Name: メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: 学ぶメチルトランスフェラーゼを用いたDNAとタンパク質の配列特異的標識化法。合成補因子類似体により、1段階または2段階の標識が可能となり、生体内基質の直接標的化や多様なレポーター基導入が実現する。

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著者は、MTases、M.BseCI、Set7/9を準備してくれたKerstin Glenskに感謝し、ドイツ連邦政府と州政府、アーヘン工科大学のExcellence Initiativeによる資金提供に感謝します。著者らは、共同研究のために6BAzとSeAdoYn、またはその他の補因子類似体を提供できることを嬉しく思います。

1.一般手順<ol><li>ストアアジリジン補助因子（DMSO中）6BAzとタンパク質MTアーゼ-80℃でSET7 / 9と二重活性化補助因子SeAdoYnとDNA MTアーゼM.BseCI -20℃（50％グリセロール）を含むすべての他の試薬。 </li><li>脱イオン水に吸光係数ε269nmで （6BAz）= 16000センチメートル-1 M -1およびε260nmの （SeAdoYn）= 15400センチメートル-1 M -1用いたUV /可視分光法を経由して 6BAzとSeAdoYnの濃度を決定する。吸光係数は、280nmでの直接吸収を介して利用可能である場合には、ブラッドフォードアッセイによってMTアーゼの濃度を決定するか。 </li><li>酵素活性の損失を防ぐために、集中的なペッティングまたはボルテックスにより気泡を作成しないようにしてください。その代わりに、優しく上下にピペッティングにより混合します。 </li><li> DMSO中のストック溶液からアジリジン補助因子を追加する場合はアッセイにおける最終DMSO濃度は低いことを確認してください5％未満。常にDNAとの非特異的反応を防止するアッセイ緩​​衝液中の10mMのマグネシウムイオンが挙げられる。 </li><li>酸性のストック溶液から二重に活性化補助因子を追加する場合はpH変化を回避し、アッセイ溶液のpHが大きく変化しないことを確認するために小容量（高濃縮ストック溶液）を使用します。彼らは必要な銅イオンの錯体形成によってクリック反応を妨害することができるので、アッセイ緩衝液中で、チオールを避けるため、 例えば 、βメルカプトエタノールまたはジチオスレイトール（DTT）。 </li></ol>アジリジン補因子を介した DNAの2つのステップのラベル<ol><li> M.BseCI DNA MTアーゼおよびアジリジン補助因子6BAzプラスミドDNAの配列特異的メチルトランスフェラーゼ誘発ラベルING（笑顔）。 <ol><li> 20℃における補因子ソリューションを解凍し、氷上で反応混合物を準備します。 </li><li>検定に加えて任意の非固有の変更を可視化するために、「補因子」の制御を行う、とAN＆＃8220。酵素」コントロールは、MTアーゼの準備は、自然補因子のAdoMetがないことを確認します。 </li><li> （100 mMトリス-塩酸を含む、100のMgCl 2、20 mMのβメルカプトエタノール、pH7.4）で10倍の修正バッファ、pBR322の2μL（0.5μgの/μL）、10当量のアッセイミックス2μlのために。 DNA上の認識配列（pBR322の中で1認識配列）と20μlの総体積内の60μMの最終濃度にアジリジン補助因子6BAzあたりM.BseCI。最後の補因子とDNA MTアーゼを追加します。 注：βメルカプトエタノールは、毒性、腐食性、環境に有害である。 </li><li> 「補因子」制御のために代わりにM.BseCIの脱イオン水を追加し、「酵素」コントロールには6BAzの代わりに脱イオン水を追加します。 </li><li>優しく上下にピペッティングすることによって溶液を混合。 </li><li> 1時間55℃でチューブをインキュベートします。 </li><li>チューブの底にすべての液体を回収するための遠心分離を簡単に。 </li></ol></li><li> DNA修飾を確認するための制限修飾アッセイ。 <ol><li> 、80μlの脱イオン水および3.3液（100mMのトリス-HCl、50mMのMgCl 2を 、1 MのNaCl、1mg / mlのウシ血清アルブミン、pHが8.0を含む）10μlの10×R.TaqI緩衝液を混合して溶液を調製サーマス·アクアティクス （R.TaqI、10 U /μL）から制限エンドヌクレアーゼ（REase）。最後のステップでREaseを追加してください。 </li><li>各チューブに2.1.7から10倍のR.のTaqIバッファと上から溶液（2.2.1）の28μLの2μlを添加する。 </li><li>優しく上下にピペッティングすることによって溶液を混合。 </li><li> 30分間65℃でチューブをインキュベートします。 </li><li>チューブの底にすべての液体を回収するための遠心分離を簡単に。 </li></ol></li><li>ストレプトアビジンとの電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）は、機能的な変更を確認します。 <ol><li>各チューブ（2.2.5）からの25μlのを削除し、ストレプトアビジンMに対するストレプトアビジン溶液（1 mMと2.4μlを添加するonomerの100mMのNa 2 HPO 4を含有するストレプトアビジン緩衝液中で、100mMのNaCl、pH7.5で、総ビオチンの4当量）。残りのチューブにストレプトアビジンバッファーの2.4を添加する。 </li><li> 1時間、37℃ですべてのチューブをインキュベートします。 </li></ol></li><li>アガロースゲル電気泳動による分析。 <ol><li>各チューブに6Xローディングバッファー（0.25％ブロモフェノールブルー、30％グリセロール）の5μlを添加する。 </li><li>優しく溶液を混合。 </li><li>負荷（10,000倍ストック溶液から1×GelRedを含む0.5×TBE緩衝液中の1％アガロース）アガロースゲルのウェルに10μlの各サンプル。 </li><li>約80 Vで0.5×TBE緩衝液でゲルを実行します。 1時間。 </li><li>フィルタ（540±50 nm）とを備えたCCDカメラ（312 nm）のUVテーブル上でDNAバンドを可視化する。 注：UV光が目や皮膚に損傷を与えている。 </li></ol></li></ol>ダブル活性化補助因子を介した 3つの段階のタンパク質標識<ol><li> MethyltransfヒストンH3リジン4ラベリング（改質工程）のためのSET7 / 9と二重活性化補助因子SeAdoYnで活性化グループ（MTAG）の譲渡を消去し、指示した。 <ol><li>コンポーネントを解凍し、氷上で反応混合物を準備します。注：必ずSeAdoYn劣化を避けるために冷却して続ける。 </li><li>アッセイに加えて、任意の非特異的改変を可視化するために、「補因子」制御を実行し、「酵素」制御は、蛍光プローブの非特異反応を除外する。 </li><li>修正緩衝液（50mMのTris-HCl、5％グリセロール、pH8.5）中、10μMヒストンH3、10μMSET7 / 9及び600μMSeAdoYn（セレンの両エピマーの混合物）を含有するアッセイ溶液（20μl）を調製する。最後のステップでは、次に補因子とMTアーゼを追加します。 </li><li> 「補因子」コントロール3.1.3のようにアッセイ溶液を準備し、合成補助因子と競争する60 mMののAdoMetを追加します。 「酵素」制御のために代わりにSeAdoYnの脱イオン水を追加します。</li><li>ゆっくり上下にピペッティングすることによって溶液を混合。 pHのストリップ（ - 10 pH範囲5）の上部のフィールドに各溶液1μlを添加してpHを確認してください。 </li><li> 2時間37℃でインキュベートする。 </li><li> 1：0.1％（w / v）のAPS、0.04％の（v / v）のTEMED 12％アクリルアミド/ビスアクリルアミド37.5 357 mMのビス - トリスpHが6.5〜6.8、：一方のゲルを実行して（12％SDSポリアクリルアミドゲルを調製で;ローディングゲル：357 mMのビス - トリスpHが6.5〜6.8、0.1％APS（w / v）の、0.04％（v / v）のTEMEDと5％アクリルアミド/ビスアクリルアミド37.5：1）。 注：アクリルアミド/ビスアクリルアミドは毒性と健康に危険である。この手順の間に手袋を着用してください。 </li></ol></li><li>銅触媒アジド-アルキン環（CuAAC）（標識工程） を介してヒストンH3でalkinylatedリジン4の化学標識。 <ol><li>修飾反応の終了は、3 mMのCuSO 4を、3 mMのトリス（3-ヒドロキシプロピルトリアゾリル）アミン（THPTA）、250mMのアスコルビン酸ナトリウムおよび6 mMのTAMRAアジドを含有する5倍クリックミックスを調製する直前20μlの総容量。 </li><li> CuAACを開始し、修飾反応をクエンチするために各チューブに調製したばかりの5倍のクリックミックスの5μlを添加する。 </li><li>ピペッティングにより穏やかに混合します。 </li><li>フォアの光退色を避けるために、光からアルミホイルで全てのチューブを保護します。 </li><li> 1時間20℃でインキュベートする。 </li></ol></li><li>無料のTAMRAフルオロフォアの過剰を除去するタンパク質沈殿。 <ol><li> 34 -無料のTAMRAの蛍光団の集中的なゲル内蛍光によって蛍光ラベルヒストンH3のoutshiningを回避するために、タンパク質（3.3.4 3.3.2）の沈殿によって過剰蛍光団を取り除く。 </li><li>簡単に各添加後、各チューブとボルテックスに75μlのメタノール、18.8μlのクロロホルムと50μlの脱イオン水を追加します。 5分間16000×gで遠心分離する。タンパク質が含まれている界面層を、乱すことなく上相を除去します。 </li><li>私は残りの相に56.3μlのメタノールを追加します。nは5分間16000×gで各チューブ、ボルテックスと遠心機は、タンパク質をペレット化する。上清を取り除きます。ペレットを洗浄するには、この手順を繰り返します。 </li><li>糸くずの出ない組織とのオープンチューブをカバーし、15のためにそれらを乾燥させ - 30分。 </li></ol></li><li> SDS PAGE による分析。 <ol><li> （20μlのSDSローディング緩衝液（50mMトリス-HCl、2.5％（w / v）のSDS、10％（v / v）グリセロール、320 mMのβメルカプトエタノールおよび0.05％で3.3.4から沈殿したタンパク質を溶解/ワットv）のブロモフェノールブルー、pHは6.8）。完全にピペットでチューブの壁をすすぐことによりペレットを溶解することを確認してください。 </li><li> 10分間95℃でサンプルをインキュベートし、それらを20℃まで冷却しましょう​​。 </li><li>チューブの底にすべての液体を回収するための遠心分離を簡単に。 </li><li> SDSポリアクリルアミドゲル（3.1.7）のウェルに各サンプルの全量をロードします。電気泳動用のバッファを実行しているようにSDSを（w / v）の50 mMのMOPS、50mMのTris-X（Tris塩基）、5mMのEDTA、0.1％を使用してください。 </li><li>約120 Vでゲルを実行します。 90分。 </li><li>フィルタ（50ナノメートルの波長±540）を備えたCCDカメラを用いてUVテーブル（312 nm）の上のゲル内蛍光を可視化する。 注：UV光が目や皮膚に損傷を与えている。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、以下の競合する金銭的利益を開示している。E.W.は関連特許の発明者である。

のDNA MTアーゼおよびアジリジン補助因子（笑顔DNA）を用いたDNAのワンステップ標識は堅牢な方法であるが、実験を計画する際にいくつかの側面を考慮すべきである。 アジリジン補助因子：M.BseCIとDNA標識用6BAz濃度は60であった。他のDNAメチルトランスフェラーゼを使用する場合は補因子の濃度は、20μMのがDNA MTアーゼM.TaqI 19で採用されていると低い例えば濃度を最適化する必要があります。低6BAz濃度は、ストレプトアビジン4倍過剰（アッセイにおけるビオチンの全体量に対する結合部位）を直接EMSAにより分析を妨害することなくREaseとのインキュベーション後に添加することができるという利点を有する。そうでない場合は、ビオチン化DNAを過剰補因子を除去し、アガロースゲル電気泳動の間にDNAの汚れを避けるために、精製されるべきである。 DMSO中のストック溶液からアジリジン補助因子を追加する場合ていることを確認し番目の最終DMSO濃度電子アッセイは、5％未満である。あまりにも多くのDMSOの酵素を不活性...

