Name: SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶSPOTペプチド配列を用いたタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの基質特異性解析法。ペプチドアレイを合成し、放射性メチル基供与体を用いてメチル化活性を検出することで、酵素の基質スペクトルを定義し、生物学的役割を解明します。

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ペプチド配列の調製<ol><li>ペプチド配列のプログラミング<ol><li> MultiPepスポッターソフトウェアを使用して合成するためのペプチド配列を設計します。 1文字のコードでペプチド配列を入力してください。 ペプチド1：TARKSTGGKA </li><li>定義された基板の認識に必要な重要なアミノ酸をスクリーニングするために特定のコマンド（.replace、A）とアラニン又はアルギニン散歩ライブラリを生成します。例えば、次の例の最初の行は、野生型配列であり、2行目からのペプチド中の各アミノ酸がアラニンに順次変更される。 、Aを交換 TARKSTG -ARKSTG T- A -RKSTG TA-A -KSTG TAR- A -STG TARK- A -TG TARKS- A -G TARKST- A </li><li> 、次のようなコマンド（.replace Rを使用してください。1.1.2で説明したようにコンセンサスを決定するためのペプチド配列を合成するために、すべての自然に利用可能なアミノ酸残基（これらの残基は、酸化、時には低い合成収率を受けやすいので、最終的には、システイン、メチオニンおよびトリプトファンを省略）で）N 等を交換酵素の基質配列モチーフ。 注： 図4（a）に示すように、横軸は、与えられたペプチド配列を示し、縦軸は、コマンドのために選択されるアミノ酸を表す。 1.1.2に示された配列と同様に、縦軸AはAlaで順次図の最初の行で指定された配列の各位置を置き換えることを意味する。図4（a）。同様に、アルギニン順次ので、他のアミノ酸と上の第2行の各アミノ酸を置換する。完全なペプチド配列のライブラリーは、系統的に番目の各々に設けられたペプチド基質配列における各残基を置換することによって合成される電子他の天然に入手可能なアミノ酸残基が、これは、所与の配列の各位置におけるそれぞれの残基の影響を理解するのに役立ちます。 </li><li>あるいは、既知のまたは予測ペプチド基質のメチル化が容易正および負のメチル化コントロールと共にPKMTの標的ペプチドとの（メチル化に知られているまたはメチル化されたことがないことが知られている、すなわちペプチド）ペプチドライブラリーを合成することを検証することができる。手動プログラミングによって、以下に示すように、目標リジンのメチル化を確認するために、アラニンに推定標的リジンを交換することにより、ペプチドを合成する。 野生型ペプチド：STGG K PRQFL 変異ペプチド：STGG A PRQFL 注：このソフトウェアは、相互作用に必要な重要なアミノ酸をマッピングするための配列の所望のフレームシフトとのエピトープマッピングのように、さまざまなライブラリを作成するための固有のスクリプトを持っています。 </li></ol></li><li>膜の調製、アミノ酸D試薬<ol><li> 10分間、DMF（N、N-ジメチルホルムアミド）のスポット膜を事前に膨潤した後、気泡やしわなしでSPOTシンセサイザーフレームに濡れた膜を置く。 </li><li>メンブレン100％エタノールで3回洗浄する。合成プログラムを開始する前に少なくとも10分間、完全に膜を乾燥させる。 </li><li>並行して、新たにNMPに溶解して、市販のFmoc保護アミノ酸の0.5 Mの作業濃度に調製し、 表1に記載したように活性剤と塩基とを準備する。 </li><li> SPOTシンセサイザのすべての廃液容器を空にしていることを確認して、DMF、エタノール及びピペリジンで溶剤リザーバを補充します。 注：これでマシンは合成のために準備ができている。 </li></ol></li><li>まずアミノ酸のスポッティング<ol><li>膜上の遊離アミノ基とアミド結合を生成するために、広告によって着信アミノ酸のカルボキシ基を活性化するディング活性剤（N、N &#39;ジイソプロピルカルボジイミド）およびアミノ酸誘導体の塩基溶液（エチルヒドロキシシアノ）。 </li><li>プログラム可能なロボットを用いてアミノ官能化PEG膜上の活性化アミノ酸の所望のボリュームを見つける。 注：これは、アミノ酸のC末端は、膜のアミノ基に結合されている。 </li><li>最初の活性化されたアミノ酸のより良いカップリングを確実にするために、この手順を3回繰り返します。 