メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

以下の実験の全体的な目標は、活性化されたメチル基とaomeと呼ばれる補因子Sile lメチオニンをD-N-A-R-N-Aに自然に移行させるメチルトランスフェラーゼを使用してDNAとタンパク質を特異的に標識することです。タンパク質または小さな生体分子。ワンステップ標識は、天然補因子の省略を、全体の補因子の酵素的結合につながる反応の経過を変える合成アイン補因子に置き換えることによって達成され、したがって、基質配列の共有結合標識DNAの特異的メチルトランスフェラーゼ誘導標識は、アディーン特異的DNAメチルトランスフェラーゼ、M-B-S-E-Cで実証される。 これは、ビオチン化Aine補因子6BAZをA-G-C-G-A-T認識配列に結合させ、特にビオチン化DNAメチルトランスフェラーゼの活性化基の転写を指示することは、標識タンパク質の使用であり、C8oinからヒストンH3のリジン4にプロパルゴ基を転写するMTAsセット79を使用して実証されています。

アルキル化リジン残基は、銅触媒クリックケミストリーを使用してアジ修飾蛍光体によって化学的に標識されるため、特異的に標識されたタンパク質が得られます。標識にメストランスフェラーゼを使用する利点は、天然基質を直接標的とする可能性があることです。これを、プラスミド、DNAメストランスフェラーゼ、補因子アナログジンによる触媒タンパク質修飾の配列特異的なbioTE高揚によって実証し、さまざまなレポーターグループの導入を2つのステップで

これを、ヒソンH 3タンパク質の蛍光標識と、ビオチンによるH 3の標識結果を示すことで実証します。さらに、二重活性化補因子ランアナログは、メチル基転移後の補因子生成物であるS ail, el homocysteineを様々な活性アルコールと共にロードすることにより、容易に合成することができます。合成補因子類似体は逆相HPLCによって精製され、場合によっては、エピ火星を硫黄で分離することさえ可能です。

Smiling DNAは、DNAの配列特異的なメチルトランスフェラーゼ誘導標識です。ここでは、PB 3 22プラスミドDNAを6つのBAZ Aine補因子とアディーン特異的DNAメチルトランスフェラーゼで標識することにより、この概念を実証しています。M-B-S-E-Cは、摂氏20度で6つのBAZをホーイングすることから始まります。

考えたら、氷上で反応混合物を修復します。これには、プラスミドのマイクログラム、6つのBAZの60マイクロモル、および10相当のM-B-S-E-C oneが含まれています。修飾バッファー中のDNA上のHER認識配列。

6つのBAZとM-B-S-E-Cを最後に1つ追加してください。天然の補因子が標識をブロックするため、使用しているメストランスフェラーゼにAMEが結合していないことを確認してください。React For コントロール。

MTAを水で置き換えて非特異的な補因子修飾を視覚化し、補因子の代わりに水を追加して酵素濃縮物中の天然補因子をテストします。次に、反応をピペットで穏やかに混合し、摂氏55度で1時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに向かって、10マイクロリットルの10 x 組換えタコネス、1つのバッファーを80マイクロリットルの水に加え、次に3.3マイクロリットルのリコンビナントタク1制限エンドヌクレアーゼを添加することにより、氷上でエンドヌクレアーゼ混合物を修復します。

インキュベーション後、クイックスピンで反応を引っ張り、それぞれにDNA修飾を確認します。10 x takの2マイクロリットル、1つのバッファー、および28マイクロリットルのエンドヌクレアーゼ混合物を追加します。反応を穏やかなピペッティングで混合します。

次に、反応を摂氏65度で30分間インキュベートします。反応が完了したら、すばやく回転させて溶液を引っ張り、25マイクロリットルの反応を新しいチューブに集めます。これらのアリコートに、ストレプトアジンのモノマーあたり1ミリモルで緩衝された2.4マイクロリットルの連鎖球菌TTRを追加します。.

次に、この反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、完了した反応に5マイクロリットルの6×ローディングバッファーを加え、1%アグロスゲルで80ボルトで約10マイクロリットルを約1時間使い果たします。次に、バンドを視覚化しますmt Aは、活性化基のメチルトランスフェラーゼ指向性移動の略語です。

このデモンストレーションでは、メチルトランスフェラーゼは7、9、および二重活性化補因子Cを8に設定しました。Oinは、彼のヒストンHのうち4をリジンと分類するために使用されます。氷修復20マイクロリットルの反応混合物で成分を解凍した後、アッセイ溶液は、ヒストンH 3の修飾緩衝液10マイクロモルを含み、最後の10マイクロモルのメチルトランスフェラーゼと600マイクロモルの補因子を添加した。

C eight ONを脱イオン水に置き換えることにより、酵素制御を行います。また、合成補因子と競合するように出会った60ミリモルのADOを含めることにより、非特異的な修飾を視覚化する補因子コントロールを作成します。次に、反応を低速パイプペストと混合し、テストストリップでpHを確認します。二重活性化補因子類似体はC条件下で保存されます。

