Name: 安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 学ぶ還元ジメチル化による安定同位体標識を用いた定量的プロテオミクス手法。質量分析で複雑なサンプル間のタンパク質相対量を正確に比較・定量化する迅速かつ低コストな方法です。

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私たちは、SP GygiとGMチャーチの助けと指導に感謝します。この研究は、ACTのCNRSのchaire d'excellenceによって支援されました。

注：この方法は、以前に12を説明した。 1。タンパク質の単離好ましくは、フレンチプレス、ビーズビーティング、または超音波のような物理的方法により、細胞を溶解することによって細胞タンパク質1mgを準備します。酵素は、質量分析の測定を混乱されますので、リゾチーム媒介細胞溶解を避けてください。 タンパク質の2。TCA沈殿タンパク質を沈殿さ10分間氷上で4倍量のタンパク質と寒さに1ボリュームトリクロロ酢酸（TCA）を追加します。 4℃で5分間、12,000×gで遠心分離し、上清を取り除く。 4℃で5分間、12,000×gで氷冷アセトン及び遠心分離機の1ml中にペレットを再懸濁上清を除去し、15分間、ペレットを乾燥させるためにベンチにチューブを反転させる。 -80℃での店舗タンパク質ペレット 3。変性タンパク質ジスルフィド結合を還元リタンパク質をサスペンド500μlの変性および還元緩衝液中で約2 mg / mlの（50mMのHEPES pH8.5で、5mMのDTT中4 M尿素または3％SDSのいずれか）である。任意選択で、緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤が挙げられる。室温で10分間、続いて56℃で30分間、タンパク質をインキュベートする。 4。Aklylate無料スルフヒドリル基が不可逆的ジスルフィド結合の形成を破壊する水中での新鮮な0.3Mのヨードアセトアミドを準備します。注意！ヨードアセトアミドは、非常に毒性が強い。 500μlのタンパク質に25μlの0.3 Mヨードアセトアミド（15mMの最終濃度）を添加し、室温で暗所に20分間インキュベートする。 300のDTT（5 mMの最終DTT濃度）を10μlを添加することにより、ヨードアセト急冷。 -80℃でアルキル化されたタンパク質を保存する 5。タンパク質消化 TCAは、タンパク質を沈殿させる（工程2に記載のように）および50 mMのHEPES（pHは8.2）1mlを、1 M尿素中で再懸濁する。シルendoproteinの原液を準備し2μgの/μLの濃度のタンパク質溶液に5μLを加え、水中でのASE（のLys-C）。室温で16時間混合物をインキュベートする。最終の確保のLys-C濃度は10ngの/μlのタンパク質と対のLysC比である（w / w）の50分の1〜200分の1である。 、50 mMの酢酸を40μlの20μgのシーケンシンググレードのトリプシンを再懸濁のLys-C消化物に5μL（10μgのトリプシン）を追加し、37℃で6時間インキュベートトリプシンに使用したのLys-Cに同じプロテアーゼ濃度およびプロテアーゼとタンパク質との比を使用してください。 6。逆相ペプチド抽出<ol><li> 0.5％の最終濃度（pH試験≈2）にトリフルオロ酢酸（TFA）を加えることによりペプチドを酸性化する。抽出マニホールドにC18カラムを取り付けます。ペプチドのローディングおよび溶出を除くすべてのステップのための可能な限り最高の流量を使用してください。 </li><li> 6ミリリットルのアセトニトリル（ACN）で濡れ列。 6ミリリットル80パーセントのACN、0.1％TFAでカラムを洗浄し、6ミリリットルの0.1％TFAで平衡化させます。許可されていませんステップ間で枯渇する列。 </li><li>真空圧を停止し、約1ml /分の流速でカラムにペプチド500μgのを読み込む。