Name: ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学ぶヒト骨格筋バイオプシーからの一次筋原細胞と線維芽細胞の単離法。CD56抗原に基づく免疫磁気ビーズ分選により高収率・高生存率で細胞を分離し、免疫蛍光顕微鏡と定量画像解析で転写因子を評価する。

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著者は、技術支援を提供してくださったCarl Hobbs氏とLindsey Majoram氏、顕微鏡施設の使用についてPat Doherty教授に感謝したいと思います。Agley博士は、キングス・カレッジ・ロンドンの学生によって支援を受けました。Spurrell Trustからの資金提供も認められています。

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibres.</a> J. Cell Biol. 9, 493-495 (1961).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J. Appl. Physiol. 91, 534-551 (2001).</li>
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<li>Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+fibroblasts%2C+but+not+myogenic+cells%2C+readily+undergo+adipogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle fibroblasts, but not myogenic cells, readily undergo adipogenic differentiation.</a> J. Cell Sci. 126, 5610-5625 (2013).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138, 3625-3637 (2011).</li>
<li>Webster, C., Pavlath, G. K., Parks, D. R., Walsh, F. S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+human+myoblasts+with+the+fluorescence-activated+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation of human myoblasts with the fluorescence-activated cell sorter.</a> Exp. Cell Res. 174, 252-265 (1988).</li>
<li>Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Culture+of+Individual+Myofibers+and+their+Satellite+Cells+from+Adult+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle.</a> J. Vis Exp. , e50074(2013).</li>
<li>Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+Self-Renewal+and+Commitment+of+Satellite+Stem+Cells+in+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric Self-Renewal and Commitment of Satellite Stem Cells in Muscle.</a> Cell. 129, 999-1010 (2007).</li>
<li>Mackey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+satellite+cell+number+and+activity+status+in+human+skeletal+muscle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+a+d+Nerve%22%5BJournal%5D)">Assessment of satellite cell number and activity status in human skeletal muscle biopsies.</a> Muscle a d Nerve. 40, 455-465 (2009).</li>
<li>Stewart, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proliferating+human+skeletal+muscle-derived+cells+in+vitro%3A+Differential+modulation+of+myoblast+markers+by+TGF-%CE%B22%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of proliferating human skeletal muscle-derived cells in vitro: Differential modulation of myoblast markers by TGF-β2.</a> J. Cell. Physiol. 196, 70-78 (2003).</li>
<li>Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+gradient+magnetic+cell+separation+with+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">High gradient magnetic cell separation with MACS.</a> Cytometry. 11, 231-238 (1990).</li>
<li>Clarke, C., Davies, S. Ch. 2. Methods in Molecular Medicine. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClarke%2C+C+%22Metastasis+Research+Protocols%22">Metastasis Research Protocols</a>. Brooks, S. A., Schumacher, U. 58, Humana Press. 17-23 (2001).</li>
<li>Grützkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+but+mighty%3A+How+the+MACS-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Small but mighty: How the MACS-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).</li>
<li>Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separation%3A+Terminology+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cell separation: Terminology and practical considerations.</a> Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).</li>
<li>Agley, C. C., Velloso, C. P., Lazarus, N. R., Harridge, S. D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Image+Analysis+Method+for+the+Precise+Selection+and+Quantitation+of+Fluorescently+Labeled+Cellular+Constituents%3A+Application+to+the+Measurement+of+Human+Muscle+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An Image Analysis Method for the Precise Selection and Quantitation of Fluorescently Labeled Cellular Constituents: Application to the Measurement of Human Muscle Cells in Culture.</a> J. Histochem. Cytochem. 60, 428-438 (2012).</li>
<li>Danoviz, M., Yablonka-Reuveni, Z. Ch. 2. Methods in Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDanoviz%2C+M+%22Myogenesis%22">Myogenesis</a>. DiMario, J. X. 798, Humana Press. New York, NY. 21-52 (2012).</li>
