安定同位体標識するための還元ジメチル化を用いた定量的プロテオミクス

この手順の総合的な目的は、Ready Proteomicsを用いて質量分析を行い、多くのタンパク質の濃度をサンプル間で比較することです。まず、各サンプルのタンパク質を消化してペプチド混合物を生成します。次に、2つのサンプルを混合し、混合サンプル中のペプチドを分画および脱塩します。

次に、混合サンプルを質量分析にかけます。最後に、MS2スペクトルをサンプルに含まれるあらゆる潜在的ペプチドのターゲット・デコイデータベースと比較してペプチドを同定し、サンプル間のペプチドの相対量を定量します。最終的に、ready proteomicsを用いることで、複雑なサンプル間における多くのタンパク質の相対量を定量することが可能になります。

iLiteなどの他の安定同位体標識法と比較して、還元脱メチル化の主な利点は、迅速かつ安価で正確な手法であり、特定のトリオや合成培地を必要としないため、ほぼあらゆる種類のサンプルに適用できる点にあります。まず、超音波処理またはフレンチプレスを用いて細胞を溶解し、タンパク質を沈殿させて、1 mgの細胞タンパク質と500 µLの溶液を調製します。4容量のタンパク質に対して1容量のトリクロロ酢酸を加え、氷上で10分間冷却します。

4 °Cで12,000 Gsにて5分間遠心分離し、上清を除去します。次に、氷冷したアセトン1 mLを用いてペレットを再懸濁し、再度遠心分離を行います。

上清を吸引した後、56 °Cのヒートブロックでペレットを乾燥させ、タンパク質を変性させ、ジスルフィド結合を還元します。500 µLの変性・還元バッファーを用いて再懸濁します。タンパク質を約2 mg/mLの濃度に再懸濁してください。

タンパク質を56 °Cで30分間インキュベートし、続いて室温で10分間インキュベートします。次に、遊離スルフィド基をアルキル化するため、500 µLのタンパク質に、水で調製したばかりの0.3 M IDOアセトアミド25 µLを加え、暗所で室温で20分間インキュベートします。インキュベーション後、3 mM DTTを10 µL加えて反応を停止させます。

アルキル化タンパク質を-80 °Cで保存します。TCA沈殿後のアルキル化タンパク質を消化させるため、50 mM HEPES (pH 8.2) 中の1 M ureaを用いてタンパク質を再懸濁します。Lys-Cエンドプロテアーゼのストック溶液を水を用いて2 µg/µLの濃度で調製し、最終濃度が10 ng/µLになるように消化タンパク質に酵素を添加します。サンプルを室温で6時間または一晩放置します。シーケンシンググレードのtrypsin 20 µgを50 mM 酢酸 40 µLに懸濁し、その溶液を5 µL分、Lys-C消化反応液に添加します。

アルキル化タンパク質を37°Cで6時間インキュベートします。トリフルオロ酢酸（TFA）を最終濃度0.5%になるように加えます。抽出マニホールドにC 18カラムを装着します。次に、6mLのアセトニトリル（ACN）を用いてカラムを湿らせます。

次に、可能な限りの最大流量で 6 mL の 80% ACN 0.1% TFA を用いてカラムを洗浄し、続いて 6 mL の 0.1% TFA でカラムを平衡化します。真空圧を停止し、約 1 mL/min の流量で 500 µg のペプチドをカラムにロードします。ペプチドがカラムに結合したら、再び真空を開始し、可能な限りの最大流量で 0.1% TFA、次いで 3 mL のクエン酸緩衝液を用いてカラムを洗浄し、オンコ、還元的、ジメチル化、または ready ラベリングを行います。化学薬品用フード内で、ペプチドをメチル化するための light および heavy ready バッファーをそれぞれ 12 mL ずつ調製します。

ライトまたはヘビーの調製済みバッファー10 mLを、1 mL/minの流速でカラムに添加します。2回目の10 mL分注を適用した後、ラベル付けを確実にするため、0.1% TFA 6 mLを加え、続いて0.5% 酢酸 1 mLを加えます。

タンパク質を溶出させるためにカラムを洗浄するには、真空を停止し、0.5 mL/minの流速で40% ACN 0.5% 酢酸を1 mL適用します。次に、必要に応じて5 mLシリンジを用いて80% ACN 0.5% 酢酸を1 mL添加して溶出させます。重いラベルと軽いラベルのペプチドサンプルを1:1の比率で混合し、質量分析により定量して、重いラベルと軽いラベルの両方が効果的に導入されたことを確認します。まずペプチド混合物をC 18 HPLCカラムに適用して、ペプチド混合物を分画します。