ペプチドは、カラム、再始動真空に結合し、次いで（0.09 Mクエン酸、0.23 MのNa 2 HPO 4、pH5.5）中のクエン酸緩衝液3mlで6 mlの0.1％TFAで洗浄した後。 注：より高いペプチドの量は、標識することができるが、C18カラムの結合能力は、試料の損失を回避するために、ペプチドの量よりも少なくとも2倍高くなければならない。 </li></ol> 7。オンカラム還元ジメチル化によるペプチドの標識（REDIラベリング） シアン化水素は、ラベリング処理中に低濃度で放出された化学フードの下で、この手順を実行します。 <ol><li>ペプチド遊離アミンをメチル化するために「光」と「重い」REDIバッファの12ミリリットルを用意します。光のRedi緩衝液は0.8％ホルムアルデヒド及び番目に水素を運ぶ0.12 Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムから成りクエン酸緩衝液中のEIR天然の同位体分布。重鎖のRedi緩衝液は0.8％重水素化ホルムアルデヒド、クエン酸緩衝液中の0.12 M重水素化シアノ水素化ホウ素ナトリウムからなる。 </li><li> 1ミリリットル/分の流速でペプチド含有列に10ミリリットル光や重いREDIバッファのいずれかを追加することにより、ペプチドを含む列をインキュベートし、完全なラベル付けを確実にするために繰り返します。ウォッシュ6ミリリットル0.1％TFAでカラム、次いで1ミリリットルの0.5％酢酸を含む。 </li><li>真空を停止し、1mlの80％ACN、約0.5ml /分の流速を用いて0.5％酢酸で、次いで1mlの40％ACN、0.5％酢酸を有する第1の標識されたペプチドを溶出させる。所望であれば、重鎖および軽鎖のサンプルを混合する前に、質量分析により個々の試料の標識効率を測定する（「代表的な結果」を参照）。質量分析によって定量化することが1:1重鎖及び軽標識化ペプチドのサンプルを混合する。 </li></ol>塩基性pH逆相（BPRP）クロマトグラフィー&lt;によって8。セパレートペプチド混合物/ pの&gt; 塩基性pHは、独立して、プロテオームカバー率を増加させるためにLC-MS/MSにより分析する複数の画分へのペプチド混合物を分離するために相（BPRP）クロマトグラフィーを逆転させた。 <ol><li> 10mMの重炭酸アンモニウム（pH8）に増加ACNの濃度勾配を適用することにより、C18-HPLCカラム上でペプチド混合物を分画する。 5分間、5％（v / v）のACNで開始し、60分で35％ACNへ増大し、1分間で、次いで90％ACN。 9分間の再平衡化の列に5％ACNを削減する前に4分間、90％ACNを保持します。 96ウェルプレート（H12にA1）に、等量の96画分を収集する。ペプチドは、（ここに記載された条件のために10〜70分）でカラムから溶出している間に220 nmでのUV検出器を用いて分画を監視します。 </li><li>井戸A2、C2、E2、およびG2（フラクションA2）から、それに応じてのために、ウェルB1、D1、F1、およびH1（フラクションB1）から、井戸A1、C1、E1、およびG1（フラクションA1）から分画を組み合わせ残りの画分。 solvenを削除真空遠心機を用いてtを画分からの再懸濁し、ペプチドが、A1、B2、A3、B4、A5、B6、A7、B8、A9、B10、A11、およびB12、1M urea/0.5％のTFAを130μL中、ステップ9で説明したようにStageTipsを使用して浄化する。ストア画分B1、A2、B3、A4、B5、A6、B7、A8、B9、A10、B11、および-20 A12ºCの</li></ol> 9。ストップアンドゴーの抽出によって精製し、ペプチド（StageTips） 1.07ミリメートルの内径（ID）が2 C18ディスクを備えた200μlのピペットチップを充填することにより、C18-StageTip 7マイクロカラムを準備します。エッペンドルフチュー​​ブにステージのヒントを置く。メタノール130μL、その後130 UL 80パーセントACN、0.5％の酢酸でのヒントを洗浄するためのマイクロを使用しています。 