メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化
2014年11月22日
DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。
以下の実験の全体的な目標は、活性化されたメチル基とaomeと呼ばれる補因子Sile lメチオニンをD-N-A-R-N-Aに自然に移行させるメチルトランスフェラーゼを使用してDNAとタンパク質を特異的に標識することです。タンパク質または小さな生体分子。ワンステップ標識は、天然補因子の省略を、全体の補因子の酵素的結合につながる反応の経過を変える合成アイン補因子に置き換えることによって達成され、したがって、基質配列の共有結合標識DNAの特異的メチルトランスフェラーゼ誘導標識は、アディーン特異的DNAメチルトランスフェラーゼ、M-B-S-E-Cで実証される。 これは、ビオチン化Aine補因子6BAZをA-G-C-G-A-T認識配列に結合させ、特にビオチン化DNAメチルトランスフェラーゼの活性化基の転写を指示することは、標識タンパク質の使用であり、C8oinからヒストンH3のリジン4にプロパルゴ基を転写するMTAsセット79を使用して実証されています。
アルキル化リジン残基は、銅触媒クリックケミストリーを使用してアジ修飾蛍光体によって化学的に標識されるため、特異的に標識されたタンパク質が得られます。標識にメストランスフェラーゼを使用する利点は、天然基質を直接標的とする可能性があることです。これを、プラスミド、DNAメストランスフェラーゼ、補因子アナログジンによる触媒タンパク質修飾の配列特異的なbioTE高揚によって実証し、さまざまなレポーターグループの導入を2つのステップで
可能にします。これを、ヒソンH 3タンパク質の蛍光標識と、ビオチンによるH 3の標識結果を示すことで実証します。さらに、二重活性化補因子ランアナログは、メチル基転移後の補因子生成物であるS ail, el homocysteineを様々な活性アルコールと共にロードすることにより、容易に合成することができます。合成補因子類似体は逆相HPLCによって精製され、場合によっては、エピ火星を硫黄で分離することさえ可能です。
Smiling DNAは、DNAの配列特異的なメチルトランスフェラーゼ誘導標識です。ここでは、PB 3 22プラスミドDNAを6つのBAZ Aine補因子とアディーン特異的DNAメチルトランスフェラーゼで標識することにより、この概念を実証しています。M-B-S-E-Cは、摂氏20度で6つのBAZをホーイングすることから始まります。
考えたら、氷上で反応混合物を修復します。これには、プラスミドのマイクログラム、6つのBAZの60マイクロモル、および10相当のM-B-S-E-C oneが含まれています。修飾バッファー中のDNA上のHER認識配列。
6つのBAZとM-B-S-E-Cを最後に1つ追加してください。天然の補因子が標識をブロックするため、使用しているメストランスフェラーゼにAMEが結合していないことを確認してください。React For コントロール。
MTAを水で置き換えて非特異的な補因子修飾を視覚化し、補因子の代わりに水を追加して酵素濃縮物中の天然補因子をテストします。次に、反応をピペットで穏やかに混合し、摂氏55度で1時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに向かって、10マイクロリットルの10 x 組換えタコネス、1つのバッファーを80マイクロリットルの水に加え、次に3.3マイクロリットルのリコンビナントタク1制限エンドヌクレアーゼを添加することにより、氷上でエンドヌクレアーゼ混合物を修復します。
インキュベーション後、クイックスピンで反応を引っ張り、それぞれにDNA修飾を確認します。10 x takの2マイクロリットル、1つのバッファー、および28マイクロリットルのエンドヌクレアーゼ混合物を追加します。反応を穏やかなピペッティングで混合します。
次に、反応を摂氏65度で30分間インキュベートします。反応が完了したら、すばやく回転させて溶液を引っ張り、25マイクロリットルの反応を新しいチューブに集めます。これらのアリコートに、ストレプトアジンのモノマーあたり1ミリモルで緩衝された2.4マイクロリットルの連鎖球菌TTRを追加します。.