20分のための膜をインキュベートした後、未結合アミノ酸を除去するために、DMFで洗浄する。 </li></ol></li><li>非スポット領域上のフリースペースのブロッキング 注：膜のアミノ基へのすべてのペプチドの最初のC末端アミノ酸のカップリング後、スポット、スポットエリア内のアミノ基の一部との間のアミノ基がアミノ酸と結合を形成しない。 <ol><li>キャッピング溶液（DMF中20％無水酢酸）を用いてインキュベートすることにより、これらの遊離アミノ基をブロック5分間。 注：これは、膜の代わりに、成長するペプチド鎖のさらなるサイクルでアミノ酸のカップリングを回避する。 </li></ol></li><li> Fmoc基の除去<ol><li>ブロッキング後、DMFで4回、膜を洗浄した後のFmoc保護基を除去するために20分間、DMF中20％ピペリジンでインキュベートする。 注：この手順は、アミノ保護のFmoc基の除去につながり、それが脱保護と呼ばれています。 </li><li>その後、エタノールで2回DMFで二回膜を洗って、それが乾燥させます。 注：今膜は、次のアミノ酸のカップリングの準備ができている。 </li></ol></li><li>鎖延長 注：各アミノ酸の付加は、サイクルと呼ばれる。別に最初のアミノ酸のカップリングから、サイクルが結合されたアミノ酸のFmoc基の脱保護で開始し、それが成長して激励のアミノ基への着信アミノ酸の活性化カルボキシル基とのカップリングに続いて潮のチェーン。 <ol><li>所望のペプチド長が得られるまで繰り返して、1.3と1.5の手順。 </li></ol></li><li>染色 注：最後のサイクルの後、ペプチド配列は、ペプチドの合成に成功を確認するために、ブロモフェノールブルーで染色する。ブロモフェノールブルーは、ペプチドの遊離アミノ基と結合する。ペプチドスポットは、染色後に淡青色を示すが、スポットの強度は、ペプチド配列に依​​存して変化する。ピペリジンブロモフェノールブルーの存在下でペプチドを染色していないため、この染色は、ピペリジンの完全な除去を確認できる。また、これは、さらなる使用のためのペプチド配列をマークするのに役立つ。 <ol><li>最後の合成サイクルにおけるFmoc基の脱保護の後、DMF、100％エタノールでメンブレンを洗浄する。それは完全に青色になるまで、5分間の最低ブロモフェノールブルー（DMF中の0.02％ブロモフェノールブルー）を有する膜を扱う。 </li><li>その後、DMFおよびETHを有する膜を洗うサノールを10分間乾燥させた。今、シンセサイザーから膜を取り出し、手動で側鎖の脱保護（セクション1.8）を実行する。必要に応じて、ペプチド合成（ 図2）の結果を文書化するために膜を撮影。 </li></ol></li><li>サイドチェーン脱保護<ol><li>側鎖保護基および捕捉試薬（2.5％の水および2.5％トリイソプロピルシラン）からのアミノ酸の側鎖を保護するために切断するために、95％トリフルオロ酢酸（TFA）からなる側鎖脱保護混合物20~25 mlの膜を扱うこのステップの間変更。それは完全に密​​閉された化学薬品耐性のボックス内膜をカバーしていることを確認し、穏やかに振盪しながら1から2時間のためにそれをインキュベートし、脱保護混合物の十分なボリュームを取る。 </li><li> 2分ごとに、DCM（ジクロロメタン）20-25 mlの膜を6回洗浄し、最終的に二回、100％エタノールで、一晩デシケーターでそれを乾燥させてください。 注：今すぐ膜は、実験に使用することができる。ペプチドアレイの合成のスキームを図1に提供される。 </li></ol></li></ol> 2.タンパク質の発現および精製<ol><li> GST融合物としてPKMTsのタンパク質発現<ol><li>標準的な技術を用いて、GST融合タンパク質として発現させるために（をpGEX-6P2のような）細菌の発現ベクターに、完全長PK​​MTまたはその触媒ドメインをコードする遺伝子をクローニングする。 </li><li> BL21またはBL21コドンプラスE.挿入希望PKMTとベクトルを転送ヒートショック法または他の任意の方法によって大腸菌細胞。 </li><li>式の当日にルリア - ベルターニ（LB）メディアの30ミリリットルで前培養を準備し、継続的に振盪しながら7から8時間、37℃でインキュベートする。 </li><li>次に、LB培地1 Lを含む2 L大きなバッフル付きフラスコに予備培養物10mlを転送し、37℃でインキュベート 培養に到達するまで連続振盪インキュベーターで°C600nmで定義された光学密度ES。 注：これは、各タンパク質のために最適化することができるが、我々が日常的に約0.8のOD 600nmまでで誘導する。