核酸、1,2およびタンパク質3,4の特異的な標識は、機能の特徴付け、医療診断及び（ナノ）バイオテクノロジーのための主要な関心事である。ここでは、S -adenosyl-L-メチオニン（AdoMetをまたはSAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）に基づいており、これらの生体高分子のための酵素標識法を提示する。このクラスの酵素（EC 2.1.1。）は、核酸およびタンパク質の特定の残基の中の個々の求核位置（窒素、酸素、硫黄および炭素原子）を標的と自然補因子のAdoMet（ 図1A）5の活性化メチル基を転移する。また、MTアーゼは、親和性タグ、蛍光団又は他の標識（ 図1B）6との特異的標識のための合成補因子類縁体を利用することができます。のAdoMet類似体の2つのクラスが開発されてきた：Sの equence固有のM ethyltransferase-ためのアジリジン補助因子を私が Lのアベルる （笑顔）7とctivated のG roups のM ethyltransferase指向性T ransferのための二重活性化したのAdoMet類縁体（MTAG）8。 <img alt="図1" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" width="700"> 図1：メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）によって触媒される反応は 、DNA、RNA、タンパク質および小生体分子を含む様々な基材への天然の補因子のAdoMet（SAM）からA.メチル基転移B.標識核酸およびタンパク質の/官能化（NNNNN =。 DNAのための塩基対、タンパク質についてのRNAおよびアミノ酸に対するヌクレオチド;緑色対象残基とMTアーゼのXXXXX =認識配列）合成補因子類似体。レポーター基を含むアジリジン補助因子（青球）特に標的残基に結合された配列は、（左）アデニン環にある取り付け及び二活性化のAdoMet類似体は、第二段階でバイオ直交クリック反応により標識することができる化学レポーターY（右）を担持する拡張アルキル鎖の転送につながる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> アジリジン補助因子は、DNAメチルトランスフェラーゼで最適に動作する。それらは窒素原子9（またはNが 10,11 -mustard）の代わりに、スルホニウム中心の反応性基を有する3員環を含む。この窒素原子のプロトン化は、DNAと全体の補因子の共有結合につながる標的ヌクレオチドによる求核攻撃のためのアジリジン環を活性化させる。アデニン環にレポーター基を結合することにより、アジリジン補因子は、（一段階でDNAを標識するためにDNAメチルトランスフェラーゼと組み合わせて使用​​することができる<stron> G&gt;左図1B）7,12。 、 バチルス·ステアロサーモフィラス （M.BseCI）16（ 図2から図15（アデニン環の6位に結合したビオチンとアジリジン補助因子）およびアデニン特異的DNA MTアーゼ-これは6BAz 13によるDNAのビオチン化のために詳細に示されているアジリジン補助因子を介した DNAのワンステップのラベリング）：プロトコルセクション2を参照してください。 ヘモフィルスheamolyticus（M.HhaI、5からM.BseCI（5'-ATCG A T-3 '認識配列）、 サーマス·アクアティクス （M.TaqI、5'-TCG A -3からDNA MTアーゼ'）に加えて、 「-G C GC-3 '）およびスピロ （M.SssI、5'- C G-3'）から正常に6BAz 17とのDNAをビオチン化するために使用されている。さらに、アジリジン補因子は、1ステップの蛍光DNA標識18,19のために使用することができる。 </stron>常に "&gt;：" =キープtogether.withinページFO」ontent <img alt="図2" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" width="700"> 図2：M.BseCIと6BAzとDNAの配列特異的一工程ビオチン化 DNA MTアーゼM.BseCIは、二本鎖DNA配列5'-ATCG A T-3 'を認識し、自然に二アデニンのアミノ基をメチル化のAdoMetを使用して残留物（緑色）。アジリジン補助因子6BAzとの反応のコースが変更され、M.BseCIは、ターゲットアデニンとビオチン（青）を含めた全体の補因子を結合することによって、特定のDNAビオチン化を配列決定するためにつながる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52014/52014fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 二重活性化のAdoMet類似体は、不飽和側鎖の代わりに、スルホニウム中心におけるメチル基（ 図1B拡張含む）20。スルホニウム中心部へのβ位に不飽和二重または三重結合は、電子的に接合安定化により遷移状態の中不利な立体効果を補償します。スルホニウム中心と不飽和結合の両方が酵素転送のための側鎖を活性化するので、これらの補因子は、二重活性化のAdoMet類似体と命名した。典型的には、それらは、第二工程8,21において化学選択的標識のために、アミノ、アルキンとアジド基のようなユニークな化学基（化学レポーター）で側鎖を転送するために使用される。 RNAおよびタンパク質の追加のラベル付けを可能28 -一般的には、二重の活性化のAdoMet類似体は、RNA MTアーゼ22,23 DNA MTアーゼ8,20,21のためだけでなく、ための補因子およびタンパク質のMTアーゼ24としてだけではなく機能することができます。しかし、拡張された側鎖が立体的にメチル基より厳しいであり、タンパク質工学によってMTアーゼ活性部位を拡大することはしばしばある効率的な転送速度を得るために必要なEN。銅による化学的修飾を、以下のための酵素の転写時の遷移状態の1安定化および2反応性ハンドル：この問題に対する別の解決策は、小さなプロパルギル末端アルキンは、2つの機能を果たす基（3個の炭素）とのAdoMet類似体を使用することである触媒によるアジド - アルキン環（CuAAC）ケミストリーをクリックします。それは、結果のプロパルギルのAdoMet類縁体29は 、中性またはわずかに塩基性条件下でのみ限定された使用の非常に不安定であることが判明した。