Name: 定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: 学ぶ 定圧ラベリングと質量分析法を用いた深いプロテオームプロファイリング。1万種以上のタンパク質を定量し、薬物応答や疾患バイオマーカー発見に応用可能です。

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著者は、役に立つ議論のためにすべての他の研究室、施設メンバーをありがとうございます。この仕事は部分的に支えられた R01GM114260、R01AG047928、R01AG053987、ALSAC NI H を付与します。聖ジュード小児研究病院プロテオミクス施設で、NIH がんセンター助成金 P30CA021765 で部分的にサポートされている MS 解析を行った。著者はニサ Badders の原稿を編集のヘルプをありがちましょう。

<ol><li>Pagala, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative protein analysis by mass spectrometry.</a> Methods Mol Biol. 1278, 281-305 (2015).</li>
<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+proteomics%3A+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14 (1), 35-48 (2013).</li>
<li>Rauniyar, N., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isobaric+labeling-based+relative+quantification+in+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Isobaric labeling-based relative quantification in shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 5293-5309 (2014).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometric+exploration+of+proteome+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function.</a> Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Profiling+of+Proteome+and+Phosphoproteome+by+Isobaric+Labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Extensive+Liquid+Chromatography%2C+and+Mass+Spectrometry.+Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Deep Profiling of Proteome and Phosphoproteome by Isobaric Labeling.</a> Extensive Liquid Chromatography, and Mass Spectrometry. Methods Enzymol. 585, 377-395 (2017).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Anal Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+throughput+in+targeted+proteomics+assays%3A+54-plex+quantitation+in+a+single+mass+spectrometry+run%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Increasing throughput in targeted proteomics assays: 54-plex quantitation in a single mass spectrometry run.</a> Anal Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approaches+for+analyzing+U1-70K+cleavage+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Integrated approaches for analyzing U1-70K cleavage in Alzheimer's disease.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4526-4534 (2014).</li>
<li>Bai, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((U1+small+nuclear+ribonucleoprotein+complex+and+RNA+splicing+alterations+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).</li>
<li>Thongboonkerd, V., LaBaer, J., Domont, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+proteomics+applied+to+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Recent advances of proteomics applied to human diseases.</a> J Proteome Res. 13 (11), 4493-4496 (2014).</li>
<li>Churchman, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Retinoids+in+IKZF1-Mutated+BCR-ABL1+Acute+Lymphoblastic+Leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Retinoids in IKZF1-Mutated BCR-ABL1 Acute Lymphoblastic Leukemia.</a> Cancer Cell. 28 (3), 343-356 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+mouse-human+phenome-wide+association+to+test+gene+function+and+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Joint mouse-human phenome-wide association to test gene function and disease risk.</a> Nat Commun. 7, 10464(2016).</li>
<li>Mertz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+elution+interactome+analysis+of+the+Mind+bomb+1+ubiquitin+ligase+reveals+a+novel+role+in+dendritic+spine+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sequential elution interactome analysis of the Mind bomb 1 ubiquitin ligase reveals a novel role in dendritic spine outgrowth.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (7), 1898-1910 (2015).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G. 2nd, Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Rev Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+off-line+high+pH+reversed-phase+fractionation+and+nano-liquid+chromatography-mass+spectrometry+method+for+global+proteomic+profiling+of+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B+Analyt+Technol+Biomed+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">An off-line high pH reversed-phase fractionation and nano-liquid chromatography-mass spectrometry method for global proteomic profiling of cell lines.</a> J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 974, 90-95 (2015).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Song, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase-reversed-phase+liquid+chromatography+approach+with+high+orthogonality+for+multidimensional+separation+of+phosphopeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase-reversed-phase liquid chromatography approach with high orthogonality for multidimensional separation of phosphopeptides.</a> Anal Chem. 82 (1), 53-56 (2010).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+optimization+of+long+gradient+chromatography+mass+spectrometry+for+deep+analysis+of+brain+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic optimization of long gradient chromatography mass spectrometry for deep analysis of brain proteome.</a> J Proteome Res. 14 (2), 829-838 (2015).</li>