誘導温度を個別に各タンパク質について最適化されなければならない、いくつかのタンパク質は、22で良好な発現を示す °Cより高い温度でのいくつかの。 </li><li>イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを1mMで誘導し、培養物を誘導温度で10〜12時間増殖させ、次いで、15分間誘導温度に細胞を移す。 </li><li>その後15分間5000×gでの遠心分離によって細胞を回収し、最後に、他の用途のために-20℃でSTE緩衝液（10mMトリスpH8.0で、100mMのNaClおよび0.1mM EDTA）及び店舗30mlでペレットを洗浄する。 </li></ol></li><li>タンパク質精製<ol><li>細胞ペレットを解凍し、超音波処理緩衝液（50mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）30mlに再懸濁し、超音波処理によって破壊する。 注：このバッファnEEDSは、最終的に、各タンパク質のために最適化される。 </li><li> 1時間22000×gで細胞溶解物を遠心して、後から上清を収集し、グルタチオンセファロース4B樹脂600μlのを含むカラムを通過する。 </li><li>非特異的に結合したタンパク質を除去するために超音波処理緩衝液50mlおよび高塩緩衝液（50mMトリスpH7.5で、500mMのNaCl、1mMのDTT、5％グリセロール）100mlで次でカラムを洗浄する。 40 mMのグルタチオンを含む高塩緩衝液5mlで結合したタンパク質を溶出する。 </li><li>低いグリセロール（20mMトリスpH7.4中の100mMのKCl、0.5mMのDTTおよび10％グリセロール）pH7.4で2時間、後に20mMのトリス、100mMの塩化カリウム、0.5mMの透析緩衝液2リットル中に溶出したタンパク質を透析DTT、70％グリセロール、8時間または一晩。すべての精製バッファは4℃であり、タンパク質の変性を避けるために、低温室でタンパク質精製を行うことを確認してください。 </li></ol></li></ol> 3.ペプチドアレイのメチル化<ol><li>事前incuペプチド配列のbation <ol><li>酵素と高価な放射性標識したのAdoMetの浪費を避けるために適切な大きさの箱やビニール袋にいずれかのペプチド配列のメチル化を実行します。 10分間酵素なしそれぞれのメチル化緩衝液を含有する密封されたビニール袋中のペプチド配列膜をプレインキュベートし、標識された[メチル - 3 H] -AdoMet。例では、完全な特異プロファイルペプチドアレイ用のメチル化バッファーを8mlを使用するための緩衝液の体積は、配列のサイズに依存する。各酵素の量とのAdoMetの濃度を最適化します。 </li></ol></li><li>ペプチド配列のメチル化<ol><li> 1から2時間-AdoMetプレインキュベーション緩衝液を破棄し、それぞれのPKMTを含むメチル化バッファーの8ミリリットルで膜をインキュベートし、標識[メチル - 3 H]。 NOTE：メチル化反応に必要な酵素の量は、特定のPKMTの活性に依存し、我々は、典型的には、50nMの酵素フィンと私たちのスクリーニング実験を開始Al濃度。 </li></ol></li><li>ペプチド配列の洗濯<ol><li>その後、放射性廃棄物容器内のメチル化バッファーを破棄し、結合したタンパク質を除去するために5分間、100 mM重炭酸アンモニウム、および1％SDSを含む緩衝液20mlで5回のペプチドアレイを洗浄する。放射性廃棄物容器内の洗浄緩衝液を廃棄します。 </li></ol></li><li>放射性シグナルの検出<ol><li>洗浄した後のAmplify溶液（NAMP100V）の10ミリリットル中で5分間メンブレンをインキュベートする。 </li><li>その後、ビニール袋にペプチドアレイを密封、有機溶媒の放射性廃棄物容器にAmplifyソフトウェア液を捨て、オートラジオグラフィーカセットに入れ。 </li><li>暗い部屋でのペプチドアレイ上のオートラジオグラフィーフィルムを配置します。慎重にカセットを閉じ、-80でそれを公開する 必要な時間のためのC°。その後、結果を分析するためにフィルムを開発する。異なるexpositioで倍の画像のカップ​​ルをキャプチャn回強くメチル化ペプチド基質の飽和を回避する。 </li></ol></li></ol> 4.データ処理と解析<ol><li>スポット強度の濃度測定分析<ol><li>従来のスキャナでフィルムをスキャンし、デンシトメトリーでスポット強度を分析。 （フリーウェアです）この使用したImageJまたは商業プログラムの操作を行います。 注：私たちは、この作業にPhoretixソフトウェアを使用。 </li></ol></li><li>正規化と異なる膜からの結果の平均化<ol><li>三重に少なくともペプチドアレイメチル化実験を行う。 1.0として基準基板でのバックグラウンド減算および活性を設定することで、各実験のためにスキャンされた強度を正規化する。個々のスポットのデータを平均化し、それらを、平均値および標準偏差を報告する。 </li></ol></li><li>データ解析と表示<ol><li>相対活性を示すのにグレースケールまたはカラースキームを使用して2Dでデータをプロットします。こののWiかの操作をここに示すように、ExcelやSIGMAPLOT番目。また、データの質を分析するための反復実験の標準偏差の分布のプロットを準備する。 </li><li>定量的基質ペプチドの各残基の認識の精度を比較し、表示するには、私は差別係数D 16,17による位置xにおける各アミノ酸のPKMTの相対的な優先度を計算します。 D X; I = &lt;V のj≠I&gt; / V I - 1 ます。v iは、位置xとのアミノ酸のiを運ぶペプチド変異体のメチル化率である。ここで、&lt;ます。v jは≠i&gt;を含む位置xにおける異なるアミノ酸jは≠iのを運ぶすべての19のペプチドのメチル化の平均速度は、（ある野生型配列）。 注：このことによって定義される識別因子がバックグラウンドレベルに依存する。一つだけ残渣を差別、3％のバックグラウンドを持つ特定の位置で受け入れられた場合32.3倍が得られる。 0の判別係数の位置の結果での指定なし。 </li></ol></li></ol>

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利益相反は宣言されていません。

SPOT合成ここに記載されるように、タンパク質 - タンパク質相互作用部位をマッピングし、ペプチド修飾酵素の基質認識を調査するための強力な方法である。 SPOT法により合成されたペプチドは、これは、各インスタンスに確認することが困難であり、90％を超える純度21を有することが報告されているが、しかし、SPOT合成は、依然として、いくつかの欠点を有している。したがって、結果は、タンパク質ドメインを使用して、インスタンスのための他の方法によって、または標準的な方法によって合成された精製されたペプチドで再生しなければならない。また、SPOTアレイの他の主な欠点は、ほとんどの時間は、彼らが一つの配列といくつかのアッセイを実行するために再利用できないということである。 低い安定性のアミノ酸との合成の効率を高めるために、保護されたアルギニンのように、それは、すべての5サイクルのためにそれらを新鮮にすることが重要である。酵素反応やタンパク質結合研究では、多くの場合、ペプチドスポットの周囲はカを有することが観察される中央（「リングスポット効果」）よりも...

過去20年間、いくつかの報告は、細胞の発達および癌のようないくつかの疾患において、翻訳後修飾（PTM）の重要性を実証したが、最近、タンパク質のリジンのメチル化は、他の重要なPTMとして浮上している。最初にヒストンリジンのメチル化は、本質的なクロマチンマークであることが見出されたが、後の研究は、いくつかの非ヒストンタンパク質1~4のリジンのメチル化を示した。リジン残基のεアミノ基へのS-アデノシル-L-メチオニンからのメチル基の連続的な移動は、ヒトゲノム中に60以上のタンパク質を含むタンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼ（PKMTs）と呼ばれる酵素のファミリーによって触媒される。 PKMTsは、最初に特定のリジン残基をメチル化、ヒストン修飾酵素として発見されたが、後の報告は、これらはまた、非ヒストンタンパク質5をメチル化できることを実証した。現在までに、約5000リジンメチル化部位は、異なるタンパク質上で同定された6 </sアップ&gt;が、これらの変更に関与する酵素は、多くの場合、特定されていません。その理由の一つは、最もPKMTsの特異性が広く研究されていないことである。そのため、反復的にPKMTsの新規基質が発見されていることを発生する。 PKMTsの基質特異性の詳細な知識の欠如は、それらの生物学的機能と役割の理解を妨げる。詳細PKMTの特異性を研究するために、1若しくは数個のアミノ酸が異なる多くのペプチド基質のメチル化率を測定する必要があり、理想的には、ペプチドアレイを用いて行われる、比較。得られた特異性プロファイルに基づいて、PKMTsの潜在的基質をさらに研究することができることを同定することができる。 ペプチド配列は、抗体の生化学分析のために広く使用されているツールは、ペプチド修飾酵素およびタンパク質-タンパク質相互作用部位（抗体-抗原、受容体-リガンド）のマッピング7-9である。ペプチドの数百SUCのために必要とされるHアプリケーション。