<li>Bergström, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+electrolytes+in+man.+Determined+by+neutron+activation+analysis+on+needle+biopsy+specimens.+A+study+on+normal+subjects%2C+kidney+patients%2C+and+patients+with+chronic+diarrhoea%5BTitle%5D)+AND+%22Scand.+J.+Clin.+Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Muscle electrolytes in man. Determined by neutron activation analysis on needle biopsy specimens. A study on normal subjects, kidney patients, and patients with chronic diarrhoea.</a> Scand. J. Clin. Lab. Invest. 14, 7-100 (1962).</li>
<li>Chazaud, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells+attract+monocytes+and+use+macrophages+as+a+support+to+escape+apoptosis+and+enhance+muscle+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Satellite cells attract monocytes and use macrophages as a support to escape apoptosis and enhance muscle growth.</a> The Journal of Cell Biology. 163, 1133-1143 (2003).</li>
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<li>Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+oil+red+O+staining+permits+combination+with+immunofluorescence+and+automated+quantification+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids.</a> Histochem. Cell Biol. 116, 63-68 (2001).</li>
<li>Rossner, M., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+in+a+picture%3F+The+temptation+of+image+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">What's in a picture? The temptation of image manipulation.</a> The Journal of Cell Biology. 166, 11-15 (2004).</li>
<li>Zinchuk, V., Grossenbacher-Zinchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+quantitative+colocalization+analysis%3A+Focus+on+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Recent advances in quantitative colocalization analysis: Focus on neuroscience.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 44, 125-172 (2009).</li>
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<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+39+steps%3A+A+cautionary+tale+of+quantitative+3-D+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">The 39 steps: A cautionary tale of quantitative 3-D fluorescence microscopy.</a> Biotechniques. 28, 884-887 (2000).</li>
<li>Bolte, S., Cordelières, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guided+tour+into+subcellular+colocalization+analysis+in+light+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy.</a> J. Microsc. 224, 213-232 (2006).</li>
<li>Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+-+avoiding+the+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy - avoiding the pitfalls.</a> J. Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).</li>
<li>Bareja, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+Mouse+Skeletal+Muscle+Stem+Cells%3A+Convergent+and+Divergent+Mechanisms+of+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Human and Mouse Skeletal Muscle Stem Cells: Convergent and Divergent Mechanisms of Myogenesis.</a> PLoS ONE. 9, e90398(2014).</li>
<li>Castiglioni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Progenitors+that+Exhibit+Myogenic%2FOsteogenic+Bipotency+In+by+Fluorescence-Activated+Cell+Sorting+from+Human+Fetal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Isolation of Progenitors that Exhibit Myogenic/Osteogenic Bipotency In by Fluorescence-Activated Cell Sorting from Human Fetal Muscle.</a> Stem Cell Reports. 2, 560(2014).</li>
<li>Fukada, S. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD90-positive+cells%2C+an+additional+cell+population%2C+produce+laminin+%CE%B12+upon+transplantation+to+dy3k%2Fdy3k+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">CD90-positive cells, an additional cell population, produce laminin α2 upon transplantation to dy3k/dy3k mice.</a> Exp. Cell Res. 314, 193-203 (2008).</li>
<li>Stickland, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+development+in+the+human+fetus+as+exemplified+by+m.+sartorius%3A+a+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Muscle development in the human fetus as exemplified by m. sartorius: a quantitative study.</a> J. Anat. 132, 557-579 (1981).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

我々は、筋生検材料の少量の試料からのヒト筋肉由来前駆体の選択的濃縮のためimmunomagentic選別手順を記載している。この手法は、線維芽細胞にヒト筋肉由来の文化の損失を克服するための、だけでなく、筋肉由来前駆細胞の異なる集団のユニークな振る舞いを理解するための私たちの研究室では非常に貴重なてきた。精製した後筋原細胞は、タンパク質および/または遺伝子発現の変化を調べ、または下流の実験のために使用することができる。 我々はまた、詳細蛍光顕微鏡の顕微鏡写真に関心の特定の領域を分析する迅速かつ簡単な方法で細胞精製に加えて。蛍光顕微鏡からデジタル画像は細胞生物学者を抽出するための情報が豊富に含まれています。実際の画素は必ずしも人間の目には識別できないデータを保持する。この技術では定量的なデータは、多数の周りを得ることができる<html>集団における個々の細胞の。フローサイトメトリーと比較した場合、画像解析のユニークな特徴は、細胞形状orcell - 細胞相互作用の変化を用いたタンパク質発現の変化を相関させる能力である。さらに、最適化された代表的な選択マスクを作成して保存する能力は、迅...