したがって、反応溶液のpHは、必要に応じて少量の50ミリモル水酸化ナトリウムで補因子を添加してpHを調整することで変化させることができます。次に、インキュベーション修復中に37°Cで反応を2時間インキュベートします。インキュベーションが終了する直前に12%SDSポリアクリルアミドゲルを、3ミリモルの硫酸銅、3ミリモルのT-H-P-T-Aリガン250ミリモル、ACOナトリウム餌、および6ミリモルのタマラアジドを含む5×クリックミックスの20マイクロリットルを作ります。

インキュベーションの終わりに、各反応に5マイクロリットルのクリックミックスを加え、ペッティングごとに反応をゆっくりと混合します。ホイルを使用して反応を光から保護し、摂氏20度で1時間インキュベートします。1時間後、タンパク質を沈殿させて余分なクロロホルムを取り除きます。

75マイクロリットルのメタノール、18.7マイクロリットルのクロロホルム、および50マイクロリットルの水を各反応に加え、それらを短時間ボルテックスします。各チューブを準備した後、16, 000 Gで5分間スピンダウンします。タンパク質を含む界面層を乱すことなく、分離の上層を除去します。

次に、56.3マイクロリットルのメタノール、下相、および渦を追加します。次に、これをスピンダウンしてタンパク質をペレット化し、仰臥位を廃棄します。次に、56.3マイクロリットルのメタノールを追加します。

再び、渦。スピンを繰り返し、ペレットを回収します。ペレットをチューブで乾かし、蓋を外し、糸くずの出ない紙で覆います。

その後、タンパク質を20マイクロリットルのSDSローディングバッファーにローディング色素で溶解します。チューブ壁をバッファーですすいで、ペレットを収集します。次に、チューブを摂氏95度で10分間インキュベートします。

チューブが室温に戻ったら、チューブを短時間使用して内容物を引き出し、SDSページでタンパク質を視覚化します。120ボルトで約90分間運転します。微笑み反応は、二本鎖A-T-C-G-A-T配列内の第2アデニン残基を修飾し、PBR 3 2 2プラスミド上に1つの認識部位を持つDNAメチルトランスフェラーゼM-B-S-E-C oneを用いて行われました。

PB 3 2 2は、PB 3 22に緑色でマークされた7つの部位があり、そのうちの1つがM-B-S-E-C one部位に含まれる組換え制限エンドヌクレアーゼT oneで異議を唱えられました。標識が発生した場合、この部位はゲル内の切断から保護する必要があります。これは確認されました。

683塩基対の新しいフラグメントが現れ、M-B-S-E-Cの1つの部位に標識があることを示しました。これは、アッセイレーン(レーン3)でのみ見られます。標識反応の特異性は、エレクトロモビリティシフトによって実証されました。

ストレプトアジンを添加すると、ビオチンで標識された683塩基対フラグメントのエレクトロモビリティが遅延しました。M-B-S-E-Cを欠いたフラグメントの移動度は変わらなかったが、1つの部位、またはメチルトランスフェラーゼ基質を二重活性化8つのOHメットアナログで2ステップ標識した。ヒストンH 3リジン4メチルトランスフェラーゼセット7 9と小さなC 8 ON補因子を使用した。

ゲル電気泳動は、アッセイレーンのみの蛍光検出に使用しました。レーン1は、ヒストンH 3に対応する蛍光バンドを示し、補因子の側鎖が特異的に転移し、修飾タンパク質がTamara Flora.Fourで標識されたことを示しています。ESI染色は、ローディング制御として機能します。

すべてのレーンで同じ量のタンパク質が示されました。メチルトランスフェラーゼ基質は、アジ由来のビオチンとのビオチン反応で標識することもできます。Fluorの代わりに、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いたウェスタンブロッティングによるアッセイが行われました。

このビデオを見た後、共役のAdenが成功し、特定のラベリングが見られました。DNAおよびタンパク質配列の標識方法、特にアフィニティーテキスト、Fluor force、またはその他の標識について十分に理解している必要があります。この手順を試みる際には、他のmetとその類似体が温度に敏感であることを覚えておくことが重要です。

常に氷上で取り扱い、マイナス20°Cで保管してください。ダブルアクティベートを合成しました。レポーターグループがすでに側鎖に組み込まれており、それらを使用してワンステップでDNAを特異的に標識する他のMETアナログ。

特に、1分子技術を使用してDNAマッピングのために、さまざまな酵素とレポートグループを組み合わせるという見通しに興奮しています。スマイリングとNECは非常に柔軟性があり、適切な覚醒剤の転写により、DNAやタンパク質だけでなく、RNAやsmallにもほとんどすべての化学基を移行することができます。