安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

この手順の全体的な目標は、既製のプロテオミクスを使用した質量分析により、サンプル間の多くのタンパク質の濃度を比較することです。これは、まず各サンプルからタンパク質を消化してペプチド混合物を生成することによって達成されます。次に、2つのサンプルを混合し、混合サンプル中のペプチドを分画して脱塩します。

次に、混合サンプルを質量分析法で分析します。最後に、MS 2 スペクトルをサンプル中のすべての候補ペプチドのターゲットデコイデータベースと比較することによりペプチドを同定し、サンプル間のペプチドの相対存在量を定量化します。最終的に、レディプロテオミクスにより、複雑なサンプル間の多くのタンパク質の相対的な存在量の定量化が可能になります。

iLiteなどの他の安定同位体標識法と比較した場合の還元的脱メチル化の主な利点は、特定のトロワや合成媒体を必要としない、迅速で安価、かつ正確な方法であるため、ほぼすべてのタイプのサンプルに適用できることです。まず、1ミリグラムの細胞タンパク質と500マイクロリットルを、超音波処理またはフレンチプレスを使用して細胞を溶かし、タンパク質を沈殿させます。1容量のトリクロロチン酸を4容量のタンパク質に加え、氷の上で10分間冷やします。

摂氏 4 度で 12, 000 G で 5 分間遠心分離し、上清を除去します。次に、1ミリリットルの氷冷アセトンをResusに使用します。ペレットを吊り下げてから、2回目に回転させます。

スナットを吸引した後、ペレットを摂氏56度のヒートブロックで乾燥させて、タンパク質を変性させ、染料の硫化物結合を減らします。500マイクロリットルの変性および還元緩衝液を使用してください。タンパク質を1ミリリットルあたり約2ミリグラムに再懸濁します。

タンパク質を摂氏56度で30分間インキュベートし、続いて室温で10分間インキュベートします。アルキル酸遊離硫化物基の隣に、新たに調製した0.3モルIDOアセトアミド25マイクロリットルを水で500マイクロリットルのタンパク質に加え、室温で20分間暗所でインキュベートします。インキュベーション後、10マイクロリットルの3ミリモルDTTを加えて反応を急冷します。

アルキル化タンパク質をマイナス80°Cで保存し、TCA沈殿後にアルキル化タンパク質を消化し、50ミリモルのHEIS pH 8.2で1モル尿素を使用してタンパク質を再懸濁します。ライゾール、エンドプロテイナーゼ、またはlyCのストック溶液を水中でマイクロリットルあたり2マイクログラムの濃度で調製し、消化されたタンパク質に酵素を最終濃度10ナノグラム/マイクロリットルで加え、サンプルを室温で6時間または一晩放置します。20マイクログラムのシーケンシンググレードのトリプシンを40マイクロリットルの50ミリモル酢酸に懸濁し、5マイクロリットルをライス消化反応に加えます。

アルキル化タンパク質に対して摂氏37度で6時間インキュベートします。tri Fluor酢酸またはTFAを最終濃度0.5%まで添加C 18カラムを抽出マニホールドに取り付けます。次に、6ミリリットルのアセトニトリルまたはCNを使用してカラムを濡らします。

次に、可能な限り高い流速で、6 ミリリットルの 80%a CN 0.1%TFA を使用してカラムを洗浄し、6 ミリリットルの 0.1%TFA を使用してカラムを平衡化し、真空圧を停止し、500 マイクログラムのペプチドを毎分約 1 ミリリットルの流量でカラムにロードします。ペプチドがカラムに結合したら、真空を再開し、可能な限り高い流速で 0.1%TFA を使用し、続いて 3 ミリリットルのクエン酸バッファーを使用してカラムを洗浄し、オンコ、還元、薄暗メチル化、またはレディラベリングを行います。ケミカルフードの下に、軽い緩衝液と重い準備ができている緩衝液Tom Methylateペプチドフリーのそれぞれ12ミリリットルを準備します。

Aは、10ミリリットルの軽量または重のレディバッファーを1分間に1ミリリットルの流量でカラムに加えることを意味します。2番目の10ミリリットルのアリコートを適用した後。ラベルを確実に貼付するには、0.1%TFAを6ミリリットル使用し、続いて0.5%酢酸を1ミリリットル使用します。

カラムを洗浄してタンパク質を溶出するには、真空を停止し、CN 0.5%酢酸に対して1ミリリットルの40%を1分間の流量で塗布します。次に、必要に応じて5ミリリットルのシリンジで80%a CN 0.5%酢酸溶出液を1ミリリットル加えます。.重標識ペプチドサンプルと軽標識ペプチドサンプルを 1 対 1 の比率で混合し、質量分析法で定量して、標識と軽標識の両方がペプチド混合物を効果的に分画することを確認するために、最初に C 18 HPLC カラムに適用します。