骨格筋の修復および再生は2,3筋原幹細胞、衛星細胞1の作用を必要とする。 インビボでこれらの細胞はあらゆるmyofibreの筋細胞膜と基底膜の間に位置して可逆的に静止状態で存在するが、増殖するように活性化され、ヒューズ及び筋肉組織として分化するが、損傷を受けた修理および3を再生する。衛星細胞は、酵素消化4を用いて、若年および高齢のヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋形成特性は、その後、初代培養5に研究することができる。細胞集団の両方の収率および純度に関して、この分離プロセスの効率は、使用される方法に依存し、サンプル間で変化し得る。酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型は、CD56 + /デスミン細胞、およびμとして最初に同定された衛 ​​星細胞（現在称される筋原細胞又は筋前駆細胞）、あるCD56として識別SCLE由来線維芽細胞、 -とTE7 +細胞5。線維芽細胞は、急速な増殖率を持っており、筋原細胞のような細胞間接触の際に不可逆的な増殖停止および最終分化を受けない。したがって、混合集団に、線維芽細胞は、文化を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。 線維芽細胞は、多くの場合、しかし、それ自体で研究の価値がある細胞のような線維芽細胞への関心の高まりは、それらが筋肉修復6時の筋原細胞との協力的な役割を持っていることが示されている、特にとして、今そこにある、筋肉の生物学者のための刺激として見てきた。ヒト筋肉異なる細胞型の単離および精製は、このように、培養中の両方の細胞型の先天性挙動を調査しようとしている方法論の重要な考慮事項である。蛍光活性化細胞選別（FACS）は、細胞は、さらなる研究のために選別することができる方法、および/または、計数し分析した。 FACSは、確実に、ヒト筋原細胞を濃縮することが示されているが、その後の培養のための細胞の収率は、これまで7高くはなかった。そのような老化4に関連した衛星細胞由来の筋原細胞と非常に貧しい増殖や分化などの体細胞の限定された複製の可能性を考えると、より穏やかなアプローチが必要とされる。シングル筋線維培養は別のは、あまり積極的で、彼らのsublaminalニッチと文化8,9におけるそれらの活性化の後にまだ常駐マウス衛星細胞を得る手段を提供。しかし、これは、この技術がヒト筋肉由来細胞を研究することに興味の多くの研究室にアクセス可能でないかもしれないことを意味する（繊維はめったに腱の腱から得ることができないため）、ヒト筋生検材料からしばしば不可能である。また、単繊維の技術は非常に限られた細胞数を提供する。 ここでは、GENに基づいて並べ替えのシステムを説明TLEの酵素コラゲナーゼを用いて細胞の消化と高純度（&gt; 95％筋原細胞）および収率（〜2.8×10 6±8.87×10 5細胞/両方を与えソーティング（MACS）、磁気活性化細胞の2連続ラウンドが続くディスパーゼ培養での実験のためのg組織）。 CD56は、in situ 10 およびインビトロ 11 におけるヒト衛星細胞の同定のためのゴールドスタンダード表面マーカーとみなされ、ビーズ結合のための理想的な表面マーカー候補を提供している。このアプローチのCD56に酸化鉄および多糖を含む超常磁性ビーズに結合した抗体を細胞に結合され、強磁場12,13に配置された高勾配磁気細胞分離カラムに通した。分離カラムは、強い磁場勾配を生成するそれらの表面に向かって磁力線を集中させる役割を果たす強磁性スチールウールや鉄球の行列（〜4tesla）14が充填されている。これらの列では、少しでも磁気細胞は、その表面14に引きつけられ吸着される。結合していない（CD56 - ）は、磁気マイクロビーズで標識されたCD56 +細胞は、磁界12,15から除去されるまで保持されているのに対し、細胞がカラムを通過する。 選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液は、さらなる実験のために所望の密度で播種することができる。