<li>Hebert, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+one+hour+yeast+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The one hour yeast proteome.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (1), 339-347 (2014).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMP%3A+a+tag-based+database+search+tool+for+peptide+identification+with+high+sensitivity+and+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">JUMP: a tag-based database search tool for peptide identification with high sensitivity and accuracy.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3663-3673 (2014).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+optimization+of+reverse-phase+chromatography+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical optimization of reverse-phase chromatography for shotgun proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Niu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Peptide+Fractionation+and+y1+Ion-Based+Interference+Detection+Method+for+Enabling+Accurate+Quantification+by+Isobaric+Labeling+and+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Extensive Peptide Fractionation and y1 Ion-Based Interference Detection Method for Enabling Accurate Quantification by Isobaric Labeling and Mass Spectrometry.</a> Anal Chem. 89 (5), 2956-2963 (2017).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nat Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Wenger, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gas-phase+purification+enables+accurate%2C+multiplexed+proteome+quantification+with+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Gas-phase purification enables accurate, multiplexed proteome quantification with isobaric tagging.</a> Nat Methods. 8 (11), 933-935 (2011).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MultiNotch+MS3+enables+accurate%2C+sensitive%2C+and+multiplexed+detection+of+differential+expression+across+cancer+cell+line+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">MultiNotch MS3 enables accurate, sensitive, and multiplexed detection of differential expression across cancer cell line proteomes.</a> Anal Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).</li>
<li>Zhou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+proteome+quantification+by+DEEP+SEQ+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-scale proteome quantification by DEEP SEQ mass spectrometry.</a> Nat Commun. 4, 2171(2013).</li>
<li>Savitski, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+fragmentation+and+optimized+isolation+width+settings+for+improvement+of+protein+identification+and+accuracy+of+isobaric+mass+tag+quantification+on+Orbitrap-type+mass+spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Delayed fragmentation and optimized isolation width settings for improvement of protein identification and accuracy of isobaric mass tag quantification on Orbitrap-type mass spectrometers.</a> Anal. Chem. 83 (23), 8959-8967 (2011).</li>
<li>Ahrne, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Improvement+of+Quantification+Accuracy+in+Isobaric+Mass+Tag-Based+Protein+Quantification+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Improvement of Quantification Accuracy in Isobaric Mass Tag-Based Protein Quantification Experiments.</a> J Proteome Res. 15 (8), 2537-2547 (2016).</li>
<li>Xu, P., Duong, D. M., Peng, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematical+Optimization+of+Reverse-Phase+Chromatography+for+Shotgun+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Systematical Optimization of Reverse-Phase Chromatography for Shotgun Proteomics.</a> J Proteome Res. 8 (8), 3944-3950 (2009).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Proteomics+and+Phosphoproteomics+Profiling+Reveals+Dynamic+Signaling+Networks+and+Bioenergetics+Pathways+Underlying+T+Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Integrative Proteomics and Phosphoproteomics Profiling Reveals Dynamic Signaling Networks and Bioenergetics Pathways Underlying T Cell Activation.</a> Immunity. 46 (3), 488-503 (2017).</li>
<li>Wu, Z., Na, C. H., Tan, H., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+ubiquitination+analysis+by+SILAC+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Global ubiquitination analysis by SILAC in mammalian cells.</a> Methods Mol Biol. 1188, 149-160 (2014).</li>
<li>Tan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refined+phosphopeptide+enrichment+by+phosphate+additive+and+the+analysis+of+human+brain+phosphoproteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Refined phosphopeptide enrichment by phosphate additive and the analysis of human brain phosphoproteome.</a> Proteomics. 15 (2-3), 500-507 (2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUMPg%3A+an+Integrative+Proteogenomics+Pipeline+Identifying+Unannotated+Proteins+in+Human+Brain+and+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">JUMPg: an Integrative Proteogenomics Pipeline Identifying Unannotated Proteins in Human Brain and Cancer Cells.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2309-2320 (2016).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+clinical+utility+of+cancer+genomic+and+proteomic+data+across+tumor+types%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Assessing the clinical utility of cancer genomic and proteomic data across tumor types.</a> Nat Biotechnol. 32 (7), 644-652 (2014).</li>
<li>Nesvizhskii, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteogenomics%3A+concepts%2C+applications+and+computational+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteogenomics: concepts, applications and computational strategies.</a> Nat Methods. 11 (11), 1114-1125 (2014).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
</ol>