別の方法は、それらの間で樹脂上でのペプチド合成は、非常に一般的に使用され、ペプチド合成のために利用可能であるが、それは、スループットに制限があり、それが比較的高価である。これらの問題は、フランクと同僚10によるSPOT合成法の導入により解決された。 SPOT合成法は、並行して、数百のペプチドの合成を可能にし、平均して、樹脂の合成に比べて安価である。セルロース膜上に合成されたペプチドは、膜から切断し、溶液アッセイにおいて、またはペプチドマイクロアレイ10-13を調製するための遊離ペプチドとして使用することができ、様々なアプリケーションまたはペプチドのいずれかのために直接使用することができる。 SPOT合成は、固体支持体としてのセルロース膜を使用し、標準的なFmoc化学10-13を用いる固相ペプチド合成の変異体である。したがって、ペプチド鎖の合成は、C末端から始まりに向かって進行するリボソームにおける生物学的合成とは対照的に、N末端。セルロース膜は、第一の活性化アミノ酸（ 図1）の取付けのために官能化される。 SPOT法は、自動化ピペッティングシステムを用いて膜上の規定のスポットへの溶媒の液滴中の活性化されたアミノ酸の逐次的送達に基づいている。液体の液滴は、それが後でペプチド合成における化学反応のためのオープンな反応器として機能する円形のウェットスポットを形成し、多孔質膜上に分配される。スポットサイズは​​体積分注し、膜の吸収能力によって決定され、そのようなスポットの倍数は、アレイとして配置されている。合成のスケールは、スポットサイズ、膜の積載量と相関する。スポットのアレイの密度との間の距離は、スポットサイズを変化させることによって管理されている。セルロース膜はchemicに耐性は、安価で、ペプチド合成において固相として、いくつかの利点を有する水溶液中で安定であり、取り扱いが容易で、ペプチド合成に使用するals。また、その親水性の性質は、いくつかの生物学的アッセイシステムに適しています。 SPOT合成は、ペプチドの必要数に応じて、（ペプチドの1000など）を手動で行うか、自動化することができる。 Intavis（ケルン、ドイツ）から完全に自動化されたSPOT合成は、我々の用途に用いられる。これは、異なる量および異なる長さのペプチドの合成を可能にする。また、段階的合成14,15によって調製することができる線状ペプチドは、定期的に、最大42個のアミノ酸の付加ペプチドが、15〜20アミノ酸長で合成される。しかしながら、アミノ酸の数を増加させることは、ペプチドの品質に影響を与える全体的なカップリング収率の低下につながる。なぜならスポットあたりのペプチドの量が少ないと、製品はしばしば精製が困難であり、個々のペプチドの品質を容易に評価することはできない。したがって、結果は、SPOT PEPTから得IDEの配列のいずれかのペプチドの合成において、所望のペプチド配列を含むタンパク質を合成することによって基準に従って精製し、分析することができる大規模で標準的な方法によって合成されたペプチドを確認しなければならない。それでも、我々は高い信頼性がSPOT合成を見つけ、再現性があることが一般に生じる。 SPOT合成は、いくつかの市販の修飾アミノ酸はまた、合成のために使用することができ、タンパク質構成アミノ酸に制限ペプチドは、側鎖保護基の最終的な切断の前と後に修正されることを可能にし、さらに、それはまた、組み込むことを可能にされていない、リン酸化されたメチル化またはアセチル化アミノ酸は11。 SPOT法により合成固定化ペプチドライブラリーは、直接、多くの生物学的および生化学的アッセイのために使用することができる。我々はPKMTsの基質特異性を調べるために300-400ペプチドを含むペプチドアレイを用いた。酵素によるMODIFIのために陽イオンは、ペプチド配列は、それぞれPKMTと共にインキュベートされ、適切な緩衝液中に[メチル- 3 H]標識-AdoMet。それぞれの基質のメチル化は、オートラジオグラフィー（ 図3）を介して、ペプチド基質へのAdoMetから放射性標識されたメチル基の酵素的転移を下記によって分析される。この手順によって、ペプチドアレイは、同時に異なるペプチド基質のメチル化の研究を可能にする。この方法の1つの重要な利点は、メチル化動態の線形位相の間に、各ペプチドの相対的なメチル化は、解離定数（k 猫 / Kで割った触媒速度定数に比例するように、すべてのペプチドは、競争においてメチル化されていることであるそれぞれのペプチド基質に対する酵素のD）。したがって、各スポットに取り込まれた放射活性の量は、直接特定のペプチドに向かって酵素活性と相関している。使い方ペプチド配列のメチル化実験の結果、PKMTの特異性プロファイルが定義され、この新規基質に基づくこ​​とができるが前提とすることができる。ペプチド配列は、ペプチドレベルでの新規基質のメチル化の迅速かつ費用効率的な検証を可能にする。このために、アレイは、標的部位でのLysのAlaの代わりにを含む修飾されたペプチド、ならびに陽性および陰性対照ペプチドと共に予測新規基質を含有する調製される。最後に、新規基質は一緒にターゲットのLysがAlaに変更され、メチル化は、タンパク質レベルで確認することができる変異体を有するタンパク質として調製することができる。結果に応じて、これは、新たに記載されるタンパク質基質のメチル化の潜在的な役割に対処する生物学的研究が続いている。

