タンデムアフィニティー精製を用いたタンパク質相互作用するパートナーの識別

この手順の全体的な目的は、タンデムアフィニティー精製として知られる手法を用いて、タンパク質結合パートナーを単離することです。こんにちは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのウイルス学部門のdLAN Baileyです。私たちの研究室では、ウイルス科のさまざまなメンバーにおけるウイルスと宿主の相互作用について研究しています。

他の細胞内タンパク質やウイルスタンパク質と相互作用するタンパク質を特定することは、感染過程におけるウイルスと宿主の相互作用を調査するための優れた出発点となります。このビデオでは、私たちの研究室で使用しているアプローチの一つである、タンデム親和性精製（TAPタギング）について解説します。本研究で使用されるTAPタグは、2ユニットのプロテインGとストレプトアビジン結合ペプチドで構成されるN末端タグです。

これらはTEVプロテアーゼ切断配列によって分離されており、これによりベイトタンパク質の特異的な溶出が可能になります。この例では、マウスEIF4Eがこの融合構築物のC末端に位置しています。TAPタグ付けプロトコルは、6つのステップからなる手順です。

トランスフェクションおよび細胞株の作製後、穏やかな溶解バッファーで溶解させる前に、タグ付きベイトタンパク質を発現するように細胞を誘導します。ベイトおよび潜在的な相互作用パートナーを精製して細胞株を生成するために、2段階のアフィニティー精製と2種類の特異的溶液が使用されます。HEK 293細胞に、コード配列を含むpMET4発現ベクターをトランスフェクションする必要があります。

次に、TAPタグ付きベイトタンパク質を発現する細胞を、100 µg/mLのハイグロマイシンBで選別します。プラスミドはエピソーマとして維持されるため、特定のクローンを単離する必要はありません。コンフルエントになった10本の細胞培養フラスコを、10 µMの塩化カドミウムで16時間処理して誘導し、その後、培地を用いて細胞を剥離させます。懸濁した細胞を15 mLチューブに移し、遠心分離によって細胞ペレットを回収します。

次に、これらの細胞を氷冷PBSで3回洗浄し、最終的にペレット化します。ステップ2の細胞溶解では、ピペッティングを繰り返すことで細胞を5 mLの冷 lysis buffer で溶解し、その後氷上で5分間静置します。効率的な溶解を確実にするため、細胞を細いゲージの鈍端針でシリンジに通し、凍結融解を行います。

得られた溶解液を1.5 mLチューブに分注し、遠心分離によって未溶解細胞およびデブリを除去します。なお、この遠心分離ステップの後、ペレットのサイズは著しく減少します。次に、溶解液の上清を15 mL Falconチューブにまとめ、0.45 µmフィルターに通して、さらなるデブリを除去します。

この溶解液から50 µLずつ分注し、その後の分析に用います。このサンプルをサンプル1と呼びます。ステップ3、ウサギIgG Aerosへの結合です。

プロトコルのこの段階では、ウサギIgG Arosを用いてプロテインGタグを免疫沈降させます。Arosビーズを分注する際は、パイペットチップの先端をカットしてください。これにより、ビーズの損傷を防ぐことができます。

ボトルを回旋させてrabbit IgG aro溶液を穏やかに再懸濁し、その後arosを15 mLチューブに移します。冷却した溶解バッファーでarosを3回洗浄し、各工程で低速遠心分離を行いビーズを清浄にします。遠心分離後、ペレット状になったrabbit IgGビーズが視認できるはずです。

各ステップの後、ビーズを乱さないように注意してバッファーを除去します。最終洗浄が完了したら、ろ過および清澄化したライセートを充填したビーズに加え、3時間または一晩インキュベートします。回転ミキサーを用い、4 °Cで行うことが推奨されます。

免疫沈殿後、アガロースビーズを遠心分離し、後の解析のために上清を除去します。必要に応じて、チューブ内に残った液体を取り除くために細いチップを使用してください。この上清は、サンプル2のステップ4であるTEVプロテアーゼ切断に使用します。