130μlの0.1％TFAでStageTipsを平衡化させます。 StageTipsにペプチド混合物を移し、40μlの0.5％酢酸、その後、40μlの0.1％TFA、その後、130μlの0.1％TFAで洗浄する。 20μlの40％ACN、0.5％酢酸、次いで、20μlの80％ACN、0.5％酢酸を有する第1のペプチドを溶出させる。溶出液A組み合わせるND真空濾過により乾燥させます。 10。マイクロキャピラリーLC-MS/MS <ol><li>約1μgの/μLの濃度に1-5μlの5％ギ酸、5％ACN中のペプチドを溶解させる。 0.125％ギ酸中の6から22パーセントACNの勾配で100ミクロン×20センチC18-逆相HPLCカラム上の解決〜1μgのペプチドは、〜300リットル/分の流量で75又は100分間にわたって適用した。 </li><li> LTQ Velos 12又はオービトラップ質量分析計は、高分解能、高質量精度を提供することで同様の液体クロマトグラフィー-質量分析プラットフォームを用いてペプチドを同定する。オービトラップアナライザで取得されたフルMSスキャン（60,000の分解能）とデータ依存モードでの質量分析装置を操作します。完全なMSスペクトルで検出された20の最も豊富なイオンのための線形イオントラップMS / MSスペクトルを生成する。 MS / MSのための完全なMSのための1×10 6と2000に自動利得制御（AGC）の目標を設定します。千ミリ秒、最大イオン蓄積時間を設定するMSおよびMS / MS用150ミリ用。 20〜60秒のためのMS / MSからのさらなる選択から断片化されたペプチド前駆体イオンを除外します。 </li></ol> 11。、MS / MSデータ収集これらのパラメータ（ 表1）を用いて、このようなSEQUEST 8などのアルゴリズムを用いて理論的なデータベースへのMS / MSスペクトルのRAWファイルを比較することにより、ペプチドを同定。 表1。ペプチドデータベース検索のパラメータを。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> 一般的なパラメータ </td><td>最大2と完全にトリプシン消化は、切断を逃した</td></tr><tr height="19"><td> 25 ppmの前駆イオントレランス</td></tr><tr height="19"><td> 1.0ダフラグメントイオンの許容範囲</td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> 静的な変更 </strong&gt; </td><td>システイン、カルボキシアミドメチル化に関する57.02146ダ</td></tr><tr height="19"><td>リジンおよびペプチドのN末端上28.03130ダ、光ジメチル化ラベル</td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> 動的変更 </td><td>メチオニン、酸化に対する15.99491ダ</td></tr><tr height="19"><td>リジンおよびペプチドのN末端、重いジメチル化ラベルに6.03766ダ</td></tr></tbody></table><ol><li>実際、逆向きでオープンリーディングフレームのデータベースを使用して、ターゲット·デコイ9戦略としてのメソッドを使用して1％の偽発見率にフィルタペプチド。 </li></ol> 12ペプチドの定量化計算MS1の重鎖および軽鎖のペアの領域は、イオンクロマトグラム（MS1ピーク面積）およびペプチドシグナル対ノイズ（S / N）比が10を抽出した。ペプチドを含むペアた場合にのみ、その平均信号NOIそれ比は5以上である。同じペプチド（MS1ピーク面積比）の重鎖および軽鎖のバージョンMS1ピーク面積の比が、2つの試料中のペプチドの相対存在量を定量する。タンパク質中の全てのペプチドの中央値MS1ピーク面積比と相対タンパク質量を計算します。

