Name: 表現型マウス肺機能インビボ肺拡散能力を持つ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-06T10:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぶマウスの肺拡散能測定法。ガスクロマトグラフを用いてネオンと一酸化炭素のガス交換を解析し、肺疾患モデルでの機能変化を評価します。簡便で再現性の高い手法は、ヒトとの比較研究にも応用可能です。

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注：すべての動物のプロトコルはジョンズ·ホプキンス大学動物実験委員会によって承認された。 1.動物の準備<ol><li>以下のステップ2.3に概説されているようケタミンとキシラジンでそれらを麻酔により、DFCO測定に6 C57BL / 6対照マウスを準備します。 </li><li>対照と同様の手順を使用して、表1に示す異なる肺病変を有する他のすべてのマウスを準備する。これらのモデルのそれぞれを確立するために必要な具体的な詳細は、関連文献に見出される。対照マウスと他の病理学的コホートのものは、年齢のすべての6-12週間です。 </li></ol>一酸化炭素に対する拡散係数の2.測定（DFCO） <ol><li>窒素、酸素、ネオン、及び一酸化炭素のピークを測定する機械で供給されたガスクロマトグラフモジュールを設定する。このアプリケーションでは唯一のネオンとCOデータを使用する。 注：この装置は、分子のSを使用しています12.00ミクロンフィルム、320.00ミクロンID及び長さ10mで、キャリアガスとしてヘリウムを用いてカラムをIEVE。クロマトグラフカラムは、0.8ミリリットルの容量を持っていますが、我々は、サンプルとの接続配管の適切なクリアを確実にするために2ミリリットルを使用していました。 </li><li>各実験日の開始時に、マウスからのサンプルの測定を行う前に、約0.5％のNeと、0.5％のCOを含むガス混合物バッグから直接の2mlサンプルを取り、空気バランスをとる、および較正するために、このサンプルを使用ガスクロマトグラフ。 </li><li>ケタミン（90ミリグラム/ kg）およびキシラジン（15ミリグラム/ kg）でマウスを麻酔し、反射運動の欠如によって麻酔を確認する。乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を適用します。 （非常に若いマウスでは成人で18 Gまたは20 G）スタブ針カニューレをマウスにTracheostomize。 注：DFCOは麻酔後に10分未満で完了し、すべての機械的な換気または他の手順の前にされている。 </li><li> 6週齢よりも大きいマウスでは3 mlシリンジtを使うO混合ガスバッグからのガス0.8mlの撤回。気管カニューレにシリンジを接続し、すぐに肺を膨らませる。メトロノームを使用して、9秒をカウントしてから、すぐに0.8ミリリットル（呼気）を撤回。 </li><li>この撤回0.8ミリリットルが室内空気との2ミリリットルに空気を吐き出さ希釈し、それは少なくとも15秒間休むことができます。その後、分析のためにガスクロマトグラフに全サンプルを注入する。 </li><li>この第DFCO試料を分析しながら、ガス混合バッグから第0.8ミリリットルでマウス肺を膨張し、最初のサンプルと同じでこのサンプルを処理する。 2 DFCO測定を平均化する。 注：0.8 mlの体積が非常に若いマウスの肺で測定を行うには大きすぎるので、2週齢の幼いマウスにおいて測定のために、0.4 mlの容量を使用する。これは、6週間以上経過したマウスの0.8容を使用することをお勧めし、0.4mlの容量がいくつかのマウスのために必要とされる場合、それは研究されてコホート内のすべてのマウスについて一貫して使用されるべきである。 </li><li> DFCOを計算（9 CO / CO c）は/（Neが9 / Neとc）は、cおよび9添字注入校正ガスの濃度は、それぞれ、9秒の息止め時間後に除去したガスを参照する- 1である。 </li><li>分析し、一方向ANOVAとの差を比較し、すべてのコホートマウスにおける多重比較のためのテューキーの補正との有意水準を評価する。 P &lt;0.05として重要な価値を考えてみましょう。 注：ここで使用したマウスのすべてがここで報告されていない肺換気、力学、肺洗浄液、または組織学のいくつかのその後の測定を伴う実験研究の一部であった。この方法は、対照マウスに上記行ったように、すべての実験モデルにおいて同様であるのでさらに、種々の病理学的モデルからの結果のみを提示する。これらのモデルの詳細については、補足表に示されている。 </li><li>深いanestheにより動物を安楽死させるチック過剰摂取は、頸椎脱臼または断頭が続く。必要な場合には、さらに生物学的または組織学的処理および分析のために死亡したマウスからの肺細胞および/または組織を取り除く。 </li></ol>