<table><tbody><tr><td>エタノールabs勾配の等級HPLC</td><td>のHoneywell</td>の<td>10299901</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>N、N-ジメチルホルムアミドのペプチッドの統合</td><td>Biosolve</td><td></td><td>4193302 可燃性、有毒</td></tr>な<tr><td>ピペリジン>ペプチド合成</td><td>ロス</td><td>A122.1</td>可燃性<td>、毒性、腐食性</td></tr><tr><td>のオキシマピュア(エチル(ヒドロキシイミノ)シアノ酢酸)</td><td>Novabiochem</td><td>8510860100</td><td></td></tr><tr><td>N、N'の99%-ジイソプロピルカルボジイミドプルム &ge;98% GC</td><td>Fluka</td><td>38370</td><td>可燃性、毒性、腐食性</td></tr>無<tr><td>水酢酸</td><td>Roth</td><td>CP28.1</td><td>可燃性、毒性、腐食性</td></tr><tr><td>トリイソプロピルシラン 99%</td><td>Aldrich</td><td>233781</td><td>可燃性、有毒</td></tr><tr><td>なジクロルメタン &ge;99.9%</td><td>Roth</td><td>P089.1</td><td>発がん性</td></tr><tr><td>N-メチル-2-ピロリドン</td><td>Roth</td><td>4306.2</td><td>有毒</td></tr><tr><td>誘導体化セルロース 膜</td><td>Intavis AG K&ouml;ln</td><td>32.1</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸</td><td>Roth</td><td>P088.2</td><td>有毒で腐食性</td></tr>の <tr><td>Bromphenolblue</td><td>AppliChem</td><td>A3640.0010</td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素アンモニウム</td><td>Roth</td><td>T871.2</td><td>有毒</td></tr><tr><td>なドデシル硫酸ナトリウムペレット</td><td>Roth</td><td>CN30.3</td><td>有毒で可燃性</td></tr><tr><td>の MultiPep シンセサイザー</td><td>Intavis AG K&ouml;ln</td><td>n.a.HyperfilmTM</td><td></td></tr> <tr><td>高機能フィルム</td><td>GEヘルスケア</td><td>28906837</td><td></td></tr><tr><td>Phoretixソフトウェア</td><td>TotalLab</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

spotペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Specificity Analysis of Protein Lysine Methyltransferases Using SPOT Peptide Arrays