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我々 は、いくつかの出版物12,13,14,32 で正常に実装されている 10-プレックス定圧ラベリング戦略が付いている蛋白質の定量のための高スループット プロトコルを記述します。.このプロトコルでは 1 の実験では最大 10 の異なる生物蛋白質のサンプルを分析できます。日常的に識別でき信頼性の高さが優に 10,000 蛋白質量的に表わします。定圧ラベリングは蛋白質を量的に効果的な技術が、定量的な不正確さにつながることができる比圧縮によって制限されます。LC/LC の最適化や y1イオン ベース post-MS 補正との組み合わせで MS/MS 設定など、様々 な戦略を使用して、プロトコル効果的にほとんどの干渉効果を削除し、したがってかなりの精度を向上させるタンパク定量法。
タンパク質濃度の方法の数でプログ...

次世代シーケンシング技術の進歩は、生物学的システムおよび人間の病気を研究するための新しい風景につながっています。これは、ゲノム、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボローム、具体的になって他の分子システムの測定の数が多いを許可しています。質量分析法 (MS) 分析化学における最も敏感な方法の 1 つで、プロテオミクスの応用は人間のゲノムの配列の後急速に拡大しています。過去数年間プロテオミクス分野で MS ベースの定量的分析を定圧ラベリングと計測に加え、豊富な液体クロマトグラフィーと結合機能を多重化などを含む主要な技術の進歩が得られています。進歩より速くより正確な測定のために必要な以下の試料を可能にします。定量的プロテオミクス蛋白質と非常に複雑な生体試料1,2,3,4の翻訳後修飾の数万人をプロファイリングのアプローチが主流となっています。,5,6。
相対パスと絶対定量 (すなわちiTRAQ) とタンデム質量タグ (TMT) MS の定圧タグなど多重の定圧ラベル表示方法が大きくサンプル スループット向上し、単一で分析できるサンプルの数を増加1,6,7、8を試してみてください。ラベル無料定量など安定同位体標識細胞培養 (すなわちSILAC)、アミノ酸、プロテオミクス、これらのテクニックの可能性と共に他の MS に基づく定量方法もかなり9 フィールドが、10,11。たとえば、TMT メソッドは 1 実験で 10 プレックス試薬を使用して一緒に分析されるべき 10 の蛋白質のサンプルを許可します。これらの構造的に同じ TMT タグ同じ全体の質量が重い同位体がフラグメンテーション相対定量が可能となる、各タグの中にユニークなレポーター イオンで生じる炭素または窒素原子の分布の比較間 10 のサンプルします。TMT 戦略は日常的に生物学的経路、病気の進行、細胞プロセス12,13,14の研究に適用されます。
相当な技術的な改善は、液体クロマトグラフィー (LC)-MS/MS システム、LC 分離と定量精度を損なうことがなく、タンパク質の同定を最大化するために、MS パラメーターの両面を強化します。結果の最大数20を達成するために散弾銃プロテオミクス手法のこのタイプの最初の次元に 2 番目の次元の高い直交性と分離法によるペプチドの分離が欠かせません。高 pH 逆相液体クロマトグラフィー (市販清涼飲料水) は、従来の強陽イオン交換クロマトグラフィー20よりもパフォーマンスが向上を提供します。全体プロテオーム解析15 を実行するときに表現された蛋白質の大部分を識別できるようになります分析ダイナミック レンジとタンパク質報道が改善されるように、pH が高い市販清涼飲料水を低 pH 市販清涼飲料水の 2 番目の次元と組み合わせれば、、16,17,18。その他の技術の進歩は C18 微粒子 (1.9 μ m) を含めるし、長い列 (~ 1 m)19を拡張します。さらに、他の顕著な改善には、急速なスキャン速度、感度の向上と解像度20、MS データ マイニング21の高度なバイオインフォマティクス パイプラインと質量分析計の新しいバージョンが含まれます。
ここでは、実験を通して品質管理機構に焦点を当てながら感度とスループットを向上させるための変更を最も最近の方法論を取り入れた詳細なプロトコルについて述べる。プロトコルには、蛋白質の抽出と消化、TMT 10 プレックス ラベリング、基本的な pH と酸性 pH 市販清涼飲料水分別、高分解能 MS 検出、および MS データ加工 (図 1) が含まれます。また、トラブルシューティングおよび実験の変化を評価するためのいくつかの品質管理手順を実施します。この詳細なプロトコルは、研究者を助ける新しいフィールドに日常的に識別し、正確にたくさんの lysate からの蛋白質を量的に使用または組織。

