ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

この手順の全体的な目標は、ヒト筋生検サンプルから得られた 2 つの主要な細胞集団を高い効率と収率で分離し、特定の表現型および転写因子マーカーの評価を可能にすることです。これは、第1に、ヒト筋生検サンプルを第2ステップで単一細胞懸濁液に解離させることによって達成される。7日間の培養後、細胞は免疫磁気ビーズによって分離され、筋原性細胞であるCD56陽性と線維芽細胞であるCD56陰性画分に選別されます。

次に、細胞を染色し、目的の表現型およびタンパク質マーカーについてイメージングします。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法と定量的画像解析を使用して、選別された細胞集団内の選択された核局在転写因子の強度を測定できます。この技術の主な利点は、蛍光活性化細胞ソーティングのような既存の方法よりも免疫磁気細胞ソーティングを使用する、穏やかで、高収率と生存率でヒト初代筋細胞の優れたソーティングを可能にし、迅速に実行できることです。

この技術の意味は、老化で観察される線維脂肪性筋変性の細胞基盤についての我々の理解を増進することにまで及び、また、多くの筋肉の病状において、生検を得た後できるだけ早く筋肉由来の前駆細胞を単離すること。まず、組織サンプルの重量を決定し、次に基礎培地で筋肉を数回膨らませて、サンプルから余分な血液を取り除きます。筋肉沈殿物を室温で30〜60秒間沈殿させ、チューブから最後の2〜3ミリリットルの媒体を除くすべてを吸引します。

次に、チューブを滅菌ペトリ皿に反転させて、残りの液体が筋肉を皿に運ぶようにします。次に、明らかな脂肪や結合組織の目に見える部分のサンプルを洗浄します。次に、皿を回転させて残りの培地を動員し、すべての培地を吸引し、組織100〜400ミリグラムあたり3ミリリットルのコラゲナーゼとディスベ酵素溶液を加え、筋肉サンプルを非常に小さな1〜2ミリメートルの立方体に切断します。

サンプルが十分にミンチされている場合。幅の広いイノシシの25ミリリットルピペットを使用して、組織片と酵素溶液を滅菌済みの10〜20ミリリットルの円錐管に移します。プレートをさらに3ミリリットルの酵素溶液で洗浄し、次に10ミリリットルのピペットを使用して、残っている筋肉の断片をチューブに移します。

チューブを摂氏37度に60分間置きます。10ミリリットルのピペットで15分ごとに組織懸濁液を再形成します。次に、少なくとも同量の新鮮な再加温増殖培地で酵素的解離を終了します。

次に、細胞懸濁液を100マイクロメートルのフィルターに通して大きな破片を取り除き、細胞を遠心分離します。ペレットを7〜8ミリリットルの増殖培地に懸濁し、コーティングされていないT25組織培養フラスコで細胞をインキュベートします。摂氏37度、二酸化炭素5%を7日間

週の終わりに、トリプシンは細胞単層を3分間観察します。細胞が分離したら、5〜10ミリリットルの骨格筋の成長、過剰消化を防ぐための培地を追加し、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、カウント後、細胞系譜マーカーの特性評価のために一部の細胞を予約し、残りの細胞を15ミリリットルのPBS遠心分離機ゲインで洗浄します。

今回は、ペレットを室温で最大の170マイクロリットルのソーティングバッファーに再懸濁し、ピペットで穏やかに蘇生します。細胞を35マイクロリットルのよく混合された抗CD56抗体標識磁気マイクロビーズで懸濁します。細胞溶液をピペットで数回混合し、穏やかな植生で4°Cの15分間インキュベー

インキュベーション後の中間点で、細胞とビーズ溶液を10ミリリットルのソーティングバッファー遠心分離機とreusで洗浄します。ペレットを1ミリリットルの新鮮な選別緩衝液に懸濁します。次に、プレス分離フィルターとカラムを500マイクロリットルのソーシングバッファーで潤滑します。

そして、直ちに1ミリリットルの細胞懸濁液全体をプレス分離フィルターを介してカラムに混合し、カラムを3回すすぎ、1ミリリットルのソースバッファーパワーウォッシュでカラムを3回すすぎ、非保持線維芽細胞画分を収集し、カラムを通過して少量の成長培地を含む滅菌50ミリリットルの円錐管に入れます。次に、カラムを磁石から取り外し、プランジャーをカラムの上部に押し込んで、CD 56正のセル画分を収集します。温成長を含む別の50ミリリットルの円錐管では、このステップから中程度の成長培地が放出されます。