リジンのメチル化は、新たな翻訳後修飾であり、それは細胞の発達および多くの疾患において重要な役割を果たしているいくつかのヒストンおよび非ヒストンタンパク質、上で同定された。約5000リジンメチル化部位は、タンパク質のリジンメチルトランスフェラーゼの数十によって設定された異なるタンパク質、上で同定された。これは、各PKMTしかし今は、1つまたは2つの基板は、これらの酵素のいくつかのために同定されているまで、複数のタンパク質をメチル化することを示唆している。この問題に取り組むために、我々が導入しているペプチドアレイベースの基質特異性はPKMTsの分析。異なる配列を有するいくつかの基板のメチル化は1アレイ上でテストすることができるので、ペプチドアレイはPKMTsの特異性を特徴づけるための強力なツールです。我々はIntavis SPOT合成機を用いてセルロース膜上にペプチド配列を合成し、様々なPKMTsの特異性を分析した。これらの酵素のいくつかのために、その結​​果に基づいて、新規のubstratesを同定することができた。例えば、ペプチドアレイを用いることによりNSD1ために、我々はそれがH4のK44の代わりに報告H4K20のメチル化と加えH1.5K168は以前から知​​られているH3K36上非常に好ましい基質であることを示した。したがって、ペプチド配列は、生化学的にPKMTsを特徴付けるための強力なツールです。

ペプチドアレイが正常生化学PKMTsの特異性を特徴付けるために使用し、PKMTのいくつかの新規なヒストンおよび非ヒストン基質は、このアプローチ5,16-19によって同定した。 PKMT（または任意の酵素）の正確な基質スペクトルを定義すると、その分子機構と細胞機能の理解に向けて不可欠なステップである。 ペプチドSPOTアレイメチル化法の適用例として、NSD1 PKMT 19の特異性分析の結果を説明する。私たちの仕事に前に、この酵素は、K36でのヒストンH3およびヒストンH4 K20でなく、K218とK221。 図でNF-kBのファミリー転写因子のp65を含むメチいくつかの基板に説明した。図4Aは、NSD1有するペプチド配列のメチル化反応の一例を示している。この実験のために、H3（31-49）の配列に基づいて大ペプチドアレイは、すべての可能含むように合成したNSD1相互作用およびメチル化のための各アミノ酸の重要性をテストするために、元の配列の単一アミノ酸変化。合計380のペプ...

SPOT法で合成されたPeptideアレイは、Protein lysine methyltransferases(PKMT)の基質特異性を分析し、PKMTの基質スペクトルを定義してその生物学的役割を理解するために使用できます。このプロトコルでは、ペプチドアレイを合成し、PKMTでメチル化し、その結果を分析する方法について説明します。

SPOTペプチド配列を用いてタンパク質リジンメチルトランスフェラーゼの特異性の解析

Lysine methylation is an emerging post-translation modification and it has been identified on several histone and non-histone proteins, where it plays ...

次の実験の全体的な目標は、タンパク質リジンメチルトランスフェラーゼまたはPK mtsの基質特異性を調査することです。これは、初期基質を同定し、異なる位置で単一のアミノ酸交換を含むこの基質のいくつかの変異体を持つペプチドアレイを調製することによって達成されます。第2のステップとして、ペプチドアレイを放射性メチル基ドナーの存在下でPKMTとインキュベートし、対応するペプチドスポットへの放射能の移動によるペプチドメチル化の検出を可能にします。次に、アレイをX線フィルムに曝露し、各ペプチドのメチル化活性を決定するために定量的に分析します。また、PKMTの特異性プロファイルを定義するために、結果は、基質ペプチド中のどのアミノ酸がPKMTによるメチル化に重要であるかを示しています。この手法や個々のペプチドのメチル化などの既存の方法の主な利点は、1回の実験で多数の異なるペプチドをコスト効率よく試験できることです。この方法は、これまで知られていなかったPK mtssの新規基質の仕様化など、タンパク質lymメチル化分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この方法は、PK mtsの特異性についての洞察を提供することができます。また、プロテインキナーゼ、他のタンパク質法、トランスフェラーゼなどの他のシステムに適用したり、トランスフェラーゼに追加したりすることもできます。私が最初にこの方法のアイデアを持っていたのは、ペプチドスポット合成を使用してリーズナブルなコストで大規模なカスタムペプチドアレイを調製する可能性に精通したときですこの手順を開始するには、multi pep spotterソフトウェアを使用して合成用のペプチド配列を設計します。ペプチド配列を1文字のコードとして入力し、各文字は、このプレスウェル、アミノペグ、末端のアミノペグ、ジメチルホルムアミドまたはDMFの末端に続いて、特定のアミノ酸を定義します。終了したら、濡れたメンブレンを気泡やしわのないスポットシンセサイザーフレームに置きます。合成プログラムを開始する前に、メンブレンを少なくとも10分間完全に乾燥させます。メンブレンを100%エタノールで3回洗浄して、メンブレン上の遊離アミノ基とのアミド結合を生成します。