定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング
November 15th, 2017
正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス ツールの組み合わせで品質管理手順と蛋白質を量的にプロトコルを提案します。
この実験の全体的な目標は、さまざまな薬物治療、時間経過、または生物学的条件にわたって、細胞または組織溶解物から10, 000を超えるタンパク質を特定し、正確に定量することです。この方法は、薬物やその他の生物学的刺激に反応してどのタンパク質が変化しているかなど、医学や生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、10の異なる実験条件で発現したプロテオームの70%以上を正確に定量する能力があることです。
この技術の意味は、潜在的なバイオマーカーの発見を通じて、ヒトの疾患の診断にまで拡張することができます。最適な細胞溶解と体液推定が下流の消化、標識、および分離手順において重要な役割を果たすため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。このプロトコールを開始するには、目的の培養細胞を入手してください。
各洗浄に10ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。洗浄した細胞をこすり落とし、1ミリリットルのPBSを含む1.5ミリリットルのチューブに集めます。600 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。
上清を取り除き、細胞を溶解する準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。解剖後すぐに目的の組織を採取し、秤量します。この後、すぐに液体窒素で保存し、摂氏マイナス80度で保存します。
実験当日に、テキストプロトコルに概説されているように、溶解バッファーを調製します。凍結サンプルに溶解バッファーを添加し、バッファーとサンプルの比率が10対1で、最終タンパク質濃度が1ミリグラムあたり5〜10ミリグラムになるようにします。次に、ガラスビーズを追加し、ブレンダーを使用してサンプルを摂氏4度で溶解し、30秒間ブレンドしてから5秒間休ませ、これを5回またはサンプルが均質化するまで繰り返すことで8回加速します。
標準的なタンパク質定量アッセイまたはBSAを標準としてCoomassie染色したSDSポリアクリルアミドゲルを使用して、タンパク質濃度を測定します。この後、最終濃度が10%で、Lys-Cプロテアーゼが酵素と基質の比率が1対100になるように100%アセトニトリルを添加します。室温で2時間インキュベートし、タンパク質の消化を待ちます。
次に、最終濃度が1ミリモルになるようにDTTを追加します。室温で1時間インキュベートします。次に、サンプル中の尿素濃度が2モルに希釈されるまで、50ミリモルHEPESを追加します。
トリプシンとタンパク質の比率が1対50で各サンプルにトリプシンを添加します。室温で少なくとも3時間インキュベートします。次に、DTTを再び1ミリモルになるまで加え、室温で2時間インキュベートします。
ヨードアセトアミドを最終濃度が10ミリモルになるように追加します。室温で30分間暗所でインキュベートします。この後、未反応のヨードアセトアミドをDTTを添加して、最終濃度が30ミリモルになるように急冷します。
室温で30分間インキュベートします。テキストプロトコルに概説されているように、トリプシン消化の効率を確認してください。次に、最終濃度が1%になるように各サンプルにTFAを添加しますpHストリップを使用して、各サンプルのpHを測定し、2〜3であることを確認します。
許容できないpHに達するために必要に応じて、TFAを慎重に追加します。サンプルを 20, 000 倍の g と室温で 10 分間遠心分離します。上清を採取し、調製したスピンカラムにサンプルをロードします。
100 g で 3 分間、またはサンプルがカラムを完全に通過するまで遠心分離してサンプルを結合します。次に、各列に0.5ミリリットルの0.1%TFAを追加します。500倍gで30秒間遠心分離します。
この後、60%アセトニトリルと0.1TFAを含む溶液125マイクロリットルを各カラムに加えます。100 g で 3 分間遠心分離し、ペプチドをカラムから溶出します。脱塩した各ペプチドサンプルを50ミリモルHEPESの50マイクロリットルに再構成します。
pHストリップを使用して、各サンプルのpHが7〜8であることを確認します。次に、TMT試薬を無水アセトニトリルに溶解し、サンプルに加えて、室温で1時間インキュベートします。この後、クロマトグラフィー媒体を埋め込んだ10マイクロリットルのピペットチップを使用して、各サンプルの1マイクログラムを脱塩し、テキストプロトコルに概説されているように標識効率を分析します。
6 〜 10 種類の別々のペプチドを検査して、標識されていないペプチドが標識サンプル中に検出されていないことを確認します。次に、各サンプルの約2マイクロリットルを混ぜ合わせます。クロマトグラフィー媒体を埋め込んだ10マイクロリットルのピペットチップを使用して、この混合物を脱塩します。
テキストプロトコルに概説されているように、LC-MS/MS でサンプルを分析します。まず、脱塩したプールされたTMT標識ペプチドサンプルを65マイクロリットルのバッファーAに可溶化します。pHストリップを使用して、pHが約8.0であることを確認します。サンプルがまだ酸性の場合は、必要に応じて水酸化アンモニウムを使用してpHを調整します。
次に、テキストプロトコルで概説されているようにサンプルを分画します。ロード時間を含めて2分ごとにフラクションを収集するようにフラクションコレクターを設定します。流量を0.4ミリリットル/分に設定します。
合計80個の分数を集めます。次に、真空濃縮器を使用して、他のすべてのサンプルを完全に乾燥させます。LC-MS/MS を使用して、80 種類のフラクションすべてを分析することで、非常に深いプロテオームカバレッジを達成します。
まず、1.9マイクロメートルのC18樹脂を内径75マイクロメートルの空のカラムに詰め込み、ベッド容積が約1.3マイクロリットルに達します。バタフライポートフォリオヒーター内でカラムを2〜3回巻き、全長が加熱されていることを確認します。ヒーターの温度センサーにテープを貼らないように、カラムをヒーターの内側にテープで固定します。
次に、カラムを摂氏65度に加熱します。100 ナノグラムのラット脳ペプチドを LC-MS/MS システムに通し、システムの品質を評価します。この評価をさらに 1 回繰り返します。