細胞成分は免疫細胞化学を用いて同定することができる特定の介入後、広視野または共焦点蛍光顕微鏡を用いて画像化し、任意の画像内のすべての標識細胞の急速な客観的測定を可能にする画像解析手法を用いて定量的に分析した。筋原細胞一方で、ヒト線維芽細胞は容易に脂肪細胞への分化転換-私たちの研究室では、そのCD56を実証するために、画像解析16に続いて、この二重の免疫磁気ソーティングアプローチを使用していた衛星由来のsがこの脂肪生成変換5に対して非常に耐性がある。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ&nbsp;D</td><td>ロシュ&nbsp;</td><td></td><td></td>11088866001</tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma</td><td>D4693-1G</td><td>使用前にフィルター滅菌する必要があります</td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA(</td><td>Gibco) Invitrogen</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>100 &#956;m細胞ストレーナーBD</td><td>Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr>コラーゲン<tr><td>溶液(0.1%酢酸に3mg / ml)</td><td>シグマ、ドーセット、英国</td><td>C8919&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Minisart SRP15 シリンジフィルター (0.2 &#956;m)</td><td>ザルトリウス</td><td>17573ACK</td><td>ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)膜</td></tr><tr><td>CD56ヒトマイクロビーズ</td><td>Miltenyi</td><td>バイオテクノロジー130-050-401</td><td>マイクロビーズの限られた貯蔵寿命に注意してください</td></tr>抗<tr><td>線維芽細胞マイクロビーズ、ヒト</td><td>Miltenyi</td><td>バイオテクノロジー130-050-601</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu;m プレセパレーションフィルター</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>ラージセルカラム</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-202</td><td>これらのカラムにはフロー抵抗器が付属しています。ここで説明する高い筋原性純度を得るために、フロー抵抗器を使用する必要はありません。</td></tr><tr><td>LSカラム&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MiniMacs Seperator</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-102</td><td>このセパレーターは、大きなセルカラムには適合しますが、LSカラムには適合しません。&nbsp;</td></tr><tr><td>MidiMACS</td><td>ミルテニー・バイオテック&nbsp;</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACSマルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td></td><td>使用前にフィルター滅菌する必要があります</td></tr><tr><td>オイルレッドO</td><td>シグマ</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>リン酸トリエチル</td>シ<td>グマ</td><td>538728</td><td></td></tr><tr><td>Whatman ペーパー</td><td>シグ</td><td>マ Z241121-1PAK</td><td>No.42、アッシュレス。