次に、5%a CNを使用してカラムを5分間洗浄した後、5〜35%a CNのグラジエントを60分間かけて使用して、ペプチドを等しい画分で溶出します。96ウェルプレートで、90%A CNを1分間観察します。90%A CNをさらに4分間使用した後、5%A CNを使用してカラムを再平衡化します。

次に、次のように分画を真空遠心分離機と組み合わせます。結合した画分から溶媒を取り除きます。次に、1モル尿素0.5%TFAの130マイクロリットルをResusに使用します。

次の画分からペプチドを懸濁し、画分のセットを摂氏マイナス20度で保存して、再懸濁した画分で抽出を実行、停止、および実行します。200マイクロリットルのピペットチップから、内径1.07mmのC 18ディスク2枚でC18ステージチップマイクロカラムを充填して調製します。ステージチップをマイクロ遠心チューブに入れ、130マイクロリットルのメタノールを加えて回転させます。

次に、130マイクロリットルの80%a CN 0.5%酢酸を加えてから再度回転させ、130マイクロリットルの0.1%TFAを使用してチップを平衡化し、ペプチド混合物をチップに移して洗浄します。まず、0.1%TFAの130マイクロリットル、続いて0.1%TFAの40マイクロリットル。次に、40マイクロリットルの0.5%酢酸をペプチドを溶出します。

まず、CN 0.5%酢酸に20マイクロリットルの40リットルを加えます。次に、20マイクロリットルの80%a CN 0.5%酢酸。IITと真空濾液を組み合わせて乾燥させ、マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィーを行います。

タンデム質量分析(L-C-M-S-M-S)は、まず5%ギ酸、5%A CNを使用して、タンパク質を1マイクロリットルあたり約1マイクログラムの濃度に再懸濁することから始まります。約1マイクログラムのペプチドを100マイクロメートル×20センチメートルC18に適用します。逆相HPLCカラムおよび0.1 25%ギ酸中のCNの6〜22%グラジエントを使用して、毎分約300ナノリットルの流速で75〜100分にわたって溶出します。

高分解能・高質量精度の質量分析計を使用し、Ms.Ms Spectra生ファイルをSEクエストなどのアルゴリズムで理論データベースと比較し、ここに示すパラメータを使用して、実方向および逆配向のオープンリーディングフレームのデータベースを使用して、サンプル中のペプチドを同定し、ターゲットデコイなどの方法でペプチドを1%の誤発見率にろ過します。同定されたペプチドを定量するには、MS One 抽出イオンクロマトグラムの重ペアと軽ペアの面積を計算し、ペプチドのシグナル対ノイズ比には、平均シグナル対ノイズ比が 5 を超える場合にのみペプチドペアが含まれます。2 つのサンプル中のペプチドの相対存在量を、同じペプチドの重バージョンと軽バージョンの MS 1 ピーク面積の比率として定量し、1% のペプチドの偽発見率にろ過した場合のタンパク質中のすべてのペプチドの MS 1 ピーク面積比の中央値として相対的なタンパク質存在量を計算します。

11, 194のユニークなペプチド配列を含む重標識培養物と軽標識培養物からのcフィト発酵物の混合物の即死した標識効率は、98%であった未分画visierタンパク質溶解物を同様に分析した。タンパク質発現の違いは、幅広い混合比で重いサンプルと軽いサンプルを混合した比率を再現性よく反映しています。具体的には、1対10および10対1のサンプルの1対1の混合サンプルでは、タンパク質の99%のfo変化が1.6よりも小さかった。

99%のタンパク質が予想比の3.8倍以内にあり、1対1の混合物からの距離が長いほど標準偏差が増加していることが示されました。Clostridium phyto ferment proteomeに既製の標識を適用したところ、2000以上のタンパク質が定量され、94%のタンパク質がグルコースタンパク質フォールド上で増殖する複製培養物の2倍レベル内で測定されました。また、重複する培養ペアの変化も高い相関性を示しました。

これらの実験を総合すると、Ready Proteomicsは、複雑なサンプル間のタンパク質発現差を定量化するための正確で再現性のある方法であることが裏付けられています。この技術は事実上あらゆる種類のサンプルに適用できるため、プロテオミクスの分野の研究者が、新規微生物、魚類、哺乳類細胞など、あらゆる種類のサンプルのタンパク質発現変化を調査する道を開きました。