準備、イメージング、および細菌表面運動性アッセイの定量化
April 7th, 2015
群れの運動性は、物理的および環境的要因の影響を受けます。ここでは、スウォームアッセイの調製とデータ収集に一般的に関連する課題を回避するための2段階のプロトコルとガイドラインについて説明します。巨視的なイメージング技術を使用して、現在の分析技術では提供されない群れの行動に関する詳細な情報を取得します。
この手順の全体的な目標は、スウォームと呼ばれる細菌表面の運動性を標準的かつ再現性のある方法で視覚化および定量化することです。これは、最初に表面の運動性プレートを準備し、硬化させることによって達成されます。第2のステップは、表面運動性アッセイプレートに細菌を接種し、これらのプレートを制御した環境でインキュベートすることです。
次に、プレートアッセイ上の細菌増殖パターンがリアルタイムで画像化されます。手順の最後のステップは、定量化のために画像を処理することです。最終的に、この手順は、表面モーダル細菌の群拡大率やバイオ製品密度分布などの定量的動的情報を生成するための表面運動性プレートアッセイ調製のための標準化されたプロトコルを提供します。
多くのグループが表面運動性アッセイを行っています。この手法の主な利点は、不整合につながる可能性のある複数の変数を最小限に抑える体系的なプロトコルを提供することです。この方法は、細菌がさまざまな種類の表面にどのようにコロニーを形成するかなど、細菌表面の運動性の分野で重要な質問に答えるのに役立ちます。
この方法は、いくつかの変更を加えることでシュードモナス菌の群れ運動性に関する洞察を得ることができますが、他の表面モーダル細菌の研究にも適用できます。一般に、このメソッドに不慣れな人は、プロトコールやラボ環境の小さな変更がスウォームアッセイの結果に大きな影響を与える可能性があるため、苦労するでしょう。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるモーガンです。
プロトコルを開始するには、200ミリリットルのFABから硫酸アンモニウム群培地を差し引いたもの、0.9グラムの貴寒天、および0.2グラムのカイノ酸を500ミリリットルの培地ボトルに組み合わせてアグリミックスを調製します。攪拌機を使用して、メディアを完全に混合します。次に、121.1°Cに設定されたオートクレーブで培地を22分間滅菌し、高速ベントオプションを使用します。
滅菌後すぐに、水分の蒸発を防ぐためにメディアボトルのキャップを締めてください。メディアを磁気攪拌板に置き、アクティブ攪拌を行いながら周囲温度環境でAEDを摂氏50度に冷却します。寒天を後の実験時間で使用する場合は、摂氏60度の水浴またはインキュベーターで15時間、積極的に攪拌せずに保温できます。
培地が2ミリリットルのフィルター滅菌グルコースで摂氏約50度に達すると、標準的な滅菌技術を使用して、磁気攪拌棒と完全に混合し、培地内の気泡形成を防ぎます。フードの中で、滅菌血清ピペットを使用して、7.5ミリリットルのエディアを個々の60ミリメートルのペトリ皿に分注します。より大きな群れの表面積が必要な場合は、25リットルのエディアを100ミリメートルのペトリ皿に分注します。
すべての皿を積み重ねず、ブルズアイレベルでフードをチェックして、寒天が固まるための均一な水平面を確保します。60ミリメートルプレートの場合は、皿の蓋を脇に置き、フード内の覆われていない寒天を30分間硬化させます。100mmの大型皿は、硬化時間が長くなります。
特定の実験室の湿度、気流、および温度により、細菌の最適な群れを得るために硬化時間のテストが必要になる場合があります。乾燥後、APLには、目的の増殖段階まで別々に事前に増殖させた細胞を直ちに接種する必要があります。まず、新鮮なLBプレートから単離された細菌コロニーを選び、6ミリリットルの培養物に接種します。メディア。
培養物を37°Cで一晩インキュベートし、水平に振とうします。翌日、乾燥した群寒天プレートに1〜5マイクロリットルの一晩培養物を滅菌爪楊枝またはワイヤー接種針で寒天表面を突いて接種し、細菌株に応じて、群分析プレートを摂氏30度、摂氏37度のいずれかに設定された温度のインキュベーターに移します。 または摂氏42度。過剰な水分が寒天ではなくプレートの蓋に凝縮するようにプレートを反転させ、タイムラプスイメージングの直前に2〜4時間、菌株固有の温度で細菌を平衡化します。
次に、プレートをin vivoイメージングユニットに移し、農業表面の細菌がユニットの倒立カメラに向けて下を向くようにします。すべてのペトリ皿の蓋に少量の水を入れます。次に、各蓋を水面を上にして、逆さまのAERプレートの上に置きます。
イメージングユニット内で、イメージングエンクロージャを密閉して一定の湿度レベルを維持し、イメージングユニットのイメージング設定を調整し、群れ活動のタイムラプスイメージングを開始します。リアルタイムイメージング後、表面運動実験におけるImage Jなどの標準的な画像解析を用いて、細菌の群れ動態を解析することができます。接種直前の寒天の水分含有量を評価することは、群れ形成を成功させるために重要です。
最適なのは、AERプレートはタイトな接種スポットを促進し、細菌の群れ活動を強化しますが、過度に乾燥したプレートは水分含有量に加えて表面の運動性を抑制し、培地添加剤の有無も、細菌株を利用して発光または蛍光タンパク質を発現することにより、インキュベーション温度の関数として細菌の群れ活動に影響を与える可能性があります。2つの異なる細菌種間の群れ競争のダイナミクスをタイムラプスビデオで捉えることができます。さらに、細菌群内の局所細胞密度の変化や移動性促進脂質の生合成速度も、タイムラプス蛍光顕微鏡で確認し、定量することができます。
この手順に従います。共焦点顕微鏡などの他の方法を使用して、個々の細胞の挙動に関する質問に答え、細菌表面の運動性の詳細な顕微鏡的および顕微鏡的分析を生成することができます。このビデオを見れば、表面運動性アッセイを調製、硬化、接種し、その結果を細菌増殖パターンで処理および分析することにより、標準的で再現性のある群れアッセイを実施し、細菌表面運動性の包括的な分析を得る方法について十分に理解できるはずです。
概要
この記事は、細菌の群集運動性の可視化と定量化のための標準化されたプロトコルを提示します。群集アッセイの準備とデータ収集における一般的な課題に対処し、詳細な分析のために宏観的イメージング技術を活用しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 細菌の運動性
- イメージング技術
背景
- 群集運動性は様々な物理的および環境要因に影響されます。
- 実験の再現性には標準化されたプロトコルが不可欠です。
- 現在の分析技術では群集行動への詳細な洞察が欠けている可能性があります。
- 表面上の細菌のコロナイゼーションを理解することは様々な応用にとって重要です。
研究の目的
- 表面運動性アッセイのための系統的なプロトコルを提供すること。
- 一貫性のない結果につながる変数を最小限に抑えること。
- 群集拡大率とバイオ製品密度に関する定量データを生成すること。
使用された方法
- 特定の培地を使用した表面運動性プレートの準備。
- 細菌によるプレートの接種と制御された培養。
- 細菌の成長パターンのリアルタイムイメージング。
- 群集動態の定量化のためのイメージ処理。
主要な結果
- 細菌の表面運動性を評価するための再現可能な方法を実証しました。
- 群集行動に影響を与える主要な要因（例：水分含有量）を特定しました。
- 細菌の競合の動態に関する洞察を提供しました。
- タイムラプスイメージングを使用して細菌の行動の詳細な分析を可能にしました。
結論
- 標準化されたプロトコルは群集アッセイの信頼性を向上させます。
- 様々な細菌株と条件に適応させることができます。