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著者らは、競合する経済的利益や関心のある他の衝突を宣言していません。

安価な標識試薬（試薬はサンプルあたり1ドル未満のコスト）、速い反応速度（〜10分）、副生成物が存在しない場合、高：いくつかのポイントが還元ジメチル化を使用して、ペプチドの安定同位体標識（REDIラベリング）定量的プロテオミクスのための魅力的な方法を作る再現性（ 図3、図4）、安定した反応生成物、任意のプロテアーゼを使用する能力、および標識されたペプチドのイオン化効率が高い。それは、特定のアミノ酸栄養要求性または合成培地上で増殖した株又は細胞系を必要としないためのRediによる化学的標識はまた、代謝標識に有利相対的である。このように、いくつかのRediは、変異株は他の15のうち13およびヒト幹細胞14入手可能な新規な微生物12を含むタンパク質試料のほぼ任意のタイプに適用することができる。 REDIラベルの制限は、OTと比較したサンプルを多重化する低機能ですこのような現在までの8つのサンプルを同時に16を定量化することができるため同重体標識（...

複雑なサンプル間の多くのタンパク質の濃度差を測定するプロテオミクスにおける中心的な課題である。ますます、このことは、異なる同位体タグを各試料中のタンパク質を標識するサンプルを結合し、濃度差を定量化するために質量分析法を用いて行われている。いくつかの方法がタンパク質およびペプチドの安定同位体標識のために存在しています。15 N標識の1やSILAC 2 ICAT 3、のiTRAQ 4、還元ジメチル化5は、タンパク質の抽出および消化後に安定同位体タグを追加する一方で、 生体内で代謝的に同位体標識を導入。これらの方法の中でも、還元ジメチル化（ラベリングのRedi）は、サンプルのほぼ任意のタイプのタンパク質濃度の違いを定量化するための安価な、再現性のある方法として人気を集めている。 REDI標識は、その後減少するシッフ塩基を形成し、ホルムアルデヒドとペプチドを反応させることを含むシアノ水素化による。この反応は、N-末端およびリジン側鎖およびmonomethylates N-末端のプロリンに遊離アミノ基をdimethylates。ここで説明するプロトコルは、重水素化ホルムアルデヒドとシアノ水素化ホウ素（ 図1）を使用して、「重い」のラベルとの天然の同位体分布とサンプル2の水素原子を有する試薬を使用した「光」ラベルでサンプル1中のペプチドをメチル化。光、質量分析計を用いて二つの形態間を区別するために使用される重質形態との間の6.0377 Daの質量差ペプチドの結果についての各ジメチル化アミノ基である。具体的には、ペプチドの相対存在量は、光のMS1抽出イオンクロマトグラムの面積の比（MS1ピーク面積比）と各ペプチドイオン対についての重鎖バージョンとして定量化される。タンパク質の相対存在量は、タンパク質中の全てのペプチドのうち、中央値MS1のピーク面積比として計算される。本稿では、行動のための堅牢なプロトコルを記述逆相ペプチド固相抽出、オンカラムのRedi標識、ペプチド分画塩基性pH位相（BPRP）クロマトグラフィーを反転し、StageTipsを用いてペプチド混合物を精製し（ 図2）を含むLC-MS/MSによってのRedi標識実験をING 。我々は定量的プロテオミクスのためREDIラベルを使用することの利点と制限について説明します。

<table><tbody><tr><td>トリクロロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>タンパク質沈殿</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>タンパク質沈殿</td></tr> ド<tr><td>デシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>変性、タンパク質</td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td>を減少させる <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>変性、タンパク質</td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール</td><td>を減少させるSigma-Aldrich</td><td>43816</td>変<td>性、還元、アルキル酸タンパク質</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤コンプリートミニカクテル</td><td>ロシュ</td><td>4693124001</td><td>変性、タンパク質</td></tr><tr><td>ヨードアトアミド</td>を減少<td>させる Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>アルキル酸タンパク質</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>再懸濁、抽出、標識タンパク質</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>タンパク質の再懸濁</td></tr><tr><td>リジルエンドプロテアーゼ</td><td>和光ケミカルズ</td><td>129-02541</td><td>タンパク質消化</td></tr><tr><td>シーケンシンググレード トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V5111</td><td>タンパク質消化</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>タンパク質消化</td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>逆相ペプチド抽出</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 カートリッジ</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT054960</td>逆<td>相ペプチド抽出</td></tr><tr><td>抽出マニホールド</td><td>ウォーター</td><td>ズWAT200609</td><td>逆相ペプチド抽出</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>各種</td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td>"ライト」ペプチド標識</td></tr><tr><td>シアノ水素化ホウ素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td><td>"ライト」ペプチド標識</td></tr>重<tr><td>水素化ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td><td>"重い"ペプチド標識</td></tr><tr><td>シアノホウ素添加</td><td>ナトリウムCDN同位体</td><td>D-1797</td><td>」重い"ペプチド標識</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>ペプチド標識</td></tr><tr><td>C18-HPLC カラム (4.6 x 250 mm, 5 &micro;m 粒子サイズ)</td><td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>塩基性 pH 逆相クロマトグラフィー</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>さまざまな</td></tr><tr><td>C18 エンポア ディスク</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>ステージのヒント</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGEのヒント</td></tr></tbody></table>

