク質を同定することは、感染時のウイルスとその宿主との相互作用を調査するための優れた出発点となります。このビデオでは、私たちの研究室で使用しているアプローチの1つであるタンデム精製と電子精製、またはタップタギングについて説明します。この研究で使用したTapタグは、2ユニットのタンパク質Gと連鎖球菌アジン結合ペプチドからなるN末端タグです。
これらは、ベイトタンパク質の特異的溶出を可能にするA TEVプロテアーゼ切断配列によって分離されます。この例では、マウス、EIF 4 E は、この融合コンストラクトの C 末端にあります。タップタギングプロトコルは、6つのステップからなる手順です。
トランスフェクションおよび細胞株の作製後、細胞は軽度の溶解バッファーに横たわる前に、タグ除去タンパク質を発現するように誘導されます。2つのアフィニティー精製ステップと2つの特異的溶液を使用して、ベイトと相互作用する可能性のあるパートナーを精製し、細胞株を生成します。HEC 2 93細胞は、Pが4発現ベクターをエンコードしてトランスフェクトする必要があります。
次に、タップタグ付きベイトタンパク質細胞を100マイクログラム/milのハイグロマイシンBで選択します。プラスミドはエピソに維持されるため、特定のクローンを単離する必要はありません。10マイクロモルの塩化カジウムで16時間処理することにより、10個のコンフルエントフラス細胞を誘導してから培地に掻き取ります。次に、懸濁した細胞を15 Mチューブに移し、細胞を遠心分離によってペレット化します。
次に、これらの細胞を氷冷PBSで3回洗浄してから、最終的にペレット化します。ステップ2の細胞溶解細胞は、5ミルの冷溶解バッファーにピペッティングを繰り返して置いてから、5分間氷上に放置します。効率的な溶解を確実にするために、細胞は細いゲージの鈍い針を通して注射され、凍結融
解されます。得られたセートは、1.5ミルのチューブとunli細胞および破片に割り当てられ、遠心分離によって除去されます。注目すべきは、この遠心分離ステップの後、ペレットサイズが著しく減少することです。次に、ライセート上清を15ミルのFalconチューブに結合し、0.45マイクロメートルのフィルターに通して、追加の破片を除去します。
このライセートの50マイクロリットルのアリコートは、その後の分析のために服用する必要があります。このサンプルは、サンプル 1 と呼ばれます。ステップ3、ウサギIgGエアロスへの結合。
プロトコールのこの段階では、タンパク質GタグはウサギIgGアロスによって免疫沈殿します。arosビーズを割り当てるには、類人猿の先端を取り外します。これにより、ビーズの損傷を防ぐことができます。
ウサギのIgG aro溶液をボトルを回転させて穏やかに再懸濁してから、arosを15ミルチューブに取り出します。低温遠心分離機を用いて冷却した溶解バッファーでarosを3回洗浄し、各ステップでビーズを清澄化します。ペレット状にしたウサギIgGビーズは、遠心分離後に見えるはずです。
各ステップの後、ビーズを乱さずにバッファーを慎重に取り外します。最終洗浄が完了したら、ろ過して清澄化したライセートを充填したビーズに加え、3時間または一晩インキュベートします。回転ミキサーを使用して4°Cで好まれました。
免疫沈降後、アグロスビーズをスピンダウンし、上清を除去してその後の分析に使用します。必要に応じて、細いビルドチップを使用して、このチューブから残っている液体を取り除くことができます。この上清は、サンプルの2ステップ4TEVプロテアーゼ切断です。
このステップでは、ベイトをタンパク質Gタグから切断します。このステップにより、ベイトタンパク質の特異的な切断が効果的に可能になり、ウサギのIgGアロス免疫沈降からの溶出ステップが可能になります。TEV切断ミックスを調製し、これを端部を取り除いたエイプチップを使用してアロスビーズに加え、この混合物をシリコン処理されたマイクロ遠心チューブに移し、アロスを懸濁液に混合するために反転させ、4°Cで一晩インキュベーションする前に、このTEV切断反応のアリコを除去して分析します。
これはサンプル 3 です。回転ミキサーで一晩インキュベートすると、TEV反応がほぼ完了まで進行するはずです。ステップ5、ストレプトアディンビーズを固定するための結合。
このステップでは、Cleveベイトと潜在的な結合パートナーを溶液からアフィニティー精製します。まず、ウサギのIgGアロスビーズを含むTEV切断反応を遠心分離します。arosをペレット化するには、分析のために清澄化された上清のOTTを除去します。
これはサンプル 4 です。餌タンパク質を含む残りの上清をすべて新しいチューブに慎重に取り除きます。繰り返しますが、問題ありません。
考えられるすべての上澄みを取り除くためのペッペチップを作成します。ウサギのIgG arosビーズは、その後の分析のために保持してください。これがサンプル 5 です。
連鎖球菌アジンビーズの損傷を防ぐため、ペットチップの端を取り外してください。ビーズを静かに再懸濁し、シリコン処理されたチューブにアリコを取り除きます。ビーズ状連鎖球菌をS緩衝液で洗浄し、低速遠心分離により清澄
化します。各洗浄後。各洗浄後、バッファーを慎重に取り外します。Strept アディンビーズは非常に小さく、細かいものでも簡単にずれることができます。
ペットのヒントを作る。ストレプトされたアディンビーズが洗浄された後。TEV切断反応からの上清をこれらのビーズに加え、回転ミキサーを使用して4°Cで反応を3時間または一晩インキュベートします。
インキュベーション後、遠心分離機はビーズをストリープし、sup natumを除去します。これはサンプル 6 です。注目すべき点です。
Beitタンパク質は、チューブ内の残りのビーズと結合しています。ベイトタンパク質を含むストレプトアビジンビーズを溶解バッファーで洗浄します。追加の汚染タンパク質を除去するには、ビーズから残りの洗浄液を取り除き、氷の上に置いておきます。
ステップ6、ビオチン溶出。このステップでは、ビオチンをストレプトアビジンビーズに添加します。ビオチンとストレプトアビジンビーズとの相互作用により、餌が置換され、餌は溶液に戻ります。
ビオチン溶液をビーズに直接加え、反転させて混合します。回転ミキサー遠心分離機、ビオチンエアロス混合物を使用して、反応を4°Cで3時間または一晩インキュベートし、混合物を新しいチューブに慎重に収集します。これは、サンプル 7 と呼ばれる最終的な EIT です。
残りのストレプトハベインビーズはサンプル8です。タンパク質濃度が低いため、この最終溶出液は分析前に濃縮する必要があります。これは、低分子量を使用して達成され、スピンカラムを切断し、遠心分離によって体積を減らし、プロセスを定期的に監視します。
この濃縮サンプルは、クマシおよびシルバーステインによってSDSページゲル上で分割および分析できます。サンプルを質量分析で分析する場合は、市販のプレキャストゲルを使用することをお勧めします。その後、個々のバンドを抽出し、質量分析によってタンパク質を同定できます。
この場合、餌はマウス、Eタンパク質のEIFでした。TAPシステムの利点は、目的のタンパク質を特定の細胞株に発現させる能力があり、関心のある細胞株によっては、比較的低いレベルでタンパク質を発現させる能力も得られることです。あなたが決定し、すべての翻訳後の変更とローカリゼーションが保持されるため、多くの場合、ネイティブコンプレックスを精製できます。
概要
タンデムアフィニティ精製はタンパク質の結合パートナーを同定するための強力な技術です。この方法は翻訳開始因子eIF4Eに適用され、翻訳開始に関与する宿主細胞因子を共沈澱しました。
主要な研究構成要素
科学の分野
- ウイルス学
- タンパク質相互作用研究
- 細胞生物学
背景
- タンデムアフィニティ精製（TAP）はタンパク質複合体を分離するために使用される方法です。
- TAPタグはタンパク質Gとストレプタビジン結合ペプチドで構成されています。
- この技術により、ベイトタンパク質の特定の溶出が可能になります。
- タンパク質相互作用の理解はウイルス-宿主動態の研究に不可欠です。
研究の目的
- 翻訳開始因子eIF4Eと相互作用するタンパク質を分離し、同定すること。
- 感染時のウイルスタンパク質と宿主タンパク質の相互作用を調査すること。
- 様々なタンパク質に対するTAP法の適応性を示すこと。
使用された方法
- TAPタグ付き発現ベクターによるHEC 293細胞のトランスフェクション。
- ウサギIgGとストレプタビジンビーズを用いた細胞溶解と精製。
- ベイトタンパク質の特定の溶出のためのTEVプロテアーゼ切断。
- サンプルの純度を確保するための多段階の洗浄と遠心分離。