<ol><li>Ogilvie, C. M., Forster, R. E., Blakemore, W. S., Morton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+breath+holding+technique+for+the+clinical+measurement+of+the+diffusing+capacity+of+the+lung+for+carbon+monoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">A standardized breath holding technique for the clinical measurement of the diffusing capacity of the lung for carbon monoxide.</a> J Clin Invest. 36 (1 Pt 1), 1-17 (1957).</li>
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<li>Collins, S. L., Chan-Li, Y., Hallowell, R. W., Powell, J. D., Horton, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulmonary+vaccination+as+a+novel+treatment+for+lung+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pulmonary vaccination as a novel treatment for lung fibrosis.</a> PLoS One. 7 (2), e31299(2012).</li>
<li>Alessio, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BCD25%2BFoxp3%2B+Tregs+resolve+experimental+lung+injury+in+mice+and+are+present+in+humans+with+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">CD4+CD25+Foxp3+ Tregs resolve experimental lung injury in mice and are present in humans with acute lung injury.</a> J Clin Invest. 119 (10), 2898-2913 (2009).</li>
<li>Martinez, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+course+of+patients+with+idiopathic+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">The clinical course of patients with idiopathic pulmonary fibrosis.</a> Ann Intern Med. 142 (12 Pt 1), 963-967 (2005).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+lethal+intestinal+defect+in+a+mouse+model+of+cystic+fibrosis+by+human+CFTR%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Correction of lethal intestinal defect in a mouse model of cystic fibrosis by human CFTR.</a> Science. 266 (5191), 1705-1708 (1994).</li>
</ol>

利害の対立はなく、開示することは何もない。

本研究では、マウス肺の能力を交換するガスを定量化するための新しいメトリックを定義した。このメトリックは、拡散能、すなわち、肺の主要な機能を測定する一般的な臨床測定、ガスを交換する能力に類似している。拡散容量は、簡単かつ迅速に、マウスおよびヒトの両方で行うことができる唯一の​​肺の機能的測定である。マウスにおける肺疾患の検出のために、主要な目的は、対照群と実験コホート間の肺機能の変化を定量化することである。この目標を達成するために、我々は定義され、肺の発達と機能的変化を含むマウスにおける肺疾患の最も一般的なモデルのほとんどにおいて表現型の変化を、quanitfyingする能力を実証するDFCOを利用している。 マウスではDFCO測定を簡素化アプローチに固有の一つの仮定は、解剖学的および機器のデッドスペースに混合されていないインスピレーションガスの影響がIGNであるということです論理和。しかし、以前に10を説明し、0.8ミリリットルインフレボリュームの使用はすべての測定で、小さいながらも一貫性のあるエラーを紹介します。この誤差の大きさは、膨張及びデッドスペースボリ...