フィルターを準備するには、円形の濾紙を折りたたんで半円を作り、次に半円を再度半分に折りたたんで円錐形にします。コーンを濾過用の漏斗に取り付けます。&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Reagent</td><td>Molecular Probes, Invitrogen</td><td>P36930</td><td>DAPIの有無にかかわらず購入でき、初期蛍光を消光しません。</td></tr><tr><td>AxioVision</td><td>Carl Zeiss</td><td>Contact Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Adobe Photoshop CS5 Extended</td><td>Adobe(Pugh Computersから購入)</td><td>ADPH16982*&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

骨格筋の修復および再生は、常駐筋肉幹細胞である、衛星細胞の作用を必要とする。これらは、酵素消化を用いてヒト筋肉生検試料から単離することができ、それらの筋原性性質は、培養で研究。定量的には、酵素消化から得られた二つの主要な接着細胞型がある：CD56 +として最初に同定された（i）の衛星細胞は、（筋原細胞又は筋前駆細胞とも呼ばれる）、およびそれ以降のCD56 + /デスミン+細胞など、および（ii）muscle-とTE-7 + - CD56として識別由来の線維芽細胞、。線維芽細胞は培養液中で非常に効率的に増殖し、混合細胞集団においてこれらの細胞は、培養を支配する筋原細胞をオーバーランすることができる。培養中の細胞型のいずれかの生来の挙動を調査しようとしたときに、人間の筋肉とは異なる細胞型の単離および精製は、このように重要な方法論的な考慮事項である。ここでは、非難される両方の高純度（&gt; 95％筋原細胞）および良好な収率（〜を与えるコラゲナーゼを用いて細胞の穏やかな酵素消化に基づいて並べ替えや磁気活性化細胞選別（MACS）が続くディスパーゼのシステムをIBE 2.8×10 6±8.87培養での実験のためのin vitroでの 7日後に×10 5細胞/ g組織）。このアプローチは、CD56に対する抗体にコンジュゲートした磁気ビーズのビーズと混合筋肉由来細胞集団をインキュベートした後、磁場も細胞を通過させるに基づいている。細胞カラムを通過妨げられずに通過する- CD56が、一方、マイクロビーズに結合されたCD56 +細胞は、フィールドによって保持されている。選別プロセスの任意の段階からの細胞懸濁液を播種し、培養することができる。所与の介入、細胞の形態以下、核転写因子を含むタンパク質の発現および局在を免疫特異的な抗体で標識し、画像のpを用いて定量することができるrocessingと解析パッケージ。

精製された筋原細胞及び線維芽細胞は、脂肪生成のためのそれらの可能性を評価するための任意の場所の間で7〜30日間の脂肪生成栄養培地、続いて三日間脂肪細胞分化培地で培養することができる。脂肪生成および筋原性系統マーカーのための免疫染色と組み合わせて、精製された細胞集団を用いて、オイルレッドO染色のみ線維芽細胞画分は、脂肪細胞への分化が可能であったことを示した（ 図2）。線維芽細胞による脂肪の大量の蓄積は、肉眼（パネルA）に表示されており、それらの完全な分化は、核PPARγ（ 図2のパネルB＆Cおよび図3）の非常に強い発現によって示されている。 15日間の処置により、これらの細胞は、それらの基質（パネルD）に残っているTE-7（結合組織抗原）をリリースしている。これとは対照的に、筋原細胞がデスミンとミオシン重の発現を含む彼らの正常な表現型を維持チェーン（ 図2のパネルE＆F）および核PPARγ（ 図3C）をアップレギュレートしないでください。 <p class="jo...