この欠点は、セレンと硫黄原子を置換することによって固定することができる。得られた補因子5 ' - [（ セレン ）[（3 S）-3-アミノ-3-カルボキシプロピル]プロプ-2- ynylselenonio] -5'-デオキシアデノシン（SeAdoYn、 図3）は、野生型DNAによって受け入れられ、RNA多くの場合、タンパク質工学の必要性を排除32 -とタンパク質MTアーゼ30。これは、蛍光プロ例示されるヒストンH3リジン4（H3K4）MTアーゼSET7 / 9 33（：二重に活性化補助因子を介して 2つの段階のタンパク質標識、図3、プロトコルセクション3を参照）での標識をTEIN。 <img alt="図3" fo:content-width="7in" src="/files/ftp_upload/52014/52014fig3highres.jpg" width="700"> 図3：SET7 / 9、SeAdoYnとTAMRAアジドとヒストンH3の配列特異的二段階蛍光標識タンパク質MTアーゼSET7 / 9が自然のAdoMetを使用して、ヒストンH3のリジン4のアミノ基（H3K4、緑）をメチル化する。。二重活性化補助因子でSeAdoYn MTアーゼは、リジン残基に小さなプロパルギル基（赤）を転送する。接続された端末三重結合は、その後選択的にアジド誘導体化TAMRA（テトラメチルローダミン、青）フルオロフォアでバイオ直交クリック反応（銅触媒アジド - アルキン付加環、CuAAC）に変更されます。ロード/ 52014 / 52014fig3highres.jpg「ターゲット= "_空白"&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

<table><tbody><tr><td>6BAz</td><td></td><td></td><td>Weinhold et al.、特許番号US 8,129,106、2012年3月6日公開に従って合成。</td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Serva</td><td>28625</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>10304980</td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド/Bis Solution, 37.5:1</td><td>Serva</td><td>10688</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500100</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Persulfate (APS)</td> <td>Serva</td><td>13375</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>Gerbu</td><td>1304</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Gerbu</td><td>1115</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー Na塩</td><td>Serva</td><td>15375</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II)</td><td>Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>クロロホル</td><td>ム フィッシャー サイエンティフィック</td><td>10020090</td><td></td></tr><tr><td>クーマシー ブリリアントブルー</td><td>Serva</td><td>17525</td><td></td></tr><tr><td>EDTA二ナトリウム塩</td><td>Gerbu</td><td>1034</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>メルク</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>ゲルレッド (10,000x 水)</td><td>ビオチウム</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール (99.5%)</td><td>Gerbu</td><td>2006</td><td></td></tr><tr><td>FastRuler Low Range DNA Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1103</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3</td><td></td><td></td><td>Philipp Voigt博士とDanny Reinberg教授から得られた発現プラスミド。T. J. Richmondら、J. Mol. Biol. 1997、272、301-311による発現および単離。</td></tr><tr><td>M.BseCI</td><td></td><td></td><td>Expression plasmid obtained from Dr. Michael Kokkinidis; expression and isolation according to Kapetaniou et al., Acta Cryst. 2006, F63, 12-14.</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10675112</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム&nbsp; 六水和物</td><td>J.T. Baker</td><td>4003</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Gerbu</td><td>1081</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Gerbu</td><td>1112</td><td></td></tr><tr><td>pHストリップ (中性)</td><td>メルク</td><td>1,095,330,001</td><td></td></tr><tr><td>pBR322</td><td>Thermo Scientific</td><td>SD0041</td><td></td></tr><tr><td>R.TaqI (10 u/&micro;l)</td><td>Willnow</td> et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173に従って合成されたThermo Scientific <td>ER0671</td><td></td></tr><tr><td>SeAdoYn</td><td></td><td></td><td>。