繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

この実験の全体的な目標は、マウスのオゾン曝露 O-E を介して慢性閉塞性肺疾患または C-O-P-D を誘発することです。この新しいOEモデルは、COPDの根底にあるメカニズムの特性評価に起こり、新薬のスクリーニングに使用できます。このOEモデルの主な利点は、COPD患者の病理学的プロセスを再現することです。

わずか6〜8週間で生成できます。私と一緒に手順を実演するのは、私たちのグループの研究員であるWeijaian Sangです。オゾンを発生させるには、発電機と小型の送風機を使用して、オゾンプローブを使用してボックス内のオゾン濃度を監視するために、ボックスの内側と外側に接続されたエアベントパイプを介してパースペックスボックスをシールします。

オゾン濃度が2.5ppmに達したら、マウスを箱に3時間入れます。7週目の終わりに、オゾン処理された動物を標準的なプロトコルに従ってマイクロコンピューター断層撮影法で画像化します。オゾンによる変化や肺疲労などの機能的能力をテストするには、まずトレッドミルでマウスを毎分10メートルの速度で温めます。

5分後、速度を毎分15メートルに10分間上げます。マウスが走れなくなるまで、30分ごとに毎分5メートルずつ速度を上げ続けます。各動物の合計走行距離と走行時間を、それぞれ疲労距離と疲労時間として記録します。

オゾンに曝露した動物の肺機能を測定するには、麻酔をかけたマウスをコンピュータ制御の人工呼吸器に接続された体内プレチスモグラフに入れます。圧力制御換気を使用して、麻酔をかけた動物に毎分150回の平均呼吸周波数を課し、定期的な呼吸パターンと各呼吸サイクルでの完全な呼気が得られるまで。次に、呼気の最初の 25 ミリ秒、50 ミリ秒、および 75 ミリ秒の強制呼気量を記録し、最適でない操作を拒否します。

終末麻酔後、直径 1 mm の気管内チューブを使用して、1 回の洗浄につき 1 ミリリットルの PBS で動物を 2 回洗浄します。遠心分離のために各動物から回収された洗浄液をプールし、液体窒素に上清を収集します。ペレットを新しいPPSに再懸濁してカウントし、マウスごとに2つのホルダーに顕微鏡スライド、フィルターカード、および漏斗を装備します。

再懸濁した細胞を約100〜125マイクロリットルの各漏斗に加えます。ホルダーを細胞遠心分離機にロードし、細胞をスライドに回転させます。次に、製造元の指示に従って細胞に適切な染色液を塗布し、400倍の倍率でマウスあたり200個の細胞を数えます。

心臓採血では、オゾンに曝露した動物から心臓穿刺により約500マイクロリットルの血液を採取します。そして、氷の上の1.5ミリリットルのチューブに血液を追加します。氷上で30分後、血液サンプルを遠心分離し、血清上清を新しいチューブに移して液体窒素で保存します。

サンプルは、標準的なプロトコルに従ってELISAによる血清サイトカイン発現レベルの評価のために後で解凍することができます。肺の形態測定解析では、心臓サンプリング後に最初のマウスを仰臥位に置きます。次に、胸腔を開き、板状筋と前気管筋を解剖して気管輪にアクセスします。

心臓と肺を分離せずに肺と気管を採取します。次に、PE90ポリエチレンチューブを使用して、気管内カテーテルを4%パワーホルムアルデヒドを含むシリンジに接続し、約200マイクロリットルのパラホルムアルデヒドで肺を完全に膨らませます。次に、肺を10ミリリットルの新鮮な4パーセントのパワーホルムアルデヒドが入った15ミリリットルのチューブに少なくとも4時間入れます。

マイクロコンピューター断層撮影法によって評価されるように、オゾンに曝露されたマウスは、周囲の空気に曝露された対照動物よりも有意に大きな総肺量と低減衰面積の割合を示します。肺気腫の表現型は、肺胞の肥大と平均線形切片の増加によっても証明されています。プレチスモグラフによる肺機能評価は、オゾン曝露マウスで減少するすべてのパラメーターが、慢性閉塞性肺疾患患者に観察される典型的な肺機能障害と一致していることを示しています。

さらに、オゾン曝露は、運動耐久試験における疲労時間と疲労距離を大幅に減少させます。オゾン処理された動物はまた、マクロファージや好中球などの炎症細胞の有意な増加、IL-10の有意な減少、IL-1ベータおよびTNFアルファの増加を示し、オゾン曝露モデルがヒトの慢性閉塞性肺疾患のような症状を再現することを示しています。この手順をC57 BR6マウスのような他のマウス株で使用してこのOEモデルを生成できます その開発後、この技術は、肺疾患の分野の研究者がCOPDの根本的なメカニズムを探求するための道を開きます。

パラホルムアルデヒドの取り扱いは危険な場合があり、この試薬を使用する際には、手袋、安全メガネの着用、ドラフト内の溶液の使用などの予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。