定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

この実験の全体的な目標は、さまざまな薬物治療、時間経過、または生物学的条件にわたって、細胞または組織溶解物から10, 000を超えるタンパク質を特定し、正確に定量することです。この方法は、薬物やその他の生物学的刺激に反応してどのタンパク質が変化しているかなど、医学や生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、10の異なる実験条件で発現したプロテオームの70%以上を正確に定量する能力があることです。

この技術の意味は、潜在的なバイオマーカーの発見を通じて、ヒトの疾患の診断にまで拡張することができます。最適な細胞溶解と体液推定が下流の消化、標識、および分離手順において重要な役割を果たすため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。このプロトコールを開始するには、目的の培養細胞を入手してください。

各洗浄に10ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。洗浄した細胞をこすり落とし、1ミリリットルのPBSを含む1.5ミリリットルのチューブに集めます。600 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。

上清を取り除き、細胞を溶解する準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。解剖後すぐに目的の組織を採取し、秤量します。この後、すぐに液体窒素で保存し、摂氏マイナス80度で保存します。

実験当日に、テキストプロトコルに概説されているように、溶解バッファーを調製します。凍結サンプルに溶解バッファーを添加し、バッファーとサンプルの比率が10対1で、最終タンパク質濃度が1ミリグラムあたり5〜10ミリグラムになるようにします。次に、ガラスビーズを追加し、ブレンダーを使用してサンプルを摂氏4度で溶解し、30秒間ブレンドしてから5秒間休ませ、これを5回またはサンプルが均質化するまで繰り返すことで8回加速します。

標準的なタンパク質定量アッセイまたはBSAを標準としてCoomassie染色したSDSポリアクリルアミドゲルを使用して、タンパク質濃度を測定します。この後、最終濃度が10%で、Lys-Cプロテアーゼが酵素と基質の比率が1対100になるように100%アセトニトリルを添加します。室温で2時間インキュベートし、タンパク質の消化を待ちます。

次に、最終濃度が1ミリモルになるようにDTTを追加します。室温で1時間インキュベートします。次に、サンプル中の尿素濃度が2モルに希釈されるまで、50ミリモルHEPESを追加します。

トリプシンとタンパク質の比率が1対50で各サンプルにトリプシンを添加します。室温で少なくとも3時間インキュベートします。次に、DTTを再び1ミリモルになるまで加え、室温で2時間インキュベートします。

ヨードアセトアミドを最終濃度が10ミリモルになるように追加します。室温で30分間暗所でインキュベートします。この後、未反応のヨードアセトアミドをDTTを添加して、最終濃度が30ミリモルになるように急冷します。

室温で30分間インキュベートします。テキストプロトコルに概説されているように、トリプシン消化の効率を確認してください。次に、最終濃度が1%になるように各サンプルにTFAを添加しますpHストリップを使用して、各サンプルのpHを測定し、2〜3であることを確認します。

許容できないpHに達するために必要に応じて、TFAを慎重に追加します。サンプルを 20, 000 倍の g と室温で 10 分間遠心分離します。上清を採取し、調製したスピンカラムにサンプルをロードします。

100 g で 3 分間、またはサンプルがカラムを完全に通過するまで遠心分離してサンプルを結合します。次に、各列に0.5ミリリットルの0.1%TFAを追加します。500倍gで30秒間遠心分離します。

この後、60%アセトニトリルと0.1TFAを含む溶液125マイクロリットルを各カラムに加えます。100 g で 3 分間遠心分離し、ペプチドをカラムから溶出します。脱塩した各ペプチドサンプルを50ミリモルHEPESの50マイクロリットルに再構成します。

pHストリップを使用して、各サンプルのpHが7〜8であることを確認します。次に、TMT試薬を無水アセトニトリルに溶解し、サンプルに加えて、室温で1時間インキュベートします。この後、クロマトグラフィー媒体を埋め込んだ10マイクロリットルのピペットチップを使用して、各サンプルの1マイクログラムを脱塩し、テキストプロトコルに概説されているように標識効率を分析します。