</td></tr><tr><td>Set7/9</td><td></td><td></td><td>ダニー・ラインバーグ教授から得られた発現プラスミド、D. Reinbergらによる発現と単離、Genes Dev.2002、16、479-489。</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Gerbu</td><td>3058</td><td></td></tr><tr><td>(+)-ナトリウム L-アスコルビン酸</td><td>Sigma Life Science</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>SDS 粒状</td><td>Gerbu</td><td>1833</td><td></td></tr><tr><td>二-リン酸水素ナトリウム</td><td>Merck</td><td>106,586</td><td></td></tr><tr><td>TAMRA アジド</td><td></td><td></td><td>参考文献30に従って合成: Willnow et al., ChemBioChem 2012, 13, 1167-1173.</td></tr><tr><td>TaqI バッファー (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B28</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Acros Organics</td><td>42058</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gerbu</td><td>1028</td><td></td></tr><tr><td>Tris-X (TRIS-base)</td><td>Gerbu</td><td>1018</td><td></td></tr><tr><td>Tris(3-hydroxypropyltriazolyl-methyl)amine (THPTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>762342</td><td></td></tr></tbody></table>

メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S -Adenosyl -1-メチオニンメチオニン（AdoMetまたはSAM）依存性メチルトランスフェラーゼ（MTアーゼ）、DNA、RNA、タンパク質および小生体分子の特定の位置にあるAdoMetから活性化メチル基の転移を触媒する。この天然のメチル化反応は、補因子の合成類似体を用いてアルキル化反応の多種多様に拡張することができる。アジリジン環とのAdoMetの反応性のスルホニウム中心の交換は、様々なDNAメチルトランスフェラーゼによって、DNAと結合することができる補因子につながる。これらのアジリジン補助因子は、アデニン部分の異なる位置にレポーター基を搭載し、 私は DNA（笑顔DNA） のLアベルのINGを nduced ethyltransferase- のS equence固有のMのために使用することができる。典型的な例として、我々は、DNA MTアーゼM.BseCIとアジリジン補助因子6BAzのある5&#39;-ATCG A T-3 &#39;配列でpBR322プラスミドDNAのビオチン化のためのプロトコルを与える1ステップ。 ctivated Gの roups（MTAG） のm個のethyltransferase指向Tの ransferのために使用されるのAdoMet類似体の別のクラスの不飽和アルキル基の結果と活性化されたメチル基の拡張。拡張された側鎖はスルホニウム中心と不飽和結合によって活性化されるので、これらの補因子は、二重活性化のAdoMet類似体と呼ばれる。これらの類似体アジリジン補因子のようなDNAメチルトランスフェラーゼのための補因子としての機能だけでなく、RNA、タンパク質および小分子MTアーゼのみならず。これらは、典型的には、第2の化学工程でレポーター基で標識されているユニークな官能基を有するMTアーゼ基質の酵素的修飾に使用される。これは、ヒストンH3タンパク質の蛍光標識のためのプロトコルに例示されている。小さなプロパルギル基はのクリックラベルに続いてヒストンH3リジン4（H3K4）MTアーゼSET7 / 9によってタンパク質に補因子アナログSeAdoYnから転送されるTAMRAアジドとアルキニル化ヒストンH3。補因子類縁体とMTアーゼ媒介ラベリングは、識別とMTアーゼ基質の機能的研究ならびにDNAジェノタイピングとメチル化検出を含む多くのエキサイティングなアプリケーションを可能にする技術である。

アジリジン補因子を介したDNAのワンステップラベリング この例では、反応は、二本鎖の5'-ATCG A T-3 '配列内の第2のアデニン残基を変更し、pBR322プラスミド（ 図4A）上の1つの認識部位を持つDNA MTアーゼM.BseCI、を用いて行われる。プラスミド標識をテストするために、pBR322の制限エンドヌクレアーゼ（REase）R.TaqI（5'-TCGA-3 '）を用いてチャレンジされる。 R.TaqIはM.BseCIサイトに含まれているそのうちの一つのpBR322に7拠点を持っています。ラベリングが発生した場合は、M.BseCIサイトが切断および683塩基対（bp）との新しいフラグメントから保護される2つの他のフラグメントが消えている間（315と368 bp）を形成することになる。もちろん、対応する認識配列を有する他のDNAメチルトランスフェラーゼ異なるREasesにDNA標識を分析する際に使用すべきである。 <stro...

