マウスにおける気腫の評価に対する一定圧力下での肺固定
2019年9月26日
ここに提示される肺固定のための有用なプロトコルは、肺気腫のマウスモデルからの肺標本の組織学的評価のための安定した状態を作成する。このモデルの主な利点は肺の崩壊またはデフレなしで同じ一定した圧力の多くの肺を固定できることである。
固定装置内の一定の圧力は、軽度のタバコの煙誘発肺気腫の評価に適した組織学的肺検体を生成する合理的に膨張した状態で肺を維持する。このモデルの主な利点は、肺の崩壊やデフレなしに同じ一定の圧力を使用して、同時に多くの肺を固定できることです。この手順を実演するのが、研究室の大学院生である荒野直子です。
反射運動に対する応答性の欠如を確認した後、マウスの内側線に沿って皮膚および筋肉組織を切開し、頭蓋領域を目指し、横方向に切断してより広い作業空間を作り出す。ダイヤフラム層を露出させた後、組織を鉗子で穿刺し、胸腔を開く。胸部領域を切り取り、肺と心臓を視覚化します。
左心房と右心室を切ります。灌流ポンプに接続された24ゲージカニューレを右心室領域に挿入し、肺動脈に到達するまでカニューレを頭蓋領域に向けます。次に、ポンプをオンにし、肺組織のすべてが白色に変わるまで1時間PBSの約200ミリリットルで組織を浸透させます。
灌流の終わりに気管、肺および心臓を取り巻く結合組織を切断し、右の主気管支を結ぶために縫合糸を使用する。次に、右肺の個々のローブをすべて収穫し、左肺の心臓とローブを適切な固定剤を含む個々の10ミリリットルの注射器に入れる。肺を膨らませて、注射器から肺を取り除くために、シリンジに真空を作り出すプランジャーを引き込みます。
気管に20ゲージカニューレを挿入し、縫合糸を使用してカニューレを所定の位置に固定します。固定剤で満たされた1ミリリットルのシリンジをカニューレに接続し、肺に追加の固定剤を充填して漏れをチェックします。固定中に肺の検体が肺板から外れないように、挿入部位が確保されていることを確認してください。
次に、組織を肺固定圧装置に移し、サンプルを取り除き、固定期間の終わりに結び目で気管を引き離します。肺サンプルが挿入される肺固定圧力装置の下部成分は、3方向のストップコックでホルマリンフローの先端に20ゲージカニューレを介して接続される。圧力は、下側と上の区画の間の固定剤の異なる表面レベルから生成されます。
圧力差は水の25センチメートルですが、高さ調整ノブは、水の25〜30センチメートルの間に圧力を調整するために使用することができます。ポンプは下側と上側の容器をつなぎ、固定面高さの25センチメートル差を保ち、薬剤の流れを導く。48時間固定後、周囲の空気にさらされたSMP30ノックアウトマウスからの肺は、著しい空域拡大を示さない。
しかし、慢性タバコの煙にさらされたSMP30ノックアウトマウスでは、有意な空域の拡大および歯槽壁破壊が観察される。さらに、肺検体の平均線形インターセプトおよび破壊指数は、空気暴露された動物よりも、露出したSMP30ノックアウトマウスの煙において有意に大きい。私たちの研究室は10%ホルマリンを使用していますが、研究者は実験ニーズに応じて他の固定剤を使用することができます。
我々は実証された固定システムを使用して報告したように肺のサンプルは形態評価のための様々なマウス肺気腫モデルから採取することができる。固定剤は危険な場合がありますので、常に適切な人の保護具を着用し、換気の良い部屋で作業します。
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概要
本プロトコールでは、肺気腫マウスモデルから得られた肺標本の組織学的評価において、安定した条件を確保するための肺固定法について概説します。この手法により、肺の虚脱や脱気を防ぎながら、複数の肺を同時に固定することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 生物学
- 組織学
背景
- 肺気腫は、多くの場合タバコの煙によって誘発される肺疾患です。
- 肺の病理を理解するためには、組織学的評価が不可欠です。
- 正確な評価を行うには、固定中に肺の膨張状態を維持することが重要です。
- 本プロトコルでは、肺固定技術における課題について解説します。
研究目的
- 肺固定のための信頼性の高い方法を提示すること。
- 研究における肺標本の評価を容易にすること。
- 肺気腫モデルの組織学的解析における一貫性を向上させること。
使用方法
- 一定の圧力を維持する固定装置の使用。
- 胸腔に到達するための、マウス正中線に沿った切開。
- 横隔膜を穿刺し、胸腔を開放する。
