ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

この手順の全体的な目標は、多孔質骨基質上でヒト間葉系幹細胞を培養することです。これは、最初に間葉系幹細胞をヒト羊膜またはAMHCSから単離することによって達成されます。次に、多孔質骨基質椎間板は、細胞が成長するための栄養素の正しい分布を促進するように準備されます。

次に、AM hcsを多孔質骨基質椎間板上で培養します。最後に、コロニー形成単位がカウントされ、形態がカウントされます。細胞増殖と細胞接着はすべて解析されます。

最終的に、細胞の形態、コロニー形成単位の数、細胞増殖、細胞接着は、それぞれ光学顕微鏡によるバイタル色素による染色と走査型電子顕微鏡によって分析されます。この技術の意味は、間葉系幹細胞を天然の骨を模倣したマクロ多孔質生体材料に送達することが可能であるため、骨損傷の治療にまで及びます。ヒトの羊膜から間葉系幹細胞を単離するには、片手で臍帯を持ち、もう一方の手で半透明のシートのように見える羊膜を剥がします。

サンプル中にchoonが存在する場合は、手動で解剖して羊膜組織から分離します。5ミリリットルのPBSを使用してサンプルを3回洗浄して残留血液を取り除き、単純な鉗子を使用してメスで血栓を取り除きます。羊膜に小さな切り込みを入れて、約0.5平方センチメートルの断片を生成します。

メンブレムを消化するには、フラグメントを50ミリリットルのコニカルチューブに入れ、5ミリリットルの0.125%トリプシン0.5ミリモルEDTA溶液を追加します。摂氏37度と二酸化炭素5%で30分間インキュベートした後、200Gと摂氏25度で5分間回転します。次に、上清を捨てます。

次に、コラゲナーゼ2型溶液15ミリリットルを加え、溶岩のプロトコルに従って時折振とうしながら摂氏37度で2時間インキュベートします。消化後すぐに、PBS15ミリリットルを加え、200Gと摂氏25度で10分間遠心分離します。上清を捨て、PBSを使用して細胞ペレットを洗浄してから、再度15分間回転させます。

上清を捨てた後、ペレットに10ミリリットルのH-G-D-M-E-Mを加え、軽く振って再懸濁します。間葉系幹細胞を増殖させる。培養フラスコに2ミリリットルの細胞懸濁液を播種し、2ミリリットルのH HG DMEMインキュベートを加えます。

そして5〜7日後、培地を交換して非接着性細胞を除去します。その後、さらに7〜10日間、3日ごとに、細胞が90%コンフルエントになるまで培地を交換します。0.125%tripsin EDTAを添加し、5分間インキュベートしてから、細胞懸濁液を吸引し、15ミリリットルのコニカルチューブに移します。

細胞を回転させ、上清を捨てた後、HG DMEMを使用して細胞ペレット培養を再懸濁します。2 75平方センチメートルのフラスコ内の細胞は、90%のコンフルエンスで培養を維持します。9継代目または継代培養まで、イズ化とレップメッキを繰り返します。

その後、フローサイトメトリーやその他の研究のために細胞を回収します。多孔質骨基質椎間板を調製する。まず、FBSを含まないHG DMEMを3ミリリットルずつ各NKBディスクに加え、翌日のFAAによると、加湿雰囲気で一晩インキュベートします。

各ディスクを50ミリリットルの円錐管に入れ、200 GSで5分間回転させて余分な培地を取り除き、24ウェルの培養プレートに移します。500マイクロリットルのH-G-D-M-E-Mを追加し、ディスクに気泡が存在しないことを確認して、栄養素と細胞の正しい分布を促進します。3つのサブカルチャーから摂氏25度で30分間ゆっくりと連続的にインキュベー

インキュベーション後、1.5ミリリットルの戦前のH-G-D-M-E-Mを慎重に追加し、培養を3日間維持して細胞増殖アッセイを実施し、メーカーのガイドラインに従って細胞ディスクサンプルに150マイクロリットルのバイタル着色剤ABを追加します。参照波長600ナノメートルで570ナノメートルの吸光度をすぐに測定します。細胞を7日間インキュベートし、24時間ごとに吸光度を測定します。

H-G-D-M-E-Mで100mm組織培養ディスクあたり100個の細胞を培養し、コロニー形成単位を測定し、14日間インキュベートします。PBSを使用して培養物を洗浄し、メタノール中の0.5%クリスタルバイオレットを使用して、室温で5〜10分間細胞を染色します。PBSを使用してプレートを2回洗浄してから、これらのフローサイトメトリーヒストグラムに見られるように顕微鏡を使用して細胞をカウントします。

羊膜から単離された細胞集団は、表面間葉系マーカーCD90、CD73、およびCD1 0 5に対して強く反応し、造血マーカーCD34およびCD45に対して否定的に反応し、AM造血幹細胞が実際に間葉系であったことを示しました。これらの走査型顕微鏡写真に示されているように、生体材料の表面は1日目に球状細胞で覆われ、AMCは7日目にウシのマトリックス表面に明らかに付着していたようです。高倍率での充填襟状プロセスを介して、細胞は互いに接触を確立します。

このグラフは、ウシマトリックスの相対吸光度単位がわずかに減少していることを示しています。インキュベーションの1日後、足場の存在は細胞増殖の増加を誘発し、コロニー形成ユニットアッセイを使用して幹細胞を分析するためにウシマトリックスの非存在下で行った培養と比較して統計的に有意です。このグラフは、このビデオで示されているように単離され、さまざまな密度でプレーティングされたAM HSCが、培養14日目に個別のコロニーを形成する能力を維持したことを示しています。

このビデオを見れば、間葉系幹細胞とマクロ多孔質生体材料への送達方法について十分に理解できるはずです。