安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

還元ジメチル化（ラベリングのRedi）によるペプチドの安定同位体標識を正確に質量分析を使用して試料間のタンパク質発現の差異を定量化する方法である。 REDI標識は、各フリーアミンに2個のメチル基を追加するために、ホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムを定期的に（光）または重水素化（重）の形式のいずれかを使用して実行されます。ここでは、REDI標識および複雑なタンパク質混合物の定量的な比較のための堅牢なプロトコルを示しています。比較のためのタンパク質試料を光や重いメチルタグ、混合し、LC-MS/MSによって共同で分析のいずれかを実行するために標識されたペプチドの中に消化される。タンパク質の相対存在量は、全MSスペクトルから抽出された成分ペプチドの重鎖及び軽標識バージョンのイオンクロマトグラムのピーク面積を比較することにより定​​量される。ここで説明する方法は、塩基性のpH REVによる逆相固相抽出によるサンプル調製、ペプチドのオンカラムREDIラベル、ペプチド分画を含んでいるersed相（BPRP）クロマトグラフィー、およびStageTipペプチド精製。当社は、安定同位体の組み込みのための他の方法に関してREDIラベルの利点と制限について説明します。我々は、サンプルのほぼすべてのタイプの中のタンパク質の存在量を比較するために、高速で安価な、そして正確な方法としてREDIのラベリングを用いた新規のアプリケーションを強調表示します。

私たちは、Saccharomyces cerevisiaeを使用して正確さ、精度、およびREDIラベルの再現性を評価し、 クロストリジウムは、全細胞溶解物をphytofermentans。まず、CのミックスのRediの標識効率を定量化セルロース（重ラベル、H）とグルコース（光ラベル、L）の培養物からタンパク質溶解物をphytofermentans。 1％ペプチド偽発見率に濾過する場合、このサンプルは、98％のRediの標識効率と11194のユニークなペプチド配列を含有していた。未分画S.セレビシエタンパク質溶解物は、同様に、HまたはLの試薬 ​​で標識された様々な比率で混合し、そして分析した。タンパク質発現の違い（2）（中央値MS1ピーク面積を記録）再現性H及びLサンプルは比（ 図3）を混合するの広い範囲にわたって混合した時の比を反映する。具体的には、タンパク質の99％の倍率変化を、1:1の混合試料に対して1.6倍よりも小さいようにして測定した。で1:10〜10時01分試料、...

還元ジメチル化（REDIラベリング）によるペプチドの安定同位体標識は、正確な質量分析に基づく定量的プロテオミクスのための迅速、安価な戦略である。ここでは、ほぼすべてのサンプルタイプに適用することができるのRediアプローチを使用してタンパク質混合物の調製および分析のためのロバストな方法を示す。

