モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

次の実験の全体的な目標は、in vitro および in vivo で表現型の特性評価を行うために、定義された細胞タイプから遺伝子操作された星状細胞腫モデルを作成することです。これは、in vitro培養のために、非クリー語を発現する新生児条件付き遺伝子改変マウスから野生型初代細胞を採取することによって達成されます。第2のステップでは、初代細胞にクリー組換えをコードするアデノウイルスベクターを感染させ、in vitroでF flox対立遺伝子の遺伝子組換えを誘導します。

次に、組換え細胞を段階培養して、表現型の特性評価を行います。最終的に、定義された変異が特定の神経細胞タイプにおける神経膠無形成を促進するかどうかは、in vitroおよびin vivoでの腫瘍原性関連表現型の特性評価によって決定されます。この方法は、星状細胞腫に関連する突然変異の表現型への影響は何ですか?

この技術の意味は、これらの遺伝的に定義された細胞をin vitroおよびin vivoで免疫コンピテントなシンジェネティックマウスで使用できるため、星状細胞腫の前臨床医薬品開発にまで及びます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、細胞採取と同所性注入のステップが技術的に困難であり、解剖学的構造の正確な同定が必要であるため、非常に重要です。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるライアン・バッシュです 脳組織を採取する。

まず、エタノール滅菌解剖ハサミを使用して、生後1〜3日齢の安楽死させた新生児の遺伝子操作マウスの頭蓋骨の上の皮膚に脊髄から鼻まで矢状切開を行います。次に、脊髄から始まり、嗅球を越えて伸びる矢状縫合糸に沿って頭蓋骨に切り込みを入れます。次に、湾曲した鉗子を使用して、まっすぐなマイクロ鉗子を使用して、頭蓋骨の各半球を脳から横方向にゆっくりと剥がします。

次に、小脳と嗅球を避けながら、各皮質半球の背側部分をそっとつまみ、H-B-S-S-Nを含む組織培養皿に脳組織を入れます。解剖顕微鏡下で、2対のマイクロ鉗子を使用して各皮質半球から髄膜を穏やかに除去し、組織培養皿を氷に戻して脳組織を均質化します。まず、きれいなカミソリの刃を使って、最後に皮質半球をさいの目に切ります。

次に、プレートを組織培養フードに移し、組織片を滅菌済みの15ミリリットルの円錐管に移します。プレートを1ミリリットルの氷冷HBSSですすぎ、洗浄液もチューブに移します。2ミリリットルの室温で余分なHBSSを除去した後、EDTAでチューブにトリップシンし、1ミリリットルのピペットで約10回ピペッティングして組織片をさらに結合させます。

細胞懸濁液を摂氏37度で15〜20分間インキュベートします。インキュベーション後5分ごとに反転して細胞溶液を慎重に混合し、3ミリリットルの完全培地を細胞懸濁液に混合し、示したようにピペッティングで10回上下することによりトリプシンを阻害しました。次に、解離したアストロサイトをスピンダウンします。

1ミリリットルのピペットでスナットを慎重に取り外し、ペレットを摂氏37度の4ミリリットルに再懸濁します。コンプリートメディア。次に、アストロサイト懸濁液をT 75スクリュートップ組織培養フラスコに移し、収穫後約16時間で皮質アストロサイトを5%二酸化炭素で摂氏37度に維持します。

フラスコを摂氏37度のHBSSの4ミリリットルで洗います。次に、4ミリリットルの完全培地を加え、皮質アストロサイトを5%の二酸化炭素で摂氏37度に維持します。培養物が約95%の合流点に達したら、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩培養物を振ってください。

次に、分離した細胞を含む培地を取り出し、さらに4ミリリットルの摂氏37度HBSSでプレートを洗浄します。次に、4ミリリットルの新鮮で完全な培地を加え、皮質アストロサイトの培養物を濃縮してから24時間後に細胞を再度インキュベートします。2ミリリットルの完全培地で文化をリフレッシュします。