主要な結果
- eIF4Eとその相互作用パートナーの成功的な分離。
- タンパク質複合体同定におけるTAP法の効率性の実証。
- 翻訳開始に関与する潜在的な宿主因子の同定。
- 他のタンパク質に対する方法の適応性の検証。
結論
- タンデムアフィニティ精製はタンパク質相互作用を研究するための効果的なアプローチです。
- この方法は様々な細胞およびウイルスタンパク質に適用できます。
- これらの相互作用の理解はウイルス病原性への洞察を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Identifying protein-protein interactions is a foundational step in target validation and mechanistic de-risking for biopharma discovery programs. Tandem affinity purification (TAP) enables the isolation of native protein complexes under near-physiological conditions, supporting confident target engagement and pathway mapping. This approach reduces false positives in early screening and improves predictive confidence for lead identification campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating direct and indirect binding partners of bait proteins like eIF4E.
- Operational Value: Supports functional target validation through identification of known complex members such as eIF4G, 4EBP-1, eIF4A, and Poly-A binding protein.
- Predictive Value: Enhances portfolio triage by distinguishing specific interactors from background using TAP-tag alone controls.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by capturing endogenous complexes with preserved post-translational modifications.
- Operational Value: Enables assay standardization and reproducibility through defined elution steps (TEV protease and biotin) and stringent washing protocols.
- Scalability: Supports platform reuse across cell lines via episomal plasmid expression, avoiding clonal line generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by studying eIF4E in cap-dependent translation initiation, a pathway dysregulated in cancer and viral infection.
- Preclinical Alignment: Connects discovery findings to mechanistic de-risking by identifying secondary interactors that inform pathway context.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying target mechanism and complex integrity before lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
TAP fits within the discovery continuum from target engagement assays to preclinical validation, particularly for targets where native complex integrity is critical for function.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating eIF4E-associated complexes under inducible expression.
- Screening: Delivers assay readiness through quantitative outputs via mass spectrometry-identifiable bands following SDS-PAGE separation.
- Analytics: Enables comparative condition analysis through specific elution steps that reduce non-specific binding.
- Translational Research: Connects to biomarker alignment by identifying translation initiation factors relevant to oncogenic signaling.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for multiple bait proteins due to modular TAP tag design and episomal expression system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity, and native complex preservation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability across cell lines and bait proteins.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk through early complex characterization.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on validated interactome data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, transient transfection, and affinity purification techniques.
- Depends on access to centrifugation, rotating mixers, protease inhibitors, and mass spectrometry infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tag design, induction protocols, and wash stringency.
- Involves adaptation considerations for different bait proteins, expression levels, and subcellular localization.
- Includes practical limitations such as potential tag interference and the need for optimization of induction timing and lysis conditions.