- 検体採取のための、肺および心臓の視認。
主な結果
- 固定中の肺の膨張状態を適切に維持すること。
- 複数の肺を同時に固定できること。
- 評価に適した安定した組織標本を得ること。
- 大学院生による手順の実演。
結論
- このプロトコルは、肺固定のための信頼性の高い方法を提供します。
- これにより、研究における組織学的評価の質が向上します。
- この手法は、肺病理に関わるさまざまな研究に適用可能です。
よくある質問
業界における重要性
一定の圧力下で肺を均一に固定することは、マウスにおける肺気腫の再現性のある組織学的評価を可能にし、前臨床の呼吸器疾患モデルにおける重要な課題を解決します。この手法は信頼性の高い形態計測分析をサポートし、ばらつきを抑えることで、COPD研究における早期段階の標的妥当性確認における予測の信頼性を高めます。複数の検体を同時に処理できる能力により、比較研究が効率化され、堅牢なポートフォリオの選別（トリアージ）決定がサポートされます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- マウスモデルにおける肺気腫の重症度の標準化された形態計測学的評価を可能にします。
- 再現性のある組織構造を提供することで、候補ターゲットの機能的な検証をサポートします。
- 固定によるアーチファクトを最小限に抑えることで、生物学的なリスク低減を促進します。
- 組織学的エンドポイントを機序的な仮説に結びつける際の予測的な信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 下流の定量的な組織学的解析に向けて、検証済みの肺標本を調製します。
- 実験群間における再現性と比較可能性を確保します。
- 同一条件下での複数サンプルのスケーラブルな処理を可能にします。
- スクリーニングキャンペーンにおいて、化合物の肺構造への影響を信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 前臨床肺病理モデルを、トランスレーショナル研究における疾患関連エンドポイントに適合させます。
- 組織標本作製を標準化することで、創薬から前臨床検証までの一貫性を維持します。
- バイオマーカーや有効性評価を妨げる可能性のある、アーティファクトによる所見のリスクを低減します。
- 堅牢な組織学的データに基づき、リスクを調整した開発推進上の意思決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この定圧固定法は、初期の探索および前臨床検証のプロセスに組み込まれ、呼吸器疾患モデルにおけるターゲットバリデーションとリード化合物の同定の両方を支援します。
- 探索生物学：肺気腫モデルにおける仮説検証およびパスウェイ解析のための、信頼性の高い組織構造を提供します。
- スクリーニング：化合物評価のための、再現性のある定量的な組織学的アウトプットを提供します。
- 解析：比較解析のための、平均線状切断距離（mean linear intercept）や破壊指数（destructive index）などの形態計測を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：関連する場合、前臨床所見と臨床的な肺気腫病理との整合性をサポートします。
- 企業での再利用：さまざまなマウス肺疾患モデルに適用可能な、標準化された固定能力を提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：固定のばらつきを最小限に抑えることで、予測の信頼性とターゲットバリデーションを向上させます。
- 運用上の価値：複数の検体を同時に固定することを可能にし、スループットと標準化を高めます。
- 戦略的価値：強固な組織学的エンドポイントをサポートすることで、go/no-go判断の質と資本効率を改善します。
- ポートフォリオへの影響：信頼性の高い組織データに基づき、呼吸器疾患プログラムのリスク調整済み優先順位付けを促進します。
実施上の検討事項
- マウスの手術操作および肺組織の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 一定の圧力を維持できる特殊な固定装置が必要です。
- 再現性を確保するため、チームをまたいだ固定パラメータの標準化が求められます。
- 実験要件に応じて、異なる固定液に適応可能です。
- 有害な固定剤を取り扱うための安全プロトコルを遵守しなければなりません。