次に、この反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、完了した反応に5マイクロリットルの6×ローディングバッファーを加え、1%アグロスゲルで80ボルトで約10マイクロリットルを約1時間使い果たします。次に、バンドを視覚化しますmt Aは、活性化基のメチルトランスフェラーゼ指向性移動の略語です。
このデモンストレーションでは、メチルトランスフェラーゼは7、9、および二重活性化補因子Cを8に設定しました。Oinは、彼のヒストンHのうち4をリジンと分類するために使用されます。氷修復20マイクロリットルの反応混合物で成分を解凍した後、アッセイ溶液は、ヒストンH 3の修飾緩衝液10マイクロモルを含み、最後の10マイクロモルのメチルトランスフェラーゼと600マイクロモルの補因子を添加した。
C eight ONを脱イオン水に置き換えることにより、酵素制御を行います。また、合成補因子と競合するように出会った60ミリモルのADOを含めることにより、非特異的な修飾を視覚化する補因子コントロールを作成します。次に、反応を低速パイプペストと混合し、テストストリップでpHを確認します。二重活性化補因子類似体はC条件下で保存されます。
したがって、反応溶液のpHは、必要に応じて少量の50ミリモル水酸化ナトリウムで補因子を添加してpHを調整することで変化させることができます。次に、インキュベーション修復中に37°Cで反応を2時間インキュベートします。インキュベーションが終了する直前に12%SDSポリアクリルアミドゲルを、3ミリモルの硫酸銅、3ミリモルのT-H-P-T-Aリガン250ミリモル、ACOナトリウム餌、および6ミリモルのタマラアジドを含む5×クリックミックスの20マイクロリットルを作ります。
インキュベーションの終わりに、各反応に5マイクロリットルのクリックミックスを加え、ペッティングごとに反応をゆっくりと混合します。ホイルを使用して反応を光から保護し、摂氏20度で1時間インキュベートします。1時間後、タンパク質を沈殿させて余分なクロロホルムを取り除きます。
75マイクロリットルのメタノール、18.7マイクロリットルのクロロホルム、および50マイクロリットルの水を各反応に加え、それらを短時間ボルテックスします。各チューブを準備した後、16, 000 Gで5分間スピンダウンします。タンパク質を含む界面層を乱すことなく、分離の上層を除去します。
次に、56.3マイクロリットルのメタノール、下相、および渦を追加します。次に、これをスピンダウンしてタンパク質をペレット化し、仰臥位を廃棄します。次に、56.3マイクロリットルのメタノールを追加します。
再び、渦。スピンを繰り返し、ペレットを回収します。ペレットをチューブで乾かし、蓋を外し、糸くずの出ない紙で覆います。
その後、タンパク質を20マイクロリットルのSDSローディングバッファーにローディング色素で溶解します。チューブ壁をバッファーですすいで、ペレットを収集します。次に、チューブを摂氏95度で10分間インキュベートします。
チューブが室温に戻ったら、チューブを短時間使用して内容物を引き出し、SDSページでタンパク質を視覚化します。120ボルトで約90分間運転します。微笑み反応は、二本鎖A-T-C-G-A-T配列内の第2アデニン残基を修飾し、PBR 3 2 2プラスミド上に1つの認識部位を持つDNAメチルトランスフェラーゼM-B-S-E-C oneを用いて行われました。
PB 3 2 2は、PB 3 22に緑色でマークされた7つの部位があり、そのうちの1つがM-B-S-E-C one部位に含まれる組換え制限エンドヌクレアーゼT oneで異議を唱えられました。標識が発生した場合、この部位はゲル内の切断から保護する必要があります。これは確認されました。
683塩基対の新しいフラグメントが現れ、M-B-S-E-Cの1つの部位に標識があることを示しました。これは、アッセイレーン(レーン3)でのみ見られます。標識反応の特異性は、エレクトロモビリティシフトによって実証されました。
ストレプトアジンを添加すると、ビオチンで標識された683塩基対フラグメントのエレクトロモビリティが遅延しました。M-B-S-E-Cを欠いたフラグメントの移動度は変わらなかったが、1つの部位、またはメチルトランスフェラーゼ基質を二重活性化8つのOHメットアナログで2ステップ標識した。ヒストンH 3リジン4メチルトランスフェラーゼセット7 9と小さなC 8 ON補因子を使用した。
ゲル電気泳動は、アッセイレーンのみの蛍光検出に使用しました。レーン1は、ヒストンH 3に対応する蛍光バンドを示し、補因子の側鎖が特異的に転移し、修飾タンパク質がTamara Flora.Fourで標識されたことを示しています。ESI染色は、ローディング制御として機能します。
すべてのレーンで同じ量のタンパク質が示されました。メチルトランスフェラーゼ基質は、アジ由来のビオチンとのビオチン反応で標識することもできます。Fluorの代わりに、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いたウェスタンブロッティングによるアッセイが行われました。
このビデオを見た後、共役のAdenが成功し、特定のラベリングが見られました。DNAおよびタンパク質配列の標識方法、特にアフィニティーテキスト、Fluor force、またはその他の標識について十分に理解している必要があります。この手順を試みる際には、他のmetとその類似体が温度に敏感であることを覚えておくことが重要です。
常に氷上で取り扱い、マイナス20°Cで保管してください。ダブルアクティベートを合成しました。レポーターグループがすでに側鎖に組み込まれており、それらを使用してワンステップでDNAを特異的に標識する他のMETアナログ。
特に、1分子技術を使用してDNAマッピングのために、さまざまな酵素とレポートグループを組み合わせるという見通しに興奮しています。スマイリングとNECは非常に柔軟性があり、適切な覚醒剤の転写により、DNAやタンパク質だけでなく、RNAやsmallにもほとんどすべての化学基を移行することができます。
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概要
この研究は、メチル基転移酵素を用いたDNAおよびタンパク質の配列特異的ラベリングに焦点を当てています。合成補酵素アナログを用いることで、研究者は基質の1ステップまたは2ステップのラベリングを達成します。
研究の主要な構成要素
科学の分野
- 生化学
- 分子生物学
- タンパク質化学
背景
- メチル基転移酵素は、活性化されたメチル基を基質に自然に移します。
- 合成補酵素アナログは反応経路を変更することができます。
- 配列特異的ラベリングは生体分子の研究に重要です。
- ラベリングはネイティブ基質を効果的に標的とすることができます。
研究の目的
- メチル基転移酵素を用いたDNAとタンパク質の特定のラベリングの使用を示す。
- 酵素反応における合成補酵素アナログの可能性を探る。
- メチル基転移酵素の触媒を通じて様々な報告基を導入する。
使用された方法
- ラベリングにアジリジンと二重活性化補酵素アナログの使用。
- DNAメチル基転移酵素へのビオチン化補酵素の適用。
- タンパク質ラベリングのための銅触媒化クリックケミストリー。
- プラスミドDNAの配列特異的ビオチン化。
主な結果
- 特定のメチル基転移酵素を用いたDNAの1ステップラベリングの成功。
- 酵素的転移によるタンパク質ラベリングのデモンストレーション。
- 2ステップラベリングを通じた多様な報告基の導入。
- ネイティブ基質を効果的に標的とできる可能性が示された。
結論
- メチル基転移酵素は配列特異的ラベリングの効果的なツールです。