マウスは、現在の肺疾患の種々のモデル化に使用される主要な動物である。そのような病状をunderlyメカニズムを研究するために、表現型の方法は、それを病理学的変化を定量化することが必要とされている。換気力学が測定されている多くのマウス試験がありますが、これらの測定値は一般的に、通常、ヒトで行われ、肺機能の標準的評価とは無関係である。マウスおよびヒト対象において同等の測定を実行する能力は、ヒト疾患のマウスモデルの結果の翻訳を容易にすることができるので、これは残念なことである。 ヒト被験体における最も一般的かつ容易に行われる測定の一つは、一酸化炭素（DLCO）-1,2-ための拡散能であるが、この測定は、まれにしかマウスモデルで行われていない。手順は、しばしば扱いにくいまたはreqができるので、それは3-7報告されているこれらの研究では、部分的には、何のフォローアップ研究が行われていない複雑な装置uire。別のアプローチは、意識のあるマウスにおけるCOの拡散を測定することができるという利点を有する定常状態のシステムにおいて、CO再呼吸法を使用することである。しかし、この方法は非常に煩雑であり、結果は、マウスの換気のレベル並びにO 2およびCO 2濃度8.9で変化することができる。これらの困難は、そのいくつかの利点にもかかわらず、マウスでは肺の病理を検出する能力を拡散する日常的な使用を妨げているように見える。 マウスにおいて、拡散能力の測定に伴う問題を回避するために、マウスでそれを測定するための簡単な手段の詳細については、最近10に報告されている。手続きはすぐにガスを触発全体に等しい体積をサンプリングすることによって汚染されていない肺胞ガスをサンプリングする困難な問題を排除します。非常に再現性のある測定では、この手順の結果は、パのホストに敏感である一酸化炭素（DFCO）用の拡散係数と呼ばれる肺の表現型のthologic変化。 （CO 9 / CO c）に /（Neが9 / Neとc）は、cおよび9添字注入校正ガスおよび9秒の息止め時間後に除去したガスの濃度を表す、 - DFCOこうして1のように計算されるそれぞれ。 DFCO 1はCOのない取り込みを反映していない完全なすべてのCOの摂取、及び0を反映して、0と1の間で変化する無次元の変数である。 この発表では、この拡散能測定を行う方法を示し、そしてどのようにそれが気腫、線維症、急性肺損傷、およびウイルスおよび真菌感染を含むほぼすべての既存のマウス肺疾患モデルの変更を文書化するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>ガスクロマトグラフ</td><td>Inficon</td><td>Micro GC Model 3000A</td><td>Agilentは、同等のモデル</td></tr><tr><td>を作る 18 G ルアースタブニードル</td><td>ベクトン・ディッケンソン</td><td></td><td>他のいくつかの可能なベンダー</td></tr><tr><td>3 mlプラスチックシリンジ</td><td>ベクトン・ディッケンソン</td><td></td><td>他のいくつかの可能なベンダー</td></tr><tr><td>ポリプロピレンガスサンプルバッグ</td><td>SKC</td><td>1または2 L容量はうまく機能します</td><td>その他のガスタイトバッグはうまく機能します</td></tr><tr><td>ガスタンク、0.3%Ne、0.3%CO、バランスエア。(サイズME)</td><td>Airgas, Inc</td><td>Z04 NI785ME3012</td> これは、リン酸緩衝生理食塩水で希釈されたインフルエンザウイルスA/PR8のヒト25 TCID50/マウス<td>のDLCOに使用される標準混合物です</td></tr><tr><td>。</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブタ膵臓エラスターゼ</td><td>エラスチン製品、ミズーリ</td><td></td>州オーエンズビル <td>5.4 U</td></tr><tr><td>ブレオマイシン</td><td>APP 医薬品、シャンバーグ、イリノイ州</td><td></td><td>0.25 U</td></tr><tr><td>Escherichia coli LPS</td><td>Sigma L2880</td><td></td><td>3 &mu;g / g体重;O55:B5<</td></tr><tr><td>i>Aspergillus fumigatus (分離株Af293)分生子は、ジャガイモのブドウ糖寒天培地で栽培した成熟コロニーから採取した。</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

表現型マウス肺機能インビボ肺拡散能力を持つ

Phenotyping Mouse Pulmonary Function In Vivo with the Lung Diffusing Capacity

マウスは、現在の肺疾患の種々のモデル化に使用される主要な動物である。このような病状の根底にあるメカニズムを研究するために、表現型の方法は、病理学的変化を定量化することが必要とされている。さらに、マウスモデルへの並進の関連性を提供するために、そのような測定を容易にヒトおよびマウスの両方で行うことができるテストであるべきである。残念ながら、現在の文献に肺機能のいくつかの表現型の測定は、ヒトへの直接のアプリケーションがあります。唯一の例外は、日常的にヒトにおいて行われた測定である一酸化炭素拡散能である。今回の報告では、迅速かつ簡単にマウスではこの拡散能を測定するための手段を説明する。手順は、1分ガス分析時間が続く、麻酔したマウスにおけるトレーサガスと短い肺膨張を伴う。私たちは、肺気腫、線維症、急性肺損傷、およびインフルエンザを含むいくつかの肺の病変を検出するためのこの方法の能力をテストし、真菌の肺感染症、ならびに若い仔における肺成熟をモニタする。結果は、すべての重要な肺病変の減少、ならびに肺成熟と拡散容量の増加を示す。肺拡散能のこの測定は、このように既存の病的な肺モデルのほとんどと表現型の構造変化を検出する能力を有する広い用途を有する肺機能試験を提供する。

図1は、アスペルギルス属およびインフルエンザ感染症の両方に有意な減少、ならびに線維症の有意な減少、気腫、急性があったグループA、B、C、D、Eにおける成体マウスからDFCO測定値を示しており、F.肺損傷モデル。 図2に、2-6週間のマウスの年齢などの経時DFCOでグループG発達的変化を示している。この時間経過にわたって肺の発達と、わずかではあるが有意な増加があった。小さな膨張量を使用することの効果は、6週間の時点で非常に明らかであった。そこにわずかに高いDFCOを持っている女性の傾向があったが、これは5週の時点でのみ有意であった。 <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td style="width:40px;">グループ</td><td>病状または状態</td><td>注釈</td></tr><tr><td> A </td><td> C57BL / 6コントロール（8-10週間）において、n = 6 </td><td>健康なマウス&lt;/ TD&gt; </td></tr...