ダブルソーティングを実行する場合は、収集した正と負のセル画分を検討します。純度を高めるためにダブルソーシングが必要な場合は、最初のソーティングでCD 56ポジティブコレクションチューブに培地を入れず、適切な実験エンドポイントでフィルターとカラムの潤滑から手順を繰り返します。CD56陽性細胞培養物を、等量の氷冷、8%パラホルムアルデヒドを使用して、培養培地に固定します。

なだらかな植生の10分間。次に、固定液を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄して、細胞表面抗原を免疫染色します。PBS中の1%BSAで細胞を少なくとも1時間ブロックし、その後、関連する一次抗体、次に二次抗体で細胞を標識します。

検出器、ゲイン、レーザー出力、露光設定を顕微鏡や染色剤に関連づけて最適化します。イメージングの前に、細胞は必要な数の検出チャネルと6つ以上の異なる視野で細胞の画像を撮影します。解析するには、適切な TIFF 画像ファイルを開き、画像を互いにドラッグして、対応する適切なチャンネルをオーバーレイします。

各チャンネルは、レイヤーパネルに個別のレイヤーとして表示されます。次に、分析ウィンドウで、データポイントの選択を選択し、次にカスタムを選択して、目的の測定値を選択します。核蛍光強度を分析するには、色範囲ダイアログボックスを開き、ドロップダウンメニューからサンプリングされた色を選択します。

次に、Shiftキーを押しながら、ラベル化された核に固有のトーンを選択します。「保存」をクリックすると、このカラー範囲選択マスクを、同じセッションで選択した他の画像で使用するために保存できます。原子核を選択したら、クリックして塗りつぶしを選択します。

次に、ドロップダウンメニューから黒を選択し、不透明度が100%に設定されていることを確認します次に、[選択]と[反転]をクリックします。次に、右クリックしてもう一度[塗りつぶし]を選択し、ドロップダウンメニューから白い塗りつぶしを選択します。分水嶺アルゴリズムを実行して、バイナリーになった原子核層上の部分的に重なり合う原子核を分離します。

次に色範囲を選択し、次にシャドウに移動して、個々の分離された核を選択します。次に、目的のマーカーの16ビットグレースケール画像を含むレイヤーに選択範囲を転送し、[測定値の記録]をクリックします。最後に、選択した測定値をテキストファイルとして適切な分析ソフトウェアにエクスポートし、さらにオイルを処理します。

脂肪原性および筋原性系統マーカーの免疫染色と組み合わせた精製細胞集団の赤色染色は、線維芽細胞画分のみがエピジェニック分化が可能であり、線維芽細胞による脂肪の大量蓄積が肉眼で見えること、および治療の15日目までにこれらの細胞による核PPARガンマの強力な発現によるそれらの完全な形質転換をさらに実証できることを明らかにしています。 これらの細胞は、残りのTE seven A結合組織抗原を基質上に放出しています。対照的に、筋原性細胞は、核PPARガンマ発現のアップレギュレーションなしに、デスミンおよびミオシン重鎖の発現を含む正常な表現型を維持します。この図では、Desmond陽性筋原性細胞のフィールドとこれらのデータが得られたフィールドの定量分析の例を示し、この特定の播種密度と時点における個々の核の筋原性発現の変動を示しています。

このグラフでは、異なる細胞タイプの転写因子レベルを細胞レベルで直接比較するこの方法の有用性が示されています。例えば、これらのCD56陰性筋線維芽細胞は、高レベルの核脂肪形成転写因子であるPPARガンマを発現するが、一方、各種のCD56陽性筋原性細胞は、脂肪細胞誘導媒体への曝露後に非常に低いレベルの核内受容体転写因子のみを維持する。この技術により、筋生物学の分野の研究者は、健康な筋肉サンプルまたは病理学的なヒト筋肉サンプルにおける細胞運命決定のメカニズムを探求することができます。

このビデオをご覧になった方は、まず、精製され、十分に特性評価されたヒト筋由来細胞を高収率で得る方法、次に、免疫蛍光染色によって同定された細胞成分の客観的な定量分析を行う方法について、十分に理解しているはずです。