バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

低分子タンパク質相互作用の同定は、医薬品の研究開発だけでなく、ウイルスDTCの根底にある病理学的メカニズムの理解を深めるために不可欠です。この方法により、薬物認識ペプチドのハイスループットバイオパニングと、目的の低分子薬物のタンパク質上の薬物結合部位の全体的な検証が容易になります。QCMセンサーチップを準備するには、セラミックセンサーチップを27メガヘルツQCM装置の発振器に取り付け、小分子を固定化する前に気相の固有周波数を記録します。

記録後、チップを取り外し、70%エタノール中の1ミリモルの小分子誘導体溶液を20マイクロリットルの滴で慎重に追加して、センサーチップの金電極上に自己組織化モノ層を作成します。湿らせたティッシュを敷いたペトリ皿にチップを入れ、室温で1時間光から保護した後、電極表面を超純水でやさしく洗浄します。空気を穏やかに塗布してチップを乾燥させ、チップをQCM装置にロードします。

1時間後、気相の周波数の減少を記録して、固定化された小分子の量を測定します。T7 Phage Library Biopanningについては、1000回転/分に設定されたQCMバイオセンサー上に専用のマグネチックスターラー付きキュベットを置き、キュベットに8ミリリットルの反応バッファーを加え、バッファーが攪拌されている間にQCMセンサーチップを発振器に取り付け、発振器のアームを押し続けてチップをバッファーに浸し、QCM周波数の監視を開始する。センサーのグラムが毎分約3ヘルツの周波数ドリフトに平衡化したら、8マイクロリットルのT7ファージライブラリをキュベットに注入し、センサーの注入ポイントをマークします。

T7ファージが金電極表面に固定化された小分子に結合することによって引き起こされる周波数低下を監視します。10分後、QCM周波数モニターを停止し、発振器をすばやく持ち上げてバッチからセンサーチップを取り外し、センサーチップを発振器から取り外し、バッファーをチップから取り外します。乾燥させたセンサーチップを湿ったシャーレに入れ、20マイクロリットルの対数相大腸菌宿主細胞を金電極に加えます。

96ウェルマイクロプレートミキサーに皿を摂氏37度、毎分1000〜1500回転で30分間インキュベートし、光から保護して結合したT7 7ファージの回復を促進します。インキュベーションの終わりに、20マイクロリットルの大腸菌懸濁液を200マイクロリットルのLB培地に移します。一般的な手順に従って、培地中のファージプラークの単離および各ファージカプシドに表示されたペプチド配列を認識する薬物をコードするDNAシーケンシングを行う。

センサーチップのアフターメンテナンスとして、1%ドデシル硫酸ナトリウム溶液を浸した綿棒を使用して電極表面を清掃し、金表面を超純水で洗浄し、電極を空気で乾燥させます。次に、電極表面を5マイクロリットルの新しく調製したパラナ溶液で5分間処理し、続いて超純水洗浄と2回の空気乾燥を行います。RELICを使用してバイオインフォマティクス解析を行うには、Windowsオペレーティングシステムを搭載したPCでスタンドアロンのRELICプログラムを解凍し、薬物選択のアミノ酸配列、15 merペプチド、または各テキストファイル内の単一または複数のタンパク質を高速A形式で使用します。

必要なテキストファイルをAA-div、info、motif、match、hetero align、fast A con、またはfast Aスキャンのフォルダに配置します。独立したフォルダ内の各実行可能ファイルをクリックしてFTN 95のパーソナルバージョンを開き、コマンドラインに適切なファイル名と拡張子を入力して各プログラムを実行し、結果のテキストフォーマットファイルを取得します。得られたテキスト形式のファイルを次に示します。

次に、結果のテキストファイルをスプレッドシートにエクスポートして、情報内容のプロットまたは約62の打撃を使用して計算された累積類似性スコアを生成します。この戦略を用いて、6種類の低分子医薬品について、標的タンパク質上の単一および複数の低分子結合部位を同定することに成功しました。例えば、臨床的に承認された薬物であるイリノテカンを固定化して自己組織化単分子膜として認識する29のペプチドを、QCMバイオセンサーに基づく1サイクルバイオパニングにより同定した。その後、29のペプチドとアセチルコリンエステラーゼのペアワイズアライメントにより、イリノテカン結合部位を構成するものと一致する特定のアミノ酸残基の最大スコアが得られた。

このペプチドの同じサブセットは、カルボキシルエステラーゼの触媒トライアドの近傍でも見事に同定され、これらのアミノ酸が脱エステル化中にイリノテカン認識の足場を形成していることを示しています。QCMセンサーチップの金電極表面を覆う抗インフルエンザ薬オセルタミビルを認識する27のペプチドは、ノイラミニダーゼのオセルタミビル結合部位を正常に検出しました。この結合部位は、オセルタミビルとドッキングしている間に動的に動く可能性のある非構造化ペプチドループで構成されています。

薬物、領域、化学物質、組換えバクテリオファージ、および細菌は生物学的霊柩車であり、培養ゲインプロトコルに従って取り扱う必要があります。安全のため、常に手袋、ゴーグル、白衣を着用することを忘れないでください。この手順により、さまざまな医薬品の標的タンパク質をヒト、病理学的ウイルス、さらには植物でグローバルに検証し、目的の医薬品の分子メカニズムと潜在的な治療効果を理解することができます。