6 〜 10 種類の別々のペプチドを検査して、標識されていないペプチドが標識サンプル中に検出されていないことを確認します。次に、各サンプルの約2マイクロリットルを混ぜ合わせます。クロマトグラフィー媒体を埋め込んだ10マイクロリットルのピペットチップを使用して、この混合物を脱塩します。

テキストプロトコルに概説されているように、LC-MS/MS でサンプルを分析します。まず、脱塩したプールされたTMT標識ペプチドサンプルを65マイクロリットルのバッファーAに可溶化します。pHストリップを使用して、pHが約8.0であることを確認します。サンプルがまだ酸性の場合は、必要に応じて水酸化アンモニウムを使用してpHを調整します。

次に、テキストプロトコルで概説されているようにサンプルを分画します。ロード時間を含めて2分ごとにフラクションを収集するようにフラクションコレクターを設定します。流量を0.4ミリリットル/分に設定します。

合計80個の分数を集めます。次に、真空濃縮器を使用して、他のすべてのサンプルを完全に乾燥させます。LC-MS/MS を使用して、80 種類のフラクションすべてを分析することで、非常に深いプロテオームカバレッジを達成します。

まず、1.9マイクロメートルのC18樹脂を内径75マイクロメートルの空のカラムに詰め込み、ベッド容積が約1.3マイクロリットルに達します。バタフライポートフォリオヒーター内でカラムを2〜3回巻き、全長が加熱されていることを確認します。ヒーターの温度センサーにテープを貼らないように、カラムをヒーターの内側にテープで固定します。

次に、カラムを摂氏65度に加熱します。100 ナノグラムのラット脳ペプチドを LC-MS/MS システムに通し、システムの品質を評価します。この評価をさらに 1 回繰り返します。

この後、再構成したペプチドの約0.2μgをカラムにロードし、5%バッファーA.ペプチドをカラムから溶出し、テキストプロトコルに概説されているように質量分析計で分析します。この研究では、10プレックス同重体標識戦略を用いたタンパク質の定量のためのハイスループット法について説明します。LC-MS/MS を使用して TMT 標識効率を調べ、TMT 標識サンプルと対応する非標識サンプルを分析します。

見てわかるように、非標識ペプチドピークは非標識サンプルにのみ見られ、TMT標識ペプチドピークは標識サンプルにのみ見られます。次に、MS2 アイソレーション ウィンドウが干渉に及ぼす影響を評価します。すべてのMS2スキャンは、クリーンスキャンまたはノイズの多いスキャンとして指定されます。

クリーンスキャンではリジンのy1イオンのみが示されますが、ノイズの多いスキャンではリジンとアルギニンの両方でリジンが見られます。ここでは、3種類のTMT試薬で個別に標識した大腸菌ペプチドを用いた代表的な干渉除去を示します。合計された相対強度から、y1 イオンベースの補正は TMT ベースの定量により正確であることがわかります。

このプロトコルを習得すると、適切に行えば4〜5週間で完了します。この手順を試行する際には、最終的なデータセットが可能な限り正確であることを確認するために、すべての品質管理手順が完全に完了していることを確認することが非常に重要です。この手順を翻訳後修飾に着目させることで、疾患の進行や薬物治療に応じてユビキチン化、リン酸化、アセチル化がどのように変化するかなど、他の疑問に答えることができます。

開発後、この技術は、製品分野の研究者が細胞や組織のタンパク質変化を探求する道を開きました。このビデオを見た後、哺乳類の細胞または組織から10, 000を超えるタンパク質を同定し、正確に定量する方法について非常によく理解しているはずです。高圧UPLCや少数のシリカカラムでの作業は非常に危険であり、この手順を実行する際には常に安全ゴーグルの着用などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

この方法のアイデアを最初に思いついたのは、同重体ラベリングで発生する比率圧縮の既知の問題に取り組み始めたときでした。私たちは、広範な分画がこの問題を軽減するだけでなく、タンパク質やペプチドの同定を増加させ、プロテオーム分析をさらに増加させ、適応させる優れた方法であることに気づきました。