- この方法は細菌の運動性とコロナイゼーションの理解を深めることにつながります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Bacterial surface motility assays face reproducibility challenges due to sensitivity to agar concentration, moisture content, and environmental variables, complicating target validation in antimicrobial discovery. This protocol standardizes swarm assay preparation and quantification, enabling reliable phenotypic screening and mechanistic de-risking of motility-related targets. By providing quantitative dynamic outputs such as swarm expansion rate and bio-product density, it supports predictive confidence in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to bacterial colonization and surface adherence mechanisms.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating motility as a phenotypic readout for target validation.
- Predictive Value: Supports portfolio triage through quantitative assessment of swarm dynamics under varying genetic or chemical perturbations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by ensuring reproducible swarm phenotypes.
- Operational Value: Standardizes agar preparation, inoculation, and imaging conditions to minimize inter-assay variability.
- Scalability: Supports time-lapse imaging and quantification workflows compatible with high-content screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro motility observations to preclinical models of biofilm formation and host colonization.
- Biomarker Alignment: Enables tracking of fluorescent or luminescent reporters to correlate motility with virulence factor expression.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides quantitative thresholds for go/no-go decisions in anti-virulence target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, particularly for anti-infective programs targeting virulence or colonization factors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting surface motility as a virulence-associated trait.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized media preparation and environmental controls for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dynamic readouts such as radial expansion rate and fluorescence intensity distribution for comparative analysis.
- Translational Research: Links motility phenotypes to preclinical relevance in persistent infection and colonization models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and quantification platform for multiple bacterial strains and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing false negatives from assay irreproducibility in motility-based screens.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across laboratories through defined curing, inoculation, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets involved in surface adherence and biofilm initiation.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on motility inhibition efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques and sterile media preparation.
- Dependent on controlled environmental conditions (humidity, temperature, airflow) for optimal agar solidification.
- Necessitates standardization of inoculation volume and incubation timing across users and sites.
- Requires adaptation of agar concentration (0.4%-0.8% wt/vol) based on bacterial strain swarming sensitivity.
- Limited by the need for time-lapse imaging infrastructure and image analysis proficiency (e.g., ImageJ) for quantification.
