ヒトとマウスにおける脳室周囲の組織の側脳室および組織学的特性の3次元モデリング

次の手順の全体的な目標は、心室magalyの原因と結果の調査を可能にする手段を提供し、脳内の心室系の健康とその重要なバリアおよびろ過機能の研究を可能にする技術を強調することです。これは、マウス脳の冠状切片またはヒト脳のMRIスキャンのいずれかを収集して心室の3D再構成を生成し、心室の容積を計算することによって達成されます。第2ステップとして、心室の頂端表面のエンフォス調製物を含む死後組織を細胞特異的抗体で染色して、心室内層の細胞の完全性を明らかにします。次に、心室表面全体の細胞組織のモンタージュを準備し、心室の3Dモデル上にレンダリングして、神経膠症の領域と無傷の付属細胞の領域を示します。

結果は、心室の縦断的3Dモデリングに基づく心室拡張の領域と、心室内層の付加熱細胞層がもはや無傷ではなく、グリア瘢痕に置き換えられている領域を示しています。3Dモデリングデータと免疫組織化学データを組み合わせることで、心室内層の細胞組成の3D領域特異的マップを生成できます。この技術の意味するところは、脳損傷、アルツハイマー病などの神経変性疾患、正常な老化の治療や診断にまで及び、これらはすべて通常、ある程度の脳室拡大を示し、それによって心室表面脊柱側弯症の可能性が高いです。

マウスでの手順のデモンストレーションは、リチャード・ウォルファーと私たちの研究室の学部生が人間のMRIデータを使用して実行し、死後のヒト組織をyeunによってデモンストレーションします。現在、医学生で、研究室の大学院生であるレベッカ・チュー。プロトコールの書かれた部分に概説されているように、切片を固定し、免疫染色を行い、マウスの脳をマウントすることにより、イメージングするスライドを準備します 手順を開始するには、マウスの側脳室を追跡するために、直立蛍光顕微鏡とコンピュータの電源を入れ、顕微鏡には自動ステージとデジタルCCDカメラを装備する必要があります。

マッピングソフトウェアを蛍光モードで起動し、表示オプションを開いて、トレースに必要なツールバーとドッキングプールパネルをロードします。次に、オプションをクリックし、オプションアクセサリを表示し、同じメニューのメインツールバーとマーカーツールバーを選択します。ドッキングプールパネルで、カメラヒストグラム、マルチチャンネルコントロール、カメラ設定、画像取得を選択します。

付加細胞を標識する強力な S 100 ベータ蛍光に基づいて、側脳室を含む最初の組織片を特定します。側脳室の内側を覆います。セクショニング中に行われた小さな切開部を特定することにより、左右の半球を向きます。

次に、新しいデータファイルを作成し、左側脳室の上にある画像ウィンドウをクリックして、ステージ移動の基準点を指定します。この参照点は、トレース ファイル全体の側脳室に対して一貫した位置に保ちます。シリアル再構築のためにコンターをインポートする際に役立つように、コンタードロップダウンメニューから適切なプリセットコンタータイプを選択します。

左右の側心室のトレースごとに一意の色を使用します。次に、アペンドライニングの頂端面全体をクリックして、心室の輪郭をトレースします。矢印キーを使用してトレースウィンドウを移動します。

輪郭をトレースした後、右クリックして[輪郭を閉じる]を選択します。別の色を使用して右心室のトレースを繰り返します。次に、左側のマーカーツールバーから適切なマーカーを選択し、トレース画面の正中線に沿ってマーカーをクリックしてドロップし、3D再構築のシリアルコンターの位置合わせを支援します。

この手順を繰り返して、2 番目のマークを付けます。[ファイル]、[データファイルとして保存]を選択して組織トレースを保存し、新しいフォルダとファイル名を作成し、シリアルセクションからのトレースを簡単に識別できるように、規則に従ってトレースに番号を付けます。次に、心室を含むすべての切片について、先ほど示した手順を繰り返します。

側脳室の3D再建を行う。3D再構築プログラムを開きます。次に、ファイル「開く」をクリックし、最初のトレースシリアルセクションのコンターファイルを選択します。

左心室と右心室のすべての輪郭トレースと、追加されたマーカーをインポートします。プロトコルの書かれた部分の指示に従って輪郭を合わせます。次に、左側のパネルですべての輪郭を選択し、[3D視覚化]ボタンをクリックして、最終的な3D再構築を表示します。

この画像は、S 100β免疫反応性付加細胞によって輪郭が描かれた側脳室を含む冠状マウス脳部分を示しています。アスタリスクは側脳室を示します。ブラケットは接着力を示し、スケールバーは500ミクロンを表します。

マウスの側脳室は輪郭として追跡され、サブセグメントセクションとして配置されます。脳室内の領域は、体積分析の干渉から排除されます。この画像は、側脳室の輪郭の最終的な3D再構成を示しています。

黄色は、側脳室を含む関心領域にまたがる全脳の体積の輪郭を表しています。コロナスライス脳組織の3D心室再構成を作成する方法をよく理解している必要があります プロトコルは、側脳室の3D画像再構成と体積定量化を作成し、縦方向のオーバーレイ分析を使用して経時的な体積変化を評価するためにリストされていますが、MRの一貫性に注意することが重要です。Rデータ収集と取得後処理は、データセットを含めるための非常に重要な基準です 心室セグメンテーションを実行するために、ITK SNAPを使用して、高解像度のT one重み付きMR画像から心室をセグメント化します。プログラムを起動した後、グレースケール画像を開き、目的のファイルを選択して、気の利いたファイルとして開きます。