DNA及びタンパク質は、配列特異的親和性またはDNAまたはタンパク質トランスフェラーゼおよび合成補因子類似体を用いた蛍光レポーター基で標識される。酵素の補因子特異​​性に応じて、アジリジンまたは二活性化補助因子アナログは、一次元または二段階標識のために用いられる。

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

以下の実験の全体的な目標は、活性化されたメチル基とaomeと呼ばれる補因子Sile lメチオニンをD-N-A-R-N-Aに自然に移行させるメチルトランスフェラーゼを使用してDNAとタンパク質を特異的に標識することです。タンパク質または小さな生体分子。ワンステップ標識は、天然補因子の省略を、全体の補因子の酵素的結合につながる反応の経過を変える合成アイン補因子に置き換えることによって達成され、したがって、基質配列の共有結合標識DNAの特異的メチルトランスフェラーゼ誘導標識は、アディーン特異的DNAメチルトランスフェラーゼ、M-B-S-E-Cで実証される。 これは、ビオチン化Aine補因子6BAZをA-G-C-G-A-T認識配列に結合させ、特にビオチン化DNAメチルトランスフェラーゼの活性化基の転写を指示することは、標識タンパク質の使用であり、C8oinからヒストンH3のリジン4にプロパルゴ基を転写するMTAsセット79を使用して実証されています。アルキル化リジン残基は、銅触媒クリックケミストリーを使用してアジ修飾蛍光体によって化学的に標識されるため、特異的に標識されたタンパク質が得られます。標識にメストランスフェラーゼを使用する利点は、天然基質を直接標的とする可能性があることです。これを、プラスミド、DNAメストランスフェラーゼ、補因子アナログジンによる触媒タンパク質修飾の配列特異的なbioTE高揚によって実証し、さまざまなレポーターグループの導入を2つのステップで可能にします。これを、ヒソンH 3タンパク質の蛍光標識と、ビオチンによるH 3の標識結果を示すことで実証します。さらに、二重活性化補因子ランアナログは、メチル基転移後の補因子生成物であるS ail, el homocysteineを様々な活性アルコールと共にロードすることにより、容易に合成することができます。合成補因子類似体は逆相HPLCによって精製され、場合によっては、エピ火星を硫黄で分離することさえ可能です。Smiling DNAは、DNAの配列特異的なメチルトランスフェラーゼ誘導標識です。ここでは、PB 3 22プラスミドDNAを6つのBAZ Aine補因子とアディーン特異的DNAメチルトランスフェラーゼで標識することにより、この概念を実証しています。M-B-S-E-Cは、摂氏20度で6つのBAZをホーイングすることから始まります。考えたら、氷上で反応混合物を修復します。これには、プラスミドのマイクログラム、6つのBAZの60マイクロモル、および10相当のM-B-S-E-C oneが含まれています。修飾バッファー中のDNA上のHER認識配列。6つのBAZとM-B-S-E-Cを最後に1つ追加してください。天然の補因子が標識をブロックするため、使用しているメストランスフェラーゼにAMEが結合していないことを確認してください。React For コントロール。MTAを水で置き換えて非特異的な補因子修飾を視覚化し、補因子の代わりに水を追加して酵素濃縮物中の天然補因子をテストします。次に、反応をピペットで穏やかに混合し、摂氏55度で1時間インキュベートします。インキュベーションの終わりに向かって、10マイクロリットルの10 x 組換えタコネス、1つのバッファーを80マイクロリットルの水に加え、次に3.3マイクロリットルのリコンビナントタク1制限エンドヌクレアーゼを添加することにより、氷上でエンドヌクレアーゼ混合物を修復します。インキュベーション後、クイックスピンで反応を引っ張り、それぞれにDNA修飾を確認します。10 x takの2マイクロリットル、1つのバッファー、および28マイクロリットルのエンドヌクレアーゼ混合物を追加します。反応を穏やかなピペッティングで混合します。次に、反応を摂氏65度で30分間インキュベートします。反応が完了したら、すばやく回転させて溶液を引っ張り、25マイクロリットルの反応を新しいチューブに集めます。これらのアリコートに、ストレプトアジンのモノマーあたり1ミリモルで緩衝された2.4マイクロリットルの連鎖球菌TTRを追加します。.次に、この反応を摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、完了した反応に5マイクロリットルの6×ローディングバッファーを加え、1%アグロスゲルで80ボルトで約10マイクロリットルを約1時間使い果たします。次に、バンドを視覚化しますmt Aは、活性化基のメチルトランスフェラーゼ指向性移動の略語です。このデモンストレーションでは、メチルトランスフェラーゼは7、9、および二重活性化補因子Cを8に設定しました。Oinは、彼のヒストンHのうち4をリジンと分類するために使用されます。氷修復20マイクロリットルの反応混合物で成分を解凍した後、アッセイ溶液は、ヒストンH 3の修飾緩衝液10マイクロモルを含み、最後の10マイクロモルのメチルトランスフェラーゼと600マイクロモルの補因子を添加した。C eight ONを脱イオン水に置き換えることにより、酵素制御を行います。また、合成補因子と競合するように出会った60ミリモルのADOを含めることにより、非特異的な修飾を視覚化する補因子コントロールを作成します。