アミノ酸誘導体にDICとエチルヒドロキシアミノシノアセテートを添加することにより、入ってくるアミノ酸のカルボキシ基を活性化します。活性化後、プログラム可能なロボットを使用して、アミノペグ官能化メンブレン上の目的の量の活性化アミノ酸を見つけます。前のステップを3回繰り返して、最初の活性化アミノ酸の結合を改善します。メンブレンを20分間インキュベートした後、DMFで洗浄し、乾燥させて遊離アミノ基をブロックした後、非結合アミノ酸を除去します。メンブレンをDMFで4回洗浄した後、DMF中の20%ピペリンと20分間インキュベートして、FM保護基を除去します。メンブレンを洗浄して乾燥させた後、目的のペプチド長に達するまで、スポッティングとF MOC除去のステップを繰り返します。最後のF MOCグループD保護に続いて、DMFと100%エタノールでメンブレンを洗浄します。次に、メンブレンをDMF中の0.02%ブロムフェノールブルーで、完全に青色になるまで最低5分間処理します。メンブレンを洗浄して乾燥させた後、シンセサイザーから取り出し、耐薬品性のある箱に入れます。側鎖の保護基を切断するための95%のトリクロロ酢酸とアミノ酸の側鎖を修飾から保護するためのスカベンジャー試薬からなる20〜25ミリリットルの側鎖D保護混合物で処理します。深部保護剤がメンブレンを覆っていることを確認した後、ボックスを完全に閉じ、インキュベーション後に静かに振とうしながら1〜2時間インキュベートします。メンブレンを20〜25ミリリットルのジクロロメタンでそれぞれ2分間6回洗浄します。100%エタノールで2回洗浄した後、メンブレンを乾燥させて一晩乾燥させます。次に、ペプチドアレイメンブレンを、酵素を含まないそれぞれのメチル化緩衝液と放射性標識メチル基を有するアメットを含む密封されたビニール袋にプレインキュベートし、プレインキュベーション緩衝液を廃棄し、それぞれのPKMTを含む8ミリリットルのメチル化緩衝液に膜を1〜2時間インキュベートする。その後、メチル化緩衝液を放射性廃棄物容器に廃棄し、ペプチドアレイを100ミリモルの重炭酸アンモニウムと1%STSを含む20ミリリットルの緩衝液で5分間洗浄し、結合したタンパク質を除去します。放射性廃棄物容器内の最後の洗浄バッファーを廃棄した後、メンブレンを10ミリリットルの増幅溶液で5分間インキュベートします。その後、増幅液を有機溶媒用の放射性廃棄物容器に捨てます。ペプチドアレイをビニール袋に密封し、自動X線撮影カセットに入れます。オートX線撮影フィルムを暗室のペプチドに置きます。次に、カセットを慎重に閉じます。マイナス80°Cで露光した後、現像して結果を解析します。最後に、強メチル化ペプチド基質の飽和を避けるために、異なる露光時間で画像を数回キャプチャします。ここでは、ペプチドアレイとNSDアレイのメチル化反応の一例を示します。横軸はペプチドの配列を表し、縦方向の配列を表します。この変化したアミノ酸はnsdによるメチル化が示され、1つはそれがH3K36に特異的に作用し、3つのペプチドアレイの標的リジン固結の両側に3〜4個のアミノ酸残基を認識することを示すNSDの実験1つがここに示されている。ペプチドの約85%はプラスマイナス20%より小さい標準偏差を示し、ペプチドの97%以上はプラスマイナス30%より小さい標準偏差を示しています計算された識別係数データは、NSD1がマイナス2の位置で芳香族残基を好むことを示しています。マイナス1およびプラス2のサイトでは、疎水性のatic残基が好ましい。そして、プラスワンサイトでは、アルギニン、リジン、グルタミン、またはアスパラギンが好まれます。新規ペプチド基質の可能性は、ヒトプロテオームのデータベース検索によって見つけることができます。これらのペプチドの一部がomeで強力にメチル化されることで、新規なNSD Oneペプチド基質としての同一性が確認されます。この手順を試行する際には、この手順に従って最も適切な初期基板を使用することを忘れないでください。対応するタンパク質のin vitroおよび細胞内でのメチル化のような他の方法は、タンパク質が基質として受け入れられるかどうかを調べるために、同様にその開発後に行うことができる。この技術は、タンパク質リジンメシル化の分野の研究者が、多くのPK mtsの基質特異性を定義し、いくつかの新規基質を同定する道を開きました。これは、PK mtsの重要な生物学的機能を理解するのに役立ちました。ペプチド合成における放射能と有機溶媒の取り扱いは主張できることを忘れないでください、そしてこの手順を実行する際には常に適切な予防措置を講じる必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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