私たちは、マウスの肺拡散能力を迅速かつ簡単に測定し、それが複数の一般的な肺の病状における表現型の変化に対して十分に敏感であることを示す手段を説明します。 したがって、この指標は、拡散能力がヒトでも容易に測定されるため、マウスモデルに直接的な並進的関連性をもたらします。

The mouse is now the primary animal used to model a variety of lung diseases. To study the mechanisms that underlie such pathologies, phenotypic methods ...

次の実験の全体的な目標は、キャリブレーションされたガスクロマトグラフを使用してマウスの肺の拡散容量を測定する方法を学ぶことです。これは、麻酔をかけたマウスの肺をネオンと一酸化炭素を含むガスで膨らませ、ガスを肺に9秒間保持してガスを収集することによって達成されます。次に、肺から引き出されたガスを2ミリリットルに希釈し、ガスクロマトグラフに注入します。肺内のネオンと一酸化炭素の取り込みの違いは、拡散能力を計算するために使用されます。この測定値は、さまざまな肺疾患モデルにおける肺機能の喪失を評価するために使用できます。マウスの肺機能を測定するための他のすべての既存の方法に対するこの手法の主な利点は、これが非常に単純で再現性のある測定であり、ヒトの同様の測定値と直接比較できることです。この方法は、さまざまな肺の病状で発生する肺の構造の変化を追跡するために使用できます。このプロトコルは、窒素、酸素、ネオン、および一酸化炭素のピークを測定するために、マシンに付属のガスクロマトグラフモジュールを設定することから始まります。このアプリケーションでは、ネオンと一酸化炭素のデータのみが必要です。この装置は、キャリアガスとしてヘリウムを使用したモレキュラーシーブカラムを使用しています。この特定のガスクロマトグラフには 0.8 ミリリットルのカラムがあり、開始前にこのカラムが十分にクリアリングされるように 2 ミリリットルのサンプルが使用されます。一連の測定では、常にガスサンプルバッグから直接2ミリリットルのガスを使用して機械を校正します。最初に現れるピークはネオンで、次に酸素と窒素ですが、この手順では測定しません。最後に、一酸化炭素のピークは、ガスクロマトグラフの時間として表示されます。これらのピークをすべて測定するには、1分弱しかかかりません。まず、マウスにケタミンとキシラジンで麻酔をかけます。つま先をつまむことに反応する反射運動がないことで麻酔を確認します。次に目を保護するために、獣医用軟膏を塗布し、次にスチューデンカニューレでマウスを気管切開します。大人には18ゲージのカニューレを、非常に若いマウスには20ゲージのカニューレを使用してください。次に、1秒ごとにカチッという音が聞こえるメトロノームを開始します。6週齢以上のマウスの場合は、3ミリリットルの注射器を使用して、ガス混合バッグから0.8ミリリットルのガスを引き出します。.マウスが生後4週間未満の場合は、0.4ミリリットルのガスを使用してから、シリンジを気管カニューレに接続し、肺をすばやく膨らませます。メトロノームのクリック音と同期して、1から10まで頭の中で数え始めます。カウントが10に達したら、0.8ミリリットルの容量をすばやく引き出します。この呼気ガスを2ミリリットルに希釈するには、スペース、空気、重量を少なくとも15秒追加します。できるだけ早く肺を膨らませたり収縮させたりすることが非常に重要です。急速なインフレーションは非常に簡単ですが、0.8mlを迅速に正確に引き出すには少し練習が必要です。分析のためには、動物やガスクロマトグラフとの間でサンプルを移す際に、サンプルの汚染を避けることが重要です。これは、GCがサンプルを測定している間に指で記号をキャップすることで慎重に行うことができます。バッグからさらに0.8ミリリットルのガス混合物でマウスの肺を膨らませ、次にこのサンプルを最初のサンプルと同じように処理します。2 つの測定値の平均値を使用して、DFCO を計算します。Cの添え字はキャリブレーションガスを指し、9の添え字は動物から採取されたサンプルを指します。9秒の息止めの後。C 57 black six マウスから取得した名目制御 DFCO 値は約 0.77 です。PR 8インフルエンザモデルを用いた研究では、エラスターゼ装着後21日後の肺気腫モデルにおいて、6日目と8日目に進行性の機能喪失が見られた。DFCOは適度に減少しましたが、Blio Mycinのインストールによって誘発された線維症のモデルにははるかに大きな変化がありました。ブレオマイシンによって引き起こされる線維性経路は、病理学的モデルのいずれにおいても観察されたDFCOの最大の変化をもたらしました。拡散能力はヒトの線維症の信頼できるマーカーでもあるため、これは重要です。CFTR遺伝子は嚢胞性線維症において重要な役割を果たしており、この遺伝子を欠損したマウスの研究では、DFCOが有意に減少しました。DFCOは、これらのノックアウトマウスの真菌感染によりさらに減少しました。肺損傷に一般的に使用されるモデルは、LPSによって引き起こされます。LPSに曝露されたマウスでは、DFCO測定によって評価されたように、1日目から4日目までの肺機能の進行性の時間依存的な喪失があり、DFCOの測定は生後2週間齢のマウスで成功裏に行うことができます。肺のサイズが小さいほど、0.4ミリリットルの小さな膨張量が必要です。この小さな体積で測定されたDFCOは、肺が成熟するにつれて予想される増加を示すことができます。この技術は、他の肺機能の測定や評価を行う前に、マウスごとにわずか数分で行うことができます。この手順を試みるときは、膨張と収縮のステップを迅速に実行し、サンプルを移送する際に注意して汚染を防ぐことが重要です。