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

この手順の総合的な目的は、Ready Proteomicsを用いて質量分析を行い、多くのタンパク質の濃度をサンプル間で比較することです。まず、各サンプルのタンパク質を消化してペプチド混合物を生成します。次に、2つのサンプルを混合し、混合サンプル中のペプチドを分画および脱塩します。次に、混合サンプルを質量分析にかけます。最後に、MS2スペクトルをサンプルに含まれるあらゆる潜在的ペプチドのターゲット・デコイデータベースと比較してペプチドを同定し、サンプル間のペプチドの相対量を定量します。最終的に、ready proteomicsを用いることで、複雑なサンプル間における多くのタンパク質の相対量を定量することが可能になります。iLiteなどの他の安定同位体標識法と比較して、還元脱メチル化の主な利点は、迅速かつ安価で正確な手法であり、特定のトリオや合成培地を必要としないため、ほぼあらゆる種類のサンプルに適用できる点にあります。まず、超音波処理またはフレンチプレスを用いて細胞を溶解し、タンパク質を沈殿させて、1 mgの細胞タンパク質と500 µLの溶液を調製します。4容量のタンパク質に対して1容量のトリクロロ酢酸を加え、氷上で10分間冷却します。4 °Cで12,000 Gsにて5分間遠心分離し、上清を除去します。次に、氷冷したアセトン1 mLを用いてペレットを再懸濁し、再度遠心分離を行います。上清を吸引した後、56 °Cのヒートブロックでペレットを乾燥させ、タンパク質を変性させ、ジスルフィド結合を還元します。500 µLの変性・還元バッファーを用いて再懸濁します。タンパク質を約2 mg/mLの濃度に再懸濁してください。タンパク質を56 °Cで30分間インキュベートし、続いて室温で10分間インキュベートします。次に、遊離スルフィド基をアルキル化するため、500 µLのタンパク質に、水で調製したばかりの0.3 M IDOアセトアミド25 µLを加え、暗所で室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、3 mM DTTを10 µL加えて反応を停止させます。アルキル化タンパク質を-80 °Cで保存します。TCA沈殿後のアルキル化タンパク質を消化させるため、50 mM HEPES (pH 8.2) 中の1 M ureaを用いてタンパク質を再懸濁します。Lys-Cエンドプロテアーゼのストック溶液を水を用いて2 µg/µLの濃度で調製し、最終濃度が10 ng/µLになるように消化タンパク質に酵素を添加します。サンプルを室温で6時間または一晩放置します。シーケンシンググレードのtrypsin 20 µgを50 mM 酢酸 40 µLに懸濁し、その溶液を5 µL分、Lys-C消化反応液に添加します。アルキル化タンパク質を37°Cで6時間インキュベートします。トリフルオロ酢酸（TFA）を最終濃度0.5%になるように加えます。抽出マニホールドにC 18カラムを装着します。次に、6mLのアセトニトリル（ACN）を用いてカラムを湿らせます。次に、可能な限りの最大流量で 6 mL の 80% ACN 0.1% TFA を用いてカラムを洗浄し、続いて 6 mL の 0.1% TFA でカラムを平衡化します。真空圧を停止し、約 1 mL/min の流量で 500 µg のペプチドをカラムにロードします。ペプチドがカラムに結合したら、再び真空を開始し、可能な限りの最大流量で 0.1% TFA、次いで 3 mL のクエン酸緩衝液を用いてカラムを洗浄し、オンコ、還元的、ジメチル化、または ready ラベリングを行います。化学薬品用フード内で、ペプチドをメチル化するための light および heavy ready バッファーをそれぞれ 12 mL ずつ調製します。ライトまたはヘビーの調製済みバッファー10 mLを、1 mL/minの流速でカラムに添加します。2回目の10 mL分注を適用した後、ラベル付けを確実にするため、0.1% TFA 6 mLを加え、続いて0.5% 酢酸 1 mLを加えます。タンパク質を溶出させるためにカラムを洗浄するには、真空を停止し、0.5 mL/minの流速で40% ACN 0.5% 酢酸を1 mL適用します。次に、必要に応じて5 mLシリンジを用いて80% ACN 0.5% 酢酸を1 mL添加して溶出させます。重いラベルと軽いラベルのペプチドサンプルを1:1の比率で混合し、質量分析により定量して、重いラベルと軽いラベルの両方が効果的に導入されたことを確認します。まずペプチド混合物をC 18 HPLCカラムに適用して、ペプチド混合物を分画します。次に、5% ACNで5分間カラムを洗浄した後、60分かけて5%から35% ACNのグラジエントを用い、ペプチドを等量ずつ分画して溶出させます。