SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

次の実験の全体的な目標は、タンパク質リジンメチルトランスフェラーゼまたはPK mtsの基質特異性を調査することです。これは、初期基質を同定し、異なる位置で単一のアミノ酸交換を含むこの基質のいくつかの変異体を持つペプチドアレイを調製することによって達成されます。第2のステップとして、ペプチドアレイを放射性メチル基ドナーの存在下でPKMTとインキュベートし、対応するペプチドスポットへの放射能の移動によるペプチドメチル化の検出を可能にします。

次に、アレイをX線フィルムに曝露し、各ペプチドのメチル化活性を決定するために定量的に分析します。また、PKMTの特異性プロファイルを定義するために、結果は、基質ペプチド中のどのアミノ酸がPKMTによるメチル化に重要であるかを示しています。この手法や個々のペプチドのメチル化などの既存の方法の主な利点は、1回の実験で多数の異なるペプチドをコスト効率よく試験できることです。

この方法は、これまで知られていなかったPK mtssの新規基質の仕様化など、タンパク質lymメチル化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この方法は、PK mtsの特異性についての洞察を提供することができます。また、プロテインキナーゼ、他のタンパク質法、トランスフェラーゼなどの他のシステムに適用したり、トランスフェラーゼに追加したりすることもできます。

私が最初にこの方法のアイデアを持っていたのは、ペプチドスポット合成を使用してリーズナブルなコストで大規模なカスタムペプチドアレイを調製する可能性に精通したときですこの手順を開始するには、multi pep spotterソフトウェアを使用して合成用のペプチド配列を設計します。ペプチド配列を1文字のコードとして入力し、各文字は、このプレスウェル、アミノペグ、末端のアミノペグ、ジメチルホルムアミドまたはDMFの末端に続いて、特定のアミノ酸を定義します。終了したら、濡れたメンブレンを気泡やしわのないスポットシンセサイザーフレームに置きます。

合成プログラムを開始する前に、メンブレンを少なくとも10分間完全に乾燥させます。メンブレンを100%エタノールで3回洗浄して、メンブレン上の遊離アミノ基とのアミド結合を生成します。アミノ酸誘導体にDICとエチルヒドロキシアミノシノアセテートを添加することにより、入ってくるアミノ酸のカルボキシ基を活性化します。

活性化後、プログラム可能なロボットを使用して、アミノペグ官能化メンブレン上の目的の量の活性化アミノ酸を見つけます。前のステップを3回繰り返して、最初の活性化アミノ酸の結合を改善します。メンブレンを20分間インキュベートした後、DMFで洗浄し、乾燥させて遊離アミノ基をブロックした後、非結合アミノ酸を除去します。

メンブレンをDMFで4回洗浄した後、DMF中の20%ピペリンと20分間インキュベートして、FM保護基を除去します。メンブレンを洗浄して乾燥させた後、目的のペプチド長に達するまで、スポッティングとF MOC除去のステップを繰り返します。最後のF MOCグループD保護に続いて、DMFと100%エタノールでメンブレンを洗浄します。

次に、メンブレンをDMF中の0.02%ブロムフェノールブルーで、完全に青色になるまで最低5分間処理します。メンブレンを洗浄して乾燥させた後、シンセサイザーから取り出し、耐薬品性のある箱に入れます。側鎖の保護基を切断するための95%のトリクロロ酢酸とアミノ酸の側鎖を修飾から保護するためのスカベンジャー試薬からなる20〜25ミリリットルの側鎖D保護混合物で処理します。

深部保護剤がメンブレンを覆っていることを確認した後、ボックスを完全に閉じ、インキュベーション後に静かに振とうしながら1〜2時間インキュベートします。メンブレンを20〜25ミリリットルのジクロロメタンでそれぞれ2分間6回洗浄します。100%エタノールで2回洗浄した後、メンブレンを乾燥させて一晩乾燥させます。

次に、ペプチドアレイメンブレンを、酵素を含まないそれぞれのメチル化緩衝液と放射性標識メチル基を有するアメットを含む密封されたビニール袋にプレインキュベートし、プレインキュベーション緩衝液を廃棄し、それぞれのPKMTを含む8ミリリットルのメチル化緩衝液に膜を1〜2時間インキュベートする。その後、メチル化緩衝液を放射性廃棄物容器に廃棄し、ペプチドアレイを100ミリモルの重炭酸アンモニウムと1%STSを含む20ミリリットルの緩衝液で5分間洗浄し、結合したタンパク質を除去します。放射性廃棄物容器内の最後の洗浄バッファーを廃棄した後、メンブレンを10ミリリットルの増幅溶液で5分間インキュベー

その後、増幅液を有機溶媒用の放射性廃棄物容器に捨てます。ペプチドアレイをビニール袋に密封し、自動X線撮影カセットに入れます。オートX線撮影フィルムを暗室のペプチドに置きます。

次に、カセットを慎重に閉じます。マイナス80°Cで露光した後、現像して結果を解析します。最後に、強メチル化ペプチド基質の飽和を避けるために、異なる露光時間で画像を数回キャプチャします。

ここでは、ペプチドアレイとNSDアレイのメチル化反応の一例を示します。横軸はペプチドの配列を表し、縦方向の配列を表します。この変化したアミノ酸はnsdによるメチル化が示され、1つはそれがH3K36に特異的に作用し、3つのペプチドアレイの標的リジン固結の両側に3〜4個のアミノ酸残基を認識することを示すNSDの実験1つがここに示されている。

ペプチドの約85%はプラスマイナス20%より小さい標準偏差を示し、ペプチドの97%以上はプラスマイナス30%より小さい標準偏差を示しています計算された識別係数データは、NSD1がマイナス2の位置で芳香族残基を好むことを示しています。マイナス1およびプラス2のサイトでは、疎水性のatic残基が好ましい。そして、プラスワンサイトでは、アルギニン、リジン、グルタミン、またはアスパラギンが好まれます。

新規ペプチド基質の可能性は、ヒトプロテオームのデータベース検索によって見つけることができます。これらのペプチドの一部がomeで強力にメチル化されることで、新規なNSD Oneペプチド基質としての同一性が確認されます。この手順を試行する際には、この手順に従って最も適切な初期基板を使用することを忘れないでください。

対応するタンパク質のin vitroおよび細胞内でのメチル化のような他の方法は、タンパク質が基質として受け入れられるかどうかを調べるために、同様にその開発後に行うことができる。この技術は、タンパク質リジンメシル化の分野の研究者が、多くのPK mtsの基質特異性を定義し、いくつかの新規基質を同定する道を開きました。これは、PK mtsの重要な生物学的機能を理解するのに役立ちました。

ペプチド合成における放射能と有機溶媒の取り扱いは主張できることを忘れないでください、そしてこの手順を実行する際には常に適切な予防措置を講じる必要があります。