この後、再構成したペプチドの約0.2μgをカラムにロードし、5%バッファーA.ペプチドをカラムから溶出し、テキストプロトコルに概説されているように質量分析計で分析します。この研究では、10プレックス同重体標識戦略を用いたタンパク質の定量のためのハイスループット法について説明します。LC-MS/MS を使用して TMT 標識効率を調べ、TMT 標識サンプルと対応する非標識サンプルを分析します。
見てわかるように、非標識ペプチドピークは非標識サンプルにのみ見られ、TMT標識ペプチドピークは標識サンプルにのみ見られます。次に、MS2 アイソレーション ウィンドウが干渉に及ぼす影響を評価します。すべてのMS2スキャンは、クリーンスキャンまたはノイズの多いスキャンとして指定されます。
クリーンスキャンではリジンのy1イオンのみが示されますが、ノイズの多いスキャンではリジンとアルギニンの両方でリジンが見られます。ここでは、3種類のTMT試薬で個別に標識した大腸菌ペプチドを用いた代表的な干渉除去を示します。合計された相対強度から、y1 イオンベースの補正は TMT ベースの定量により正確であることがわかります。
このプロトコルを習得すると、適切に行えば4〜5週間で完了します。この手順を試行する際には、最終的なデータセットが可能な限り正確であることを確認するために、すべての品質管理手順が完全に完了していることを確認することが非常に重要です。この手順を翻訳後修飾に着目させることで、疾患の進行や薬物治療に応じてユビキチン化、リン酸化、アセチル化がどのように変化するかなど、他の疑問に答えることができます。
開発後、この技術は、製品分野の研究者が細胞や組織のタンパク質変化を探求する道を開きました。このビデオを見た後、哺乳類の細胞または組織から10, 000を超えるタンパク質を同定し、正確に定量する方法について非常によく理解しているはずです。高圧UPLCや少数のシリカカラムでの作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には常に安全ゴーグルの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。
この方法のアイデアを最初に思いついたのは、同重体ラベリングで発生する比率圧縮の既知の問題に取り組み始めたときでした。私たちは、広範な分画がこの問題を軽減するだけでなく、タンパク質やペプチドの同定を増加させ、プロテオーム分析をさらに増加させ、適応させる優れた方法であることに気づきました。
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概要
このプロトコルは、様々な条件下で細胞または組織溶解物から10,000以上のタンパク質を特定し、正確に定量化する方法を概説しています。等張標識、広範な分画、およびバイオインフォマティクスツールを活用して、タンパク質定量の精度を向上させています。
主要な研究構成要素
科学分野
- プロテオミクス
- 生化学
- 細胞生物学
背景
- タンパク質ダイナミクスの理解は生物学と医学において重要です。
- タンパク質の正確な定量化は、薬物や生物学的刺激に対する反応を明らかにすることができます。
- この方法は、ヒトの疾患のバイオマーカー発見を支援する可能性があります。
- 最適な細胞溶解と液体の推定は、成功した結果にとって重要です。
研究の目的
- 複数の実験条件にわたるタンパク質定量化のための信頼性の高いプロトコルを開発すること。
- 様々な処理に対する反応で変化するタンパク質を特定すること。
- 疾患診断のためのバイオマーカーの発見を促進すること。
使用された方法
- タンパク質定量化のための等張標識。
- 広範な分画技術。
- 高分解能質量分析法。
- データ分析のためのバイオインフォマティクスツール。
主要な結果
- 発現タンパク質の70%以上を定量化できる能力。
- 異なる条件下でのタンパク質変化の成功した同定。
- 様々な生物学的文脈におけるこの方法の効果の実証。
- バイオマーカー発見を通じた疾患診断への潜在的影響。
結論
- このプロトコルはタンパク質定量化のための堅牢なフレームワークを提供します。
- これはプロテオミクスおよび関連分野の研究を大幅に前進させる可能性があります。
- プロセスの重要なステップの理解を促進する視覚的デモンストレーション。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Deep proteome profiling enables comprehensive target validation by quantitating over 10,000 proteins across multiple experimental conditions, supporting mechanistic de-risking in early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing quantitative, reproducible data on protein expression changes in response to drug treatments or biological stimuli. This capability directly informs portfolio triage and risk-adjusted advancement decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through quantitative measurement of proteome-wide changes in response to perturbations.
- Operational Value: Supports functional target validation by identifying proteins modulated across drug treatments, time courses, or biological conditions.