- 合成補酵素は酵素的ラベリングの能力を拡大します。
- このアプローチは生体分子相互作用の研究を強化できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Sequence-specific labeling of nucleic acids and proteins using methyltransferases and cofactor analogues enables precise, covalent modification of target biomolecules. This approach supports target validation and assay development by providing a direct readout of enzyme-substrate interactions. It enhances predictive confidence in early discovery by allowing functional interrogation of methylation-dependent pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of methyltransferase substrate specificity and pathway interrogation.
- Operational Value: Provides a direct, sequence-specific readout for validating enzyme activity.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking of epigenetic targets through covalent labeling of native substrates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, covalent labels for high-confidence detection of methyltransferase activity.
- Operational Value: Enables standardized assay formats using biotin or fluorescent reporters for downstream detection.
- Scalability: Supports multiplexing via distinct cofactor analogues and reporter groups for parallel target profiling.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Labels native histone and DNA substrates, enabling biomarker-aligned readouts in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Confirms on-target activity of epigenetic modulators in preclinical models.
- Pathway Clarification: Maps methylation-dependent signaling cascades through site-specific protein and nucleic acid labeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a functional readout for methyltransferase activity, supporting lead identification and preclinical validation through direct substrate labeling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling covalent labeling of known methylation sites on DNA and histone proteins.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs via biotinylation or fluorescence labeling for compound effect assessment.
- Analytics: Generates detectable modifications (e.g., streptavidin shift, fluorescence) that allow comparison of enzyme activity across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by labeling native substrates in chromatin and plasmid systems relevant to epigenetic regulation.
- Enterprise Reuse: Platform technology adaptable across DNA, RNA, protein, and small molecule targets using interchangeable cofactor analogues.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in epigenetic regulation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and covalent signal stability for longitudinal tracking.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in epigenetic drug discovery.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on direct, enzyme-specific labeling evidence.
Implementation Considerations
- Expertise in enzymology, protein purification, and cofactor handling required.
- Need for temperature-controlled storage (-20°C) and ice-based handling of labile cofactor analogues.
- Requirement for detection systems such as streptavidin-based gels or fluorescence imaging.
- Adaptation considerations for different methyltransferases and substrate contexts (DNA, RNA, protein).
- pH sensitivity of reactions may require adjustment with sodium hydroxide during setup.