次に、5% ACNで5分間カラムを洗浄した後、60分かけて5%から35% ACNのグラジエントを用い、ペプチドを等量ずつ分画して溶出させます。96ウェルプレートに回収後、90% ACNで1分間洗浄します。さらに90% ACNで4分間洗浄した後、5% ACNを用いてカラムを再平衡化します。

次に、真空遠心機を用いて、以下の方法で画分を統合します。統合した画分から溶媒を除去します。その後、1 M urea 0.5% TFAを130 µL使用して再懸濁します。

以下の画分のペプチドを懸濁し、再懸濁した画分に対してストップ・アンド・ゴー抽出を行うため、一連の画分を-20 °Cで保存します。内径1.07 mmのC 18ディスク2枚を用いて200 µLピペットチップを充填し、C 18ステージチップマイクロカラムを作成します。ステージチップをマイクロ遠心チューブに入れ、130 µLのメタノールを加えて遠心分離します。

次に、130 µLの0.1% TFAを用いてチップを平衡化した後、ペプチド混合物をチップに移して洗浄します。まず130 µLの0.1% TFAで洗浄し、続いて40 µLの0.1% TFAで洗浄します。その後、80% CN 0.5% 酢酸を130 µL加え、再度スピンさせます。最後に、ペプチドを溶出させるために0.5% 酢酸を40 µL加えます。

まず、0.5%酢酸含有CN溶液に40%の溶液を20 µL加えます。次に、0.5%酢酸含有CN溶液に80%の溶液を20 µL加えます。これらのIITsを混合し、真空ろ過して乾燥させた後、マイクロキャピラリー液体クロマトグラフィーを行います。

タンデム質量分析またはLC-MS/MSでは、まず5%ギ酸および5%ACNを用いて、タンパク質を約1 µg/µLの濃度に再懸濁します。約1 µgのペプチドを100 µm × 20 cmのC18逆相HPLCカラムに適用し、0.1%〜0.25%ギ酸含有ACNを6%から22%の勾配で、流速約300 nL/minにて75分から100分かけて溶出させます。

高分解能および高質量精度を備えた質量分析計を用い、SEquestなどのアルゴリズムを使用して、Ms.Ms スペクトル生ファイルを正方向および逆方向のオープンリーディングフレームの理論データベースと比較し、サンプル中のペプチドを同定します。その際、ここに示したパラメータを使用し、ターゲット・デコイ法などの手法を用いて、ペプチドを偽発見率1%にフィルタリングします。同定されたペプチドを定量するために、MS1抽出イオンクロマトグラムにおけるヘビーおよびライトのペアの面積と、ペプチドの信号対雑音比（S/N比）を算出します。平均S/N比が5以上のペプチドペアのみを解析対象に含めます。2つのサンプルにおけるペプチドの相対的な存在量を、同一ペプチドのヘビーおよびライトバージョンのMS1ピーク面積比として定量します。ペプチドの偽発見率を1%にフィルタリングした状態で、タンパク質に含まれるすべてのペプチドのMS1ピーク面積比の中央値を、相対的なタンパク質存在量として算出します。

11,194個の固有ペプチド配列を含む、重ラベルおよび軽ラベル培養物から得られたc phytoフェルメント混合物のラベリング効率は98%であった。分画されていないvisierタンパク質溶解液についても同様に解析を行った。タンパク質発現の差は、広範囲な混合比率において、重ラベルサンプルと軽ラベルサンプルの混合比を再現性高く反映していた。具体的には、1対1で混合したサンプルの場合、および1対10および10対1で混合したサンプルの場合、タンパク質の99%で変動幅（fold change）が1.6未満であった。

タンパク質の99%が期待される比率の3.8倍以内に収まっており、1対1の混合比から離れるほど標準偏差が増加することが示された。Clostridium phytofermentumのプロテオームにरेडीラベリングを適用したところ、2000以上のタンパク質が定量され、グルコース培地で増殖させた複製培養物の94%のタンパク質が2倍以内のレベルで測定された。また、複製培養物のペア間における変動についても高い相関性が認められた。

これらの実験結果を総合すると、Ready proteomicsは複雑な試料間におけるタンパク質発現量の差を定量するための、正確で再現性の高い手法であることが裏付けられます。この技術は事実上あらゆる種類の試料に適用可能であるため、プロテオミクス分野の研究者が、新規微生物、魚類、哺乳類細胞を含むあらゆる試料におけるタンパク質発現の変化を探索する道を開きました。