- Predictive Value: Increases confidence in target selection by reducing mechanistic ambiguity through deep, multiplexed proteomic coverage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares standardized, quantitative biological systems for downstream compound screening and biomarker assay development.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility and scalability via extensive fractionation and interference correction for reliable readouts.
- Platform Value: Enables reuse across diverse sample types including cell culture, tissues, and clinical specimens for consistent proteomic profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational biomarker alignment by quantitating post-translational modifications in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation with robust, QC-protected data generation.
- Risk Mitigation: Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering quantitative, condition-specific proteomic landscapes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, enabling data-driven decisions at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantitating protein dynamics across experimental conditions.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs essential for reliable compound evaluation and structure-activity relationship mapping.
- Analytics: Generates multiplexed, interference-corrected quantitative readouts that enable statistical comparison of protein abundance across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through quantitation of post-translational modifications relevant to disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable proteomic profiling platform applicable to multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity through deep, quantitative proteome coverage.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability via extensive fractionation and computational interference correction.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early, data-rich target de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative, condition-specific proteomic responses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in proteomics, mass spectrometry, and bioinformatics for successful execution and data interpretation.
- Dependent on high-resolution LC-MS/MS infrastructure, fractionation systems, and computational tools for interference correction.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, labeling, and QC protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to post-translational modification analysis requires minor protocol adjustments but maintains core quantitative principles.
- Practical limitations include instrument access, data complexity, and the need for rigorous QC to mitigate ratio compression and ensure accuracy.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Preparation of Cells/Tissues
1:45
Protein Extraction, Quality Control Western Blotting, In-solution Digestion, and Peptide Desalting
4:45
TMT Labeling of Peptides
5:50
Extensive High-resolution, Basic pH LC Prefactionation
6:43
LC-MS/MS Preparation and Parameters
7:41
Results: Deep Proteome Profiling Analysis
8:45
Conclusion