<table><tbody><tr><td>1220 LCシステム</td><td>Agilent</td><td>G4288B</td><td></td></tr><tr><td>50% ヒドロキシルアミン</td><td>Thermo Scientific</td><td>90115</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>バーディック &ジャクソン</td><td>AH015-4</td><td></td></tr><tr><td>バレットブレンダー</td><td>ネクストアドバンス</td><td>BB24-AU</td><td></td></tr><tr><td>バタフライポートフォリオヒーター</td><td>フェニックス S&T</td><td>PST-BPH-20</td><td></td></tr><tr><td>C18 ヒント</td><td>ハーバード デバイス</td><td>74-4607</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td> <td>シグマ</td><td>D5545</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマ</td><td>41648</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>シグマ</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>フラクション コレクター</td><td>ギルソン</td><td>FC203B</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ビーズ</td><td>ネクスト アドバンス</td><td>GB05</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセトアミド (IAA)</td><td>Sigma</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>Lys-C</td><td>和光</td><td>125-05061</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>バーディック &Jackson</td><td>AH230-4</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>質量分析計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Q Exactive HF</td><td></td></tr><tr><td>ナノフロー UPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Ultimate 3000</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur C18 樹脂、1.9um</td><td>Dr. Maisch GmbH</td><td>r119.aq.0003</td><td></td></tr><tr><td>Self Pck Columns</td><td>New Objective</td><td>PF360-75-15-N-5</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Speedva</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD11V</td><td></td></tr><tr><td>TMT 10plex Isobaric ラベル試薬</td><td>Thermo Scientific</td><td>90110</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td><td>Applied Biosystems</td><td>400003</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Xbridge カラム C18 カラム</td><td>Waters</td><td>186003943</td><td></td></tr><tr><td>Ziptips C18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>SepPak 1cc 50mg</td><td>Waters</td><td>WAT054960</td><td></td></tr></tbody></table>

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

Deep Proteome Profiling by Isobaric Labeling, Extensive Liquid Chromatography, Mass Spectrometry, and Software-assisted Quantification