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生物学

SCIREQ株式会社、モントリオール、QC、現在のプロトコルでは、呼吸器系の力学の測定と同様に強制振動技術を使用してマウスで吸入メサコリンに対する気道反応性の評価（flexiVentを実行するために必要な手順の詳細なステップバイステップの説明を提供しています、カナダ）。...

強制振動法を用いたマウスにおける呼吸器系の力学の評価

このプロトコルの目標は、COPDのマウスモデルにおける慢性肺の病状を定量化する自動化された方法を提供することです。このプロトコルには、マウスをタバコの煙(CS)にさらすこと、肺機能の測定、肺を膨らませること、および形態測定法を使用してマウスの肺気腫と小さな気道リモデリングを測定することが含まれます。...

肺気腫とタバコ煙曝露マウスにおける末梢気道リモデリングの自動測定

ここでは、マウスの肺圧-体積曲線を簡単かつ確実に測定するためのプロトコルを提示し、それが2つの一般的な肺の病状、肺線維症と肺気腫の表現型実質変化を検出するのに十分な感度を持つことを示しています。この指標は、病状の進行に伴う肺の構造変化を定量化する手段を提供します。...

マウス肺における圧力 - 容積曲線の測定

本研究では、オゾンの高濃度にマウスを繰り返しさらすことによって新しい慢性閉塞性肺疾患 (COPD)...

繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

肥満の発生率が上昇していると慢性肺疾患のリスクを増加させます。根本的なメカニズムと予防戦略、明確に定義された動物を確立するには、モデルが必要です。ここでは、我々 は (ブドウ糖負荷試験、体の脈、肺固定) マウスにおける肺の成果に対する肥満の影響を研究する 3...

腹腔内のブドウ糖負荷試験、肥満や呼吸器アウトカムに対する代謝が異常の影響を研究する肺機能の測定や肺の固定

本稿の目的は、二重チャンバー容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能を評価するための推奨される手順の詳細な説明を提供するためにです。...

ダブル室容積脈波による意識下マウスにおける呼吸機能の評価

ここに提示される肺固定のための有用なプロトコルは、肺気腫のマウスモデルからの肺標本の組織学的評価のための安定した状態を作成する。このモデルの主な利点は肺の崩壊またはデフレなしで同じ一定した圧力の多くの肺を固定できることである。...

マウスにおける気腫の評価に対する一定圧力下での肺固定

ここでは、気管 を通じて 投与されたエアロゾル化されたブレオマイシンを用いてマウスの肺線維症をモデル化するプロトコルを紹介します。この最適化された方法は、手術的切開を行わずに均一で定量的かつ正確な投与を可能にし、ブレオマイシン誘発性線維症の再現性と信頼性を高めています。...

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卵巣癌の同所性動物モデルは、より良い人間の病気を複製し、従って、癌の進行と治療に対する腫瘍の反応の理解を高める。マウスモデルでは、ルシフェラーゼを発現する卵巣腫瘍細胞のintrabursal注射を受け取ります。治療は、経口胃管栄養法により投与される。腫瘍の成長はによって監視されています...

生体イメージングおよび卵巣癌の同所性マウスモデルにおける治療的処置の

次のプロトコルは、換気を分離し、右心室の後負荷に対する血流、気流、気道の変化や血管の変化の影響を定量化するために着実または拍動肺血管圧 -...

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学ぶマウスの肺拡散能測定法。ガスクロマトグラフを用いてネオンと一酸化炭素のガス交換を解析し、肺疾患モデルでの機能変化を評価します。簡便で再現性の高い手法は、ヒトとの比較研究にも応用可能です。

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