次に、各解剖学的平面をスクロールして、鼻の領域、大小の側頭角などの心室の異常に注意してください。次に、メインツールボックスで、スネーク、ROIツールをクリックします。次に、3Dをセグメント化し、強度領域オプションを選択します。

次に、前処理画像をクリックして、上記を選択します。スライドバーを使用して最大強度を記録します。次に、しきい値を最大強度の 15% に設定し、この値を記録します。

これにより、ROI が白で強調表示されます。smoothness パラメータを 10 に設定します。[OK]をクリックします。

では次に。次に、各心室に10〜12個の小さなサイズの2つの泡を追加します。前頭角に2つ、側心室体の上面に沿って等間隔に7つ、後頭角に1つ、側脳室の側頭角に1つ。

次に、パラメータを選択し、曲率力を0.4に設定します。次に、再生記号をクリックして、アクティブな輪郭の展開を開始します。次に、[メッシュの更新]をクリックしてサーフェスを視覚化します。

次に、自動更新を確認します。側脳室のすべての領域が関心領域に含まれている場合は、セグメンテーションプロセスを停止します。第三脳室を含めることは避けてください。

最後に、[完了]をクリックして、セグメンテーション結果を気の利いたファイル形式で保存します。総心室容積を取得するには、セグメンテーション、容積、統計を選択し、設定されたカラーラベルを使用して心室の総容積を取得します。このセグメントでは、Mangoソフトウェアを使用して縦方向のROIを重ね合わせ、被験者内の心室容積の経時変化を定性的および定量的に示します。

ソフトウェアを開いた後、[開く]をクリックしてファイルを開く前に保存した気の利いたファイルをロードします。画像ファイルが読み込まれたら、[ファイル] [ROI の読み込み] をクリックし、ベースライン ROI の時点の ROI を緑色で読み込みます。[ファイル] [ROI の読み込み] をクリックし、2 番目の ROI 時点を赤で読み込みます。

ファイル、保存ROIを選択して縦方向のオーバーレイを保存し、画面に表示されている規則に従って各画像にファイル名を割り当てます。次に、ITKスナップを開きます。次に、画像結合ROIファイルからセグメンテーション負荷を選択して縦方向のボリュームデータを取得し、結合されたROIをグレースケールの画像負荷結合ROIとして再度開き、次のセグメンテーションボリュームと統計を実行します。

ラベル 1 赤は拡張ボリュームに等しい ラベル 2 緑は狭窄ボリュームに等しい ラベル 3 青はベースボリュームに等しく、無傷の半球から始まり、最大 6 週間 10% ホルミンで固定され、0.1 モルの PBS スライス、厚さ 1.5 センチメートルの冠状切片で全身をマイクロサージカルメスを使用した大型ナイフを使用して半球全体に完全にすすいでください。心室壁を1cmの深さで解剖し、側壁全体に対して1つの連続したセクションを維持し、必要に応じて壁を細分化して、染色に適したサイズのセクションを作成します。心室壁の反対側のセクションにしっかりと切り込みを入れます。

優れた劣方方位を特定するには、免疫組織化学を行い、書かれたプロトコルに従って切片をマウントします。解剖スコープの下で、顕微手術用スタブナイフでピンを使用して組織を固定し、側脳室壁の均一な薄い部分を作成し、スライド上にペネムを脇に取り付けますスライドが完全に乾いたら、免疫蛍光共焦点顕微鏡で切片を検査します。心尖付着のマーカーであるβ-カテニンの使用によって決定されるように、心室表面にイメージング焦点面を設定します。

付加細胞の結合タンパク質。次に、心室表面でのGFAP染色に従って、追加細胞の被覆範囲と表面の星状膠症の領域を描き、心室表面全体を文書化してモンタージュします。サーフェス全体の重なり合う画像を使用して、シリアル画像のモンタージュを作成します。

Adobe Photoshopを開き、ファイル自動化自動出現インタラクティブレイアウトを使用してオーバーレイする画像を選択し、必要に応じて手動で調整します。モンタージュをトレースする新しいレイヤーを作成して、そのままの漫画表現を生成します。細胞被覆率または心室表面G脊柱側弯症に応じて、すべてのセクションをまとめて心室壁のマップを再構築し、MRI再構成の対応する領域にリンクします。

これが人間のMR画像の組み立てです。側脳室は、赤の関心領域として定義されています。ここに示すように、3D画像再構成により、側脳室の体積定量化と定性的な視覚化が可能になります。

この画像は、高齢患者の縦方向の心室拡張の評価を示しています。複数のポイントからの縦方向のMRIを整列および重ね合わせて、被験者内の心室容積の経時的な拡大を視覚化および定量化できます。これらの最後の3つの画像は、ヒト側脳室表面の免疫組織化学的評価と局所マッピングを示しています。ここは。

βカチンと染色で輪郭が描かれた無傷の付加細胞の領域は、アスタリスクで示されるように丸石の外観を示し、GFAP染色によって輪郭が描かれた心室表面のアストログリオーシスの領域から点線で区切られています。シリアル共焦点画像を重ね合わせて地域モンタージュを生成し、Adobe Photoshopまたは心室表面の細胞組織の漫画表現を使用してトレースします。このモンタージュの漫画画像は、対応する MRI ベースの 3D 心室再建で心室表面にマッピングされます。

図のように、緑色は無傷の付属物を示し、赤色は神経膠症の領域を示します。この手順を実行する際には、細胞の完全性の連続的な再構築とマッピングを実行するために、各組織サンプルの慎重な文書化を維持することが重要です。この手順に続いて、側脳室のサブセグメンテーションなどの他の方法を実行して、時間の経過に伴う領域固有の拡張に関する追加の質問に答えることができます。