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

この手順の全体的な目標は、ヒト筋生検サンプルから得られた 2 つの主要な細胞集団を高い効率と収率で分離し、特定の表現型および転写因子マーカーの評価を可能にすることです。これは、第1に、ヒト筋生検サンプルを第2ステップで単一細胞懸濁液に解離させることによって達成される。7日間の培養後、細胞は免疫磁気ビーズによって分離され、筋原性細胞であるCD56陽性と線維芽細胞であるCD56陰性画分に選別されます。次に、細胞を染色し、目的の表現型およびタンパク質マーカーについてイメージングします。最終的には、免疫蛍光顕微鏡法と定量的画像解析を使用して、選別された細胞集団内の選択された核局在転写因子の強度を測定できます。この技術の主な利点は、蛍光活性化細胞ソーティングのような既存の方法よりも免疫磁気細胞ソーティングを使用する、穏やかで、高収率と生存率でヒト初代筋細胞の優れたソーティングを可能にし、迅速に実行できることです。この技術の意味は、老化で観察される線維脂肪性筋変性の細胞基盤についての我々の理解を増進することにまで及び、また、多くの筋肉の病状において、生検を得た後できるだけ早く筋肉由来の前駆細胞を単離すること。まず、組織サンプルの重量を決定し、次に基礎培地で筋肉を数回膨らませて、サンプルから余分な血液を取り除きます。筋肉沈殿物を室温で30〜60秒間沈殿させ、チューブから最後の2〜3ミリリットルの媒体を除くすべてを吸引します。次に、チューブを滅菌ペトリ皿に反転させて、残りの液体が筋肉を皿に運ぶようにします。次に、明らかな脂肪や結合組織の目に見える部分のサンプルを洗浄します。次に、皿を回転させて残りの培地を動員し、すべての培地を吸引し、組織100〜400ミリグラムあたり3ミリリットルのコラゲナーゼとディスベ酵素溶液を加え、筋肉サンプルを非常に小さな1〜2ミリメートルの立方体に切断します。サンプルが十分にミンチされている場合。幅の広いイノシシの25ミリリットルピペットを使用して、組織片と酵素溶液を滅菌済みの10〜20ミリリットルの円錐管に移します。プレートをさらに3ミリリットルの酵素溶液で洗浄し、次に10ミリリットルのピペットを使用して、残っている筋肉の断片をチューブに移します。チューブを摂氏37度に60分間置きます。10ミリリットルのピペットで15分ごとに組織懸濁液を再形成します。次に、少なくとも同量の新鮮な再加温増殖培地で酵素的解離を終了します。次に、細胞懸濁液を100マイクロメートルのフィルターに通して大きな破片を取り除き、細胞を遠心分離します。ペレットを7〜8ミリリットルの増殖培地に懸濁し、コーティングされていないT25組織培養フラスコで細胞をインキュベートします。摂氏37度、二酸化炭素5%を7日間。週の終わりに、トリプシンは細胞単層を3分間観察します。細胞が分離したら、5〜10ミリリットルの骨格筋の成長、過剰消化を防ぐための培地を追加し、遠心分離によって細胞をペレット化します。次に、カウント後、細胞系譜マーカーの特性評価のために一部の細胞を予約し、残りの細胞を15ミリリットルのPBS遠心分離機ゲインで洗浄します。今回は、ペレットを室温で最大の170マイクロリットルのソーティングバッファーに再懸濁し、ピペットで穏やかに蘇生します。細胞を35マイクロリットルのよく混合された抗CD56抗体標識磁気マイクロビーズで懸濁します。細胞溶液をピペットで数回混合し、穏やかな植生で4°Cの15分間インキュベートします。インキュベーション後の中間点で、細胞とビーズ溶液を10ミリリットルのソーティングバッファー遠心分離機とreusで洗浄します。ペレットを1ミリリットルの新鮮な選別緩衝液に懸濁します。次に、プレス分離フィルターとカラムを500マイクロリットルのソーシングバッファーで潤滑します。そして、直ちに1ミリリットルの細胞懸濁液全体をプレス分離フィルターを介してカラムに混合し、カラムを3回すすぎ、1ミリリットルのソースバッファーパワーウォッシュでカラムを3回すすぎ、非保持線維芽細胞画分を収集し、カラムを通過して少量の成長培地を含む滅菌50ミリリットルの円錐管に入れます。次に、カラムを磁石から取り外し、プランジャーをカラムの上部に押し込んで、CD 56正のセル画分を収集します。温成長を含む別の50ミリリットルの円錐管では、このステップから中程度の成長培地が放出されます。