多くの例外的な進歩は、質量分析法 (MS) で行われている-基づくプロテオミクス、液体クロマトグラフィー (LC) における特定の技術進歩とタンデム質量分析法 (MS/LCMS) と定圧ラベル多重能力に結合します。広範な LC/クロマトグラフィー-タンデム質量プラットフォームと正確に全体のプロテオームを量的に後 MS 計算干渉補正 10 プレックス タンデム質量タグ (TMT) ラベルを組み合わせた深いプロテオミクス プロファイリング プロトコルを紹介します。このプロトコルには、次の主要な手順が含まれています: 蛋白質の抽出と消化、TMT がラベル付け、2 次元 (2 D) LC、高分解能の質量分析法および計算のデータ処理。品質管理手順、トラブルシューティングおよび実験の変化を評価するため含まれています。哺乳類の試料中の 10,000 以上のタンパク質は、このプロトコルで自信を持って測定することができます。このプロトコルは、軽微な変更と翻訳後修飾の定量にも適用できます。この多重化、堅牢なメソッドは、さまざまな複雑なサンプル、培養細胞、動物組織、ひと臨床検体などのプロテオーム解析のための強力なツールを提供します。

Pre-MS 分別、MS 設定、および post-MS 補正23を含む 3 つの主要なプロトコル手順で比圧縮の効果を体系的に分析する前述の異種間ペプチド ミックスを使いました。Pre-MS 分別は評価され、酸性 pH 市販清涼飲料水と基本的な pH 市販清涼飲料水の組み合わせを使用して、最適化されました。Post-MS 解析、種特異的ペプチドのみが考えられていた。LC/クロマトグラフィー-タンデム質量、MS2 分離ウィンドウ、解像度液晶オンライン、オンラインの酸性 pH、市販清涼飲料水の読み込み量やオフラインの pH が高い市販清涼飲料水の解像度などのパラメーターの数を調べるためこの干渉モデルを使用 (参照の図 3を参照してください。29)。
オフライン LC 時の解像度を変更するには、我々 は 3...

正確に高分解能質量分析計を接続した液体クロマトグラフィーによる定圧ラベリング、広範な分別、バイオインフォマティクス ツールの組み合わせで品質管理手順と蛋白質を量的にプロトコルを提案します。

Many exceptional advances have been made in mass spectrometry (MS)-based proteomics, with particular technical progress in liquid chromatography (LC) ...

この実験の全体的な目標は、さまざまな薬物治療、時間経過、または生物学的条件にわたって、細胞または組織溶解物から10, 000を超えるタンパク質を特定し、正確に定量することです。この方法は、薬物やその他の生物学的刺激に反応してどのタンパク質が変化しているかなど、医学や生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、10の異なる実験条件で発現したプロテオームの70%以上を正確に定量する能力があることです。この技術の意味は、潜在的なバイオマーカーの発見を通じて、ヒトの疾患の診断にまで拡張することができます。最適な細胞溶解と体液推定が下流の消化、標識、および分離手順において重要な役割を果たすため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。このプロトコールを開始するには、目的の培養細胞を入手してください。各洗浄に10ミリリットルのPBSを使用して細胞を2回洗浄します。洗浄した細胞をこすり落とし、1ミリリットルのPBSを含む1.5ミリリットルのチューブに集めます。600 g、摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を取り除き、細胞を溶解する準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。解剖後すぐに目的の組織を採取し、秤量します。この後、すぐに液体窒素で保存し、摂氏マイナス80度で保存します。実験当日に、テキストプロトコルに概説されているように、溶解バッファーを調製します。凍結サンプルに溶解バッファーを添加し、バッファーとサンプルの比率が10対1で、最終タンパク質濃度が1ミリグラムあたり5〜10ミリグラムになるようにします。次に、ガラスビーズを追加し、ブレンダーを使用してサンプルを摂氏4度で溶解し、30秒間ブレンドしてから5秒間休ませ、これを5回またはサンプルが均質化するまで繰り返すことで8回加速します。標準的なタンパク質定量アッセイまたはBSAを標準としてCoomassie染色したSDSポリアクリルアミドゲルを使用して、タンパク質濃度を測定します。この後、最終濃度が10%で、Lys-Cプロテアーゼが酵素と基質の比率が1対100になるように100%アセトニトリルを添加します。室温で2時間インキュベートし、タンパク質の消化を待ちます。次に、最終濃度が1ミリモルになるようにDTTを追加します。室温で1時間インキュベートします。次に、サンプル中の尿素濃度が2モルに希釈されるまで、50ミリモルHEPESを追加します。トリプシンとタンパク質の比率が1対50で各サンプルにトリプシンを添加します。室温で少なくとも3時間インキュベートします。次に、DTTを再び1ミリモルになるまで加え、室温で2時間インキュベートします。ヨードアセトアミドを最終濃度が10ミリモルになるように追加します。室温で30分間暗所でインキュベートします。この後、未反応のヨードア