次に、反応を低速パイプペストと混合し、テストストリップでpHを確認します。二重活性化補因子類似体はC条件下で保存されます。したがって、反応溶液のpHは、必要に応じて少量の50ミリモル水酸化ナトリウムで補因子を添加してpHを調整することで変化させることができます。次に、インキュベーション修復中に37°Cで反応を2時間インキュベートします。インキュベーションが終了する直前に12%SDSポリアクリルアミドゲルを、3ミリモルの硫酸銅、3ミリモルのT-H-P-T-Aリガン250ミリモル、ACOナトリウム餌、および6ミリモルのタマラアジドを含む5×クリックミックスの20マイクロリットルを作ります。インキュベーションの終わりに、各反応に5マイクロリットルのクリックミックスを加え、ペッティングごとに反応をゆっくりと混合します。ホイルを使用して反応を光から保護し、摂氏20度で1時間インキュベートします。1時間後、タンパク質を沈殿させて余分なクロロホルムを取り除きます。75マイクロリットルのメタノール、18.7マイクロリットルのクロロホルム、および50マイクロリットルの水を各反応に加え、それらを短時間ボルテックスします。各チューブを準備した後、16, 000 Gで5分間スピンダウンします。タンパク質を含む界面層を乱すことなく、分離の上層を除去します。次に、56.3マイクロリットルのメタノール、下相、および渦を追加します。次に、これをスピンダウンしてタンパク質をペレット化し、仰臥位を廃棄します。次に、56.3マイクロリットルのメタノールを追加します。再び、渦。スピンを繰り返し、ペレットを回収します。ペレットをチューブで乾かし、蓋を外し、糸くずの出ない紙で覆います。その後、タンパク質を20マイクロリットルのSDSローディングバッファーにローディング色素で溶解します。チューブ壁をバッファーですすいで、ペレットを収集します。次に、チューブを摂氏95度で10分間インキュベートします。チューブが室温に戻ったら、チューブを短時間使用して内容物を引き出し、SDSページでタンパク質を視覚化します。120ボルトで約90分間運転します。微笑み反応は、二本鎖A-T-C-G-A-T配列内の第2アデニン残基を修飾し、PBR 3 2 2プラスミド上に1つの認識部位を持つDNAメチルトランスフェラーゼM-B-S-E-C oneを用いて行われました。PB 3 2 2は、PB 3 22に緑色でマークされた7つの部位があり、そのうちの1つがM-B-S-E-C one部位に含まれる組換え制限エンドヌクレアーゼT oneで異議を唱えられました。標識が発生した場合、この部位はゲル内の切断から保護する必要があります。これは確認されました。683塩基対の新しいフラグメントが現れ、M-B-S-E-Cの1つの部位に標識があることを示しました。これは、アッセイレーン(レーン3)でのみ見られます。標識反応の特異性は、エレクトロモビリティシフトによって実証されました。ストレプトアジンを添加すると、ビオチンで標識された683塩基対フラグメントのエレクトロモビリティが遅延しました。M-B-S-E-Cを欠いたフラグメントの移動度は変わらなかったが、1つの部位、またはメチルトランスフェラーゼ基質を二重活性化8つのOHメットアナログで2ステップ標識した。ヒストンH 3リジン4メチルトランスフェラーゼセット7 9と小さなC 8 ON補因子を使用した。ゲル電気泳動は、アッセイレーンのみの蛍光検出に使用しました。レーン1は、ヒストンH 3に対応する蛍光バンドを示し、補因子の側鎖が特異的に転移し、修飾タンパク質がTamara Flora.Fourで標識されたことを示しています。ESI染色は、ローディング制御として機能します。すべてのレーンで同じ量のタンパク質が示されました。メチルトランスフェラーゼ基質は、アジ由来のビオチンとのビオチン反応で標識することもできます。Fluorの代わりに、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いたウェスタンブロッティングによるアッセイが行われました。このビデオを見た後、共役のAdenが成功し、特定のラベリングが見られました。DNAおよびタンパク質配列の標識方法、特にアフィニティーテキスト、Fluor force、またはその他の標識について十分に理解している必要があります。この手順を試みる際には、他のmetとその類似体が温度に敏感であることを覚えておくことが重要です。常に氷上で取り扱い、マイナス20°Cで保管してください。ダブルアクティベートを合成しました。レポーターグループがすでに側鎖に組み込まれており、それらを使用してワンステップでDNAを特異的に標識する他のMETアナログ。特に、1分子技術を使用してDNAマッピングのために、さまざまな酵素とレポートグループを組み合わせるという見通しに興奮しています。スマイリングとNECは非常に柔軟性があり、適切な覚醒剤の転写により、DNAやタンパク質だけでなく、RNAやsmallにもほとんどすべての化学基を移行することができます。

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生物学

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メチルトランスフェラーゼと補因子類似体核酸およびタンパク質の配列特異的標識化

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