ダブルソーティングを実行する場合は、収集した正と負のセル画分を検討します。純度を高めるためにダブルソーシングが必要な場合は、最初のソーティングでCD 56ポジティブコレクションチューブに培地を入れず、適切な実験エンドポイントでフィルターとカラムの潤滑から手順を繰り返します。CD56陽性細胞培養物を、等量の氷冷、8%パラホルムアルデヒドを使用して、培養培地に固定します。なだらかな植生の10分間。次に、固定液を吸引し、細胞をPBSで2回洗浄して、細胞表面抗原を免疫染色します。PBS中の1%BSAで細胞を少なくとも1時間ブロックし、その後、関連する一次抗体、次に二次抗体で細胞を標識します。検出器、ゲイン、レーザー出力、露光設定を顕微鏡や染色剤に関連づけて最適化します。イメージングの前に、細胞は必要な数の検出チャネルと6つ以上の異なる視野で細胞の画像を撮影します。解析するには、適切な TIFF 画像ファイルを開き、画像を互いにドラッグして、対応する適切なチャンネルをオーバーレイします。各チャンネルは、レイヤーパネルに個別のレイヤーとして表示されます。次に、分析ウィンドウで、データポイントの選択を選択し、次にカスタムを選択して、目的の測定値を選択します。核蛍光強度を分析するには、色範囲ダイアログボックスを開き、ドロップダウンメニューからサンプリングされた色を選択します。次に、Shiftキーを押しながら、ラベル化された核に固有のトーンを選択します。「保存」をクリックすると、このカラー範囲選択マスクを、同じセッションで選択した他の画像で使用するために保存できます。原子核を選択したら、クリックして塗りつぶしを選択します。次に、ドロップダウンメニューから黒を選択し、不透明度が100%に設定されていることを確認します次に、[選択]と[反転]をクリックします。次に、右クリックしてもう一度[塗りつぶし]を選択し、ドロップダウンメニューから白い塗りつぶしを選択します。分水嶺アルゴリズムを実行して、バイナリーになった原子核層上の部分的に重なり合う原子核を分離します。次に色範囲を選択し、次にシャドウに移動して、個々の分離された核を選択します。次に、目的のマーカーの16ビットグレースケール画像を含むレイヤーに選択範囲を転送し、[測定値の記録]をクリックします。最後に、選択した測定値をテキストファイルとして適切な分析ソフトウェアにエクスポートし、さらにオイルを処理します。脂肪原性および筋原性系統マーカーの免疫染色と組み合わせた精製細胞集団の赤色染色は、線維芽細胞画分のみがエピジェニック分化が可能であり、線維芽細胞による脂肪の大量蓄積が肉眼で見えること、および治療の15日目までにこれらの細胞による核PPARガンマの強力な発現によるそれらの完全な形質転換をさらに実証できることを明らかにしています。 これらの細胞は、残りのTE seven A結合組織抗原を基質上に放出しています。対照的に、筋原性細胞は、核PPARガンマ発現のアップレギュレーションなしに、デスミンおよびミオシン重鎖の発現を含む正常な表現型を維持します。この図では、Desmond陽性筋原性細胞のフィールドとこれらのデータが得られたフィールドの定量分析の例を示し、この特定の播種密度と時点における個々の核の筋原性発現の変動を示しています。このグラフでは、異なる細胞タイプの転写因子レベルを細胞レベルで直接比較するこの方法の有用性が示されています。例えば、これらのCD56陰性筋線維芽細胞は、高レベルの核脂肪形成転写因子であるPPARガンマを発現するが、一方、各種のCD56陽性筋原性細胞は、脂肪細胞誘導媒体への曝露後に非常に低いレベルの核内受容体転写因子のみを維持する。この技術により、筋生物学の分野の研究者は、健康な筋肉サンプルまたは病理学的なヒト筋肉サンプルにおける細胞運命決定のメカニズムを探求することができます。このビデオをご覧になった方は、まず、精製され、十分に特性評価されたヒト筋由来細胞を高収率で得る方法、次に、免疫蛍光染色によって同定された細胞成分の客観的な定量分析を行う方法について、十分に理解しているはずです。

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Research

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Developmental Biology

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