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

ここでは、 シロイヌナズナの細胞培養というラベルのN 15、完全に標識されていないとの混合物をベース洗剤に耐性と洗剤の可溶性膜にし、 生体内で植物の形質膜の分画するための堅牢な方法が記載されている。手順は、シグナリングプロセスを理解するために、比較プロテオミクス研究のために適用される。...

比較プロテオーム解析のための代謝標識および膜分画<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;サスペンション細胞培養

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。...

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

癌細胞プロテオームの詳細な分析は、新規の薬物標的と診断バイオマーカーの同定を容易にします。ここでは、液体および固体腫瘍に由来するがん細胞亜集団における(リン酸化)プロテオームの定量解析のための実験ワークフローについて説明します。これは、細胞濃縮戦略と定量的なSuper-SILACベースの質量分析を組み合わせることで達成されます。...

液体および固形腫瘍由来の癌細胞のプロテオームの定量的質量分析プロファイリング

組み合わせ前駆同位体標識およびアイソバリックタグ（cPILOT）は、アイソバリックタグのサンプル多重化機能を強化し、定量プロテオミクス戦略です。このプロトコルは、アルツハイマー病のモデルマウスと野生型対照からの組織へのcPILOTの適用を説明しています。...

拡張サンプル複合前駆同位体標識と同重体タグ付けを使用して組織の多重化（cPILOT）

ここでは、ラベルフリーの定量的質量分析法を用いたタンパク質相関プロファイリングに続く親和性タンパク質複合体の精製と青ネイティブPAGEによるそれらの分離のためのプロトコルを提示します。この方法は、異なるタンパク質複合体へのインタラクトームを解決するのに便利です。...

ブルーネイティブPAGEおよびタンパク質相関プロファイリングによってアフィニティー精製タンパク質複合体の解決

記載されているプロテオミクスワークフローは、目的とするタンパク質の免疫親和性濃縮と標識フリー質量分析法を用いて核細胞内分画からタンパク質相互作用パートナーを同定するためのプロテオミクスワークフローである。このワークフローには、細胞内分画、免疫沈降、フィルター支援サンプル調製、オフラインクリーンアップ、質量分析、下流バイオインフォマティクスパイプラインが含まれます。...

大規模核インターロームプロファイリングのためのラベルフリー免疫沈降質量分析ワークフロー

タンパク質抽出、定量、沈殿、消化、標識、プロテオミクス施設への提出、データ分析の各ステップの詳細情報を含む最適化されたタンデム質量タグ(TMT)標識プロトコルを提示します。...

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

前駆体同位体標識とアイソバリックタグ(cPILOT)は、利用可能なアイソバリックタグで同時に分析できるサンプル数を増やすことができる、強化されたサンプル多重化戦略です。ロボットプラットフォームの組み込みにより、実験のスループット、再現性、定量的精度が大幅に向上しました。...

組み合わせ前駆体等位同位体ラベリングとアイソバリックタギング(cPILOT)を使用した自動サンプル多重化

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。...

組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。...

タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

学ぶ 定圧ラベリングと質量分析法を用いた深いプロテオームプロファイリング。1万種以上のタンパク質を定量し、薬物応答や疾患バイオマーカー発見に応用可能です。

定圧ラベリング、豊富な液体クロマトグラフィー、質量分析法、およびソフトウェアによる定量化して深いプロテオームをプロファイリング

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