このステップでは、ベイトをプロテインGタグから切り出します。このステップにより、ベイトタンパク質の特異的な切断が可能となり、実質的にウサギIgGアガロース免疫沈降からの溶出ステップとなります。TEV切断ミックスを調製し、先端を取り除いた pipette tip を用いてこれをアガロースビーズに加えます。この混合物をシリコン化マイクロ遠心チューブに移し、倒立混和してアガロースを懸濁させた後、4 °C で一晩インキュベートします。分析用に、この TEV 切断反応液の一部を分取します。

これはサンプル3です。ロータリーミキサーで一晩インキュベートすることで、TEV反応をほぼ完了させることができます。ステップ5では、ストレプトアビジンビーズに結合させ、固定化を行います。

このステップでは、溶液中からCleveベイトおよび潜在的な結合パートナーをアフィニティー精製します。まず、ウサギIgG arosビーズを含むTEV切断反応液を遠心分離します。arosをペレットにするため、清澄化した上澄みを分析用にOTT分採取します。

これがサンプル4です。ベイトタンパク質を含む残りの上清をすべて、慎重に新しいチューブに移します。ここでも、ファインチップを使用してください。

ピペットチップを加工し、上清を可能な限りすべて除去します。後続の解析のために、rabbit IgG aros beadsを回収してください。これがサンプル5となります。

Strep-avidinビーズの損傷を防ぐため、ピペットチップの先端をカットします。ビーズを穏やかに再懸濁させ、シリコン処理済みチューブにアリコートします。SバッファーでStrep-avidinビーズを洗浄し、低速遠心分離によって上清を回収します。

各洗浄後。各洗浄後、バッファーを慎重に取り除きます。ストレプトアビジンビーズは非常に小さく、細いチップを使用しても容易に流出する可能性があります。

ビーズを構築します。Strept adinビーズの洗浄後、TEV切断反応の上清をこれらのビーズに加え、ロータリーミキサーを用いて4 °Cで3時間または一晩インキュベートします。

インキュベーション後、遠心分離してstreptavidinビーズを回収し、上清を除去します。これがサンプル6となります。なお、注意点として。

ベイトタンパク質は現在、チューブ内の残りのビーズに結合しています。ベイトタンパク質を含むストレプトアビジンビーズを溶解バッファーで洗浄します。その他の汚染タンパク質を除去するために、ビーズから残りの洗浄液を取り除き、氷上に置いたままにします。

ステップ6、ビオチンの溶出。このステップでは、ストレプトアビジンビーズにビオチンを添加します。ビオチンとストレプトアビジンビーズの相互作用によりベイトが置換され、溶液中に戻ります。

ビオチン溶液をビーズに直接加え、転倒混和します。回転ミキサー遠心機を用いて、4 °Cで3時間または一晩、反応液をインキュベートします。ビオチンエアロス混合物を慎重に新しいチューブに回収します。これが、サンプル7と呼ばれる最終的なEITとなります。

残りのstrept haveinビーズはサンプル8となります。タンパク質濃度が低いため、この最終溶出液は分析前に濃縮する必要があります。これは、低分子量カットオフ（MWCO）のスピンカラムを用い、定期的にプロセスをモニタリングしながら遠心分離によって液量を減らすことで行います。

この濃縮サンプルを分注し、SDS-PAGEゲルを用いてクマシー染色および銀染色により分析することができます。質量分析で分析する場合は、市販のプレキャストゲルの使用を推奨します。その後、個々のバンドを切り出し、質量分析によってタンパク質を同定することが可能です。

本ケースでは、ベイトとしてマウス由来のEタンパク質に対するEIFを用いました。Tandem Affinity Purification (TAP) システムの利点は、目的のタンパク質を特定の細胞株で発現させることができ、さらに選択した細胞株に応じて、タンパク質を比較的低レベルで発現させることが可能である点です。これにより、翻訳後修飾や局在性が保持されるため、多くの場合、天然の複合体を精製することができます。