次いで、目的のアデノウイルス10μuの10分の10倍以上の1マイクロリットルを、摂氏32度で5%の二酸化炭素中に5%の二酸化炭素で含有する1ミリリットルの完全培地と細胞をインキュベートする。Gfab CRE感染は、再結合したgfabアストロサイトに増殖性の利点を引き起こし、培養で5〜9回の継代後にアストロサイトの純度を59%から90%以上に増加させます。6時間後、ウイルスを含む培地を取り出し、新鮮で完全な培地で培養物を再インキュベートします。

皮質アストロサイトが約90%コンフルエンスで採取され、適切な細胞数が氷冷した5%メチルセルロースに再懸濁された後。250マイクロリットルのガラス製シリンジをリピーティング抗原ディスペンサーに入れ、鈍い18ゲージの針をシリンジに取り付けます。18ゲージの針を使用して、皮質アストロサイトをシリンジに吸引し、気泡を取り除きます。

次に、18ゲージの針を捨て、27ゲージの針をシリンジに取り付けます。新しい針から液体が排出されるまで、抗原ディスペンサーのボタンを押してアストロサイトを移植します。次に、生後3ヶ月から6ヶ月の免疫適格レシピエント動物を定位固定装置内に固定し、耳と目の間の約0.5cmの長さの矢状縫合糸を切開します。

冠状縫合糸と矢状縫合糸またはBRE MAの交点、および矢状縫合糸またはラムダのラムドイドの交点を特定します。BMAとλが同じ水平面にあることを確認した後、シリンジと反復抗原ディスペンサーを動物の頭上の定位固定装置フレームに取り付け、針の先端をbgmaに接触させます。針を頭蓋骨の表面から少し持ち上げ、bgmaから横方向に2ミリメートル、吻側から1ミリメートル動かします。

次に、針を頭蓋骨を通して慎重に目的地まで下げます。breg MAから腹側4ミリメートルで、反復抗原ディスペンサーを活性化します。細胞懸濁液の5マイクロリットルを注入するために1回。

針を2分間そのままにして頭蓋内圧を平衡化させた後、綿のスワップを使用して30秒間針をゆっくりと引き抜き、発生する可能性のある出血に圧力をかけます。.最後に、ティッシュ接着剤を使用して創傷の端を近似し、切開部を閉じてから、動物を清潔で温かいケージに入れて回復させます。確立されたヒト細胞株の異種移植片は、免疫不全の宿主を必要とし、一般的にヒト星細胞腫の組織病理学を再現しないことが必要です。

例えば、U 87 MG同所性異種移植片は、正常な脳に浸潤しない限局性腫瘍を形成します。対照的に、免疫能のある同系マウスの脳にT RRP欠損アストロサイトを注入すると、ヒトの対応物の組織学的特徴、特に正常な脳組織への浸潤を再現する腫瘍が生成されます。TRPヌル同種移植片の増殖をモニターするために、細胞注入後5日ごとにマウスを屠殺し、hおよびe染色された脳切片の腫瘍面積を定量化することにより、腫瘍量を決定しました。

腫瘍領域は時間とともに指数関数的に増加すると判断され、TP nll星状細胞の1倍から5分の1をレシピエント脳に同所性注射すると、神経学的罹患率がもたらされました。生存期間の中央値は22日です。in vivoでの縦断的イメージングは、腫瘍増殖動態を定義するために使用されてきました。

そこで、この実験では、TRペナルアストロサイトとルシフェラーゼを発現するように操作した免疫コンプテンシャルアストロサイトの脳に注入しました。同腹仔と腫瘍の成長は、連続生物発光イメージングによって決定されました。生物発光の15倍の増加が16日間で観察されました。

この手順に続いて、in vitroおよびin vivoで薬物試験を実施して、有効性を判断し、新規の薬物の組み合わせを試験することができます。このビデオを見れば、条件付き遺伝子改変マウスを発現しない非産生マウスから皮質アストロサイトを採取する方法、in vitroで遺伝子組換えを誘導する方法、免疫コンピテントマウスの同所性同種移植片を用いた腫瘍形成のモデル化方法について、十分に理解できるはずです。