96ウェルプレートに回収後、90% ACNで1分間洗浄します。さらに90% ACNで4分間洗浄した後、5% ACNを用いてカラムを再平衡化します。次に、真空遠心機を用いて、以下の方法で画分を統合します。統合した画分から溶媒を除去します。その後、1 M urea 0.5% TFAを130 µL使用して再懸濁します。以下の画分のペプチドを懸濁し、再懸濁した画分に対してストップ・アンド・ゴー抽出を行うため、一連の画分を-20 °Cで保存します。内径1.07 mmのC 18ディスク2枚を用いて200 µLピペットチップを充填し、C 18ステージチップマイクロカラムを作成します。ステージチップをマイクロ遠心チューブに入れ、130 µLのメタノールを加えて遠心分離します。次に、130 µLの0.1% TFAを用いてチップを平衡化した後、ペプチド混合物をチップに移して洗浄します。まず130 µLの0.1% TFAで洗浄し、続いて40 µLの0.1% TFAで洗浄します。その後、80% CN 0.5% 酢酸を130 µL加え、再度スピンさせます。最後に、ペプチドを溶出させるために0.5% 酢酸を40 µL加えます。まず、0.5%酢酸含有CN溶液に40%の溶液を20 µL加えます。次に、0.5%酢酸含有CN溶液に80%の溶液を20 µL加えます。これらのIITsを混合し、真空ろ過して乾燥させた後、マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィーを行います。タンデム質量分析またはLC-MS/MSでは、まず5%ギ酸および5%ACNを用いて、タンパク質を約1 µg/µLの濃度に再懸濁します。約1 µgのペプチドを100 µm × 20 cmのC18逆相HPLCカラムに適用し、0.1%〜0.25%ギ酸含有ACNを6%から22%の勾配で、流速約300 nL/minにて75分から100分かけて溶出させます。高分解能および高質量精度を備えた質量分析計を用い、SEquestなどのアルゴリズムを使用して、Ms.Ms スペクトル生ファイルを正方向および逆方向のオープンリーディングフレームの理論データベースと比較し、サンプル中のペプチドを同定します。その際、ここに示したパラメータを使用し、ターゲット・デコイ法などの手法を用いて、ペプチドを偽発見率1%にフィルタリングします。同定されたペプチドを定量するために、MS1抽出イオンクロマトグラムにおけるヘビーおよびライトのペアの面積と、ペプチドの信号対雑音比（S/N比）を算出します。平均S/N比が5以上のペプチドペアのみを解析対象に含めます。2つのサンプルにおけるペプチドの相対的な存在量を、同一ペプチドのヘビーおよびライトバージョンのMS1ピーク面積比として定量します。ペプチドの偽発見率を1%にフィルタリングした状態で、タンパク質に含まれるすべてのペプチドのMS1ピーク面積比の中央値を、相対的なタンパク質存在量として算出します。11,194個の固有ペプチド配列を含む、重ラベルおよび軽ラベル培養物から得られたc phytoフェルメント混合物のラベリング効率は98%であった。分画されていないvisierタンパク質溶解液についても同様に解析を行った。タンパク質発現の差は、広範囲な混合比率において、重ラベルサンプルと軽ラベルサンプルの混合比を再現性高く反映していた。具体的には、1対1で混合したサンプルの場合、および1対10および10対1で混合したサンプルの場合、タンパク質の99%で変動幅（fold change）が1.6未満であった。タンパク質の99%が期待される比率の3.8倍以内に収まっており、1対1の混合比から離れるほど標準偏差が増加することが示された。Clostridium phytofermentumのプロテオームにरेडीラベリングを適用したところ、2000以上のタンパク質が定量され、グルコース培地で増殖させた複製培養物の94%のタンパク質が2倍以内のレベルで測定された。また、複製培養物のペア間における変動についても高い相関性が認められた。これらの実験結果を総合すると、Ready proteomicsは複雑な試料間におけるタンパク質発現量の差を定量するための、正確で再現性の高い手法であることが裏付けられます。この技術は事実上あらゆる種類の試料に適用可能であるため、プロテオミクス分野の研究者が、新規微生物、魚類、哺乳類細胞を含むあらゆる試料におけるタンパク質発現の変化を探索する道を開きました。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

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安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

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