Name: 呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: 学ぼう、TTC半固体寒天法による細菌運動性の可視化手法。Staphylococcus aureusやEscherichia coliなどの病原菌の運動性を簡便に評価し、病原因子の研究に活用できます。

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この研究は、江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)および中国薬科大学の教育改革研究プロジェクト(2019XJYB18)の支援を受けました。

1.半固体培地の調製
<ol><li>従来の半固体寒天
	<ol><li>基本成分11を使用して、細菌運動性試験培地レシピに従って伝統的な半固体寒天を調製する。トリプトース10 g、NaCl15 g、寒天4 gを十分な蒸留水に溶解し、pHを7.2±0.2に調整し、最終容量を1,000 mLにします。</li>
		<li>寒天を121°Cで20分間オートクレーブし、高さ3cmの半固体培地として10mLの試験管に分注します。</li>
	</ol></li>
	<li>TTCを含む従来の半固体寒天
	<ol><li>従来の半固体培地をオートクレーブした後、50°Cに冷却し、100mLの培地に5mLの滅菌1%TTC溶液を加えて混合し、10mLの試験管に分注して高さ3cmの半固体培地を形成します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.細菌株
注:水生環境から80株を分離し、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ属菌、ビブリオ属菌、肺炎桿菌、およびアエロモナス親水性菌を含む自動細菌識別装置(資料表を参照)を使用して同定しました(表1)。黄色ブドウ球菌(材料の表を参照)は、負の非運動性対照として使用されました。大腸菌、緑膿菌、およびネズミチフス菌(材料表参照)をポジティブコントロール株として使用しました。
<ol><li>運動性分析に使用する試験細菌株を特定します。</li>
	<li>負の非運動性対照および運動性陽性対照株を含める。</li>
</ol>3. TTC増強細菌運動性観察
<ol><li>寒天プレートから被験菌の単一コロニーを選び、接種針を用いた穿刺により、上記の2つの半固体培地(ステップ1.1.2および1.2.1)に接種します。</li>
	<li>チューブをインキュベーター内で37°Cで24〜48時間培養し、結果を観察した。</li>
	<li>成長状態を観察する:穿刺線だけが赤の場合は、細菌を非運動性(-)として特徴付けます。赤色が穿刺線12に沿ってわずかに外側に広がる場合、細菌を運動性(+)として特徴付ける。</li>
</ol>4. 寒天濃度の違いが細菌の運動に及ぼす影響
<ol><li>0.3%、0.5%、0.8%の寒天を含む半固体培地を調製し、上記のように穿刺して接種する。インキュベーションの24-48時間後に結果を観察してください。</li>
</ol>

<ol><li>Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).</li>
<li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).</li>
<li>Ding, S. S., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+flagella-dependent+motility+and+biofilm+in+bacteria+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Microbiologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review.</a> Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).</li>
<li>Zeng, J., Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+mechanism+of+bacterial+resistance+and+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Antibiotics%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance.</a> Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).</li>
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<li>Chouhan, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+site-directed+mutagenesis+at+the+GGEEF+domain+of+the+biofilm+forming+GGEEF+protein+from+Vibrio+cholerae%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae.</a> AMB Express. 6 (1), 2(2016).</li>
<li>McLaughlin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+colorimetric+microplate+test+of+phage+lysis+in+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica.</a> Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).</li>
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<li>Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explore+the+influencing+factors+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Care+Today%22%5BJournal%5D)">Explore the influencing factors of bacterial motility.</a> Health Care Today. 6, 50-51 (2018).</li>
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<li>Kühn, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+arrangement+of+several+flagellins+within+bacterial+flagella+improves+motility+in+different+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments.</a> Nature Communication. 9 (1), 5369(2018).</li>
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<li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity%2C+bacterial+cell+size+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798(2013).</li>
</ol>

著者は開示する利益相反を持っていません。

半固体培地法による細菌の運動性の検出は、多くの要因の影響を受けます13,14。酸素(寒天表面での好気性、半固体培地を含むチューブの底部での非好気性)、pH、温度などの細菌増殖条件は、細菌のべん毛の生存率に影響を与える可能性があり、運動性の低下または運動性の喪失につながる可能性があります15。さらに、それらの運動性としてのいくつかの粘液型細菌は、ポドコンジュゲートの産生によって影響を受ける可能性がある。
半固体培地へのTTCの添加は、運動性の観察に役立つ。原動力を持つ発酵細菌は、インキュベーション後に穿刺線に沿ってあらゆる方向に成長する可能性があります。したがって、穿刺線の周りの媒体は赤くなります。原動力を有する非発酵性細菌は、培地下部の酸素含有量が低い。したがって、これらの細菌は増殖が乏しいため、培地の上層のみが赤くなります。原動力のない細菌は接種ライン上でしか増殖できず、穿刺ラインのみが赤く見えます。 
<p...

細菌の運動性は、細菌の病原性、バイオフィルム形成、および薬剤耐性において重要な役割を果たします1。細菌の運動性は病原性と密接に関連しており、宿主細胞の早期感染中の細菌のコロニー形成に必要です2。バイオフィルムの形成は細菌の運動性と密接に関連しており、細菌は運動性を介して固体培地の表面に付着します。細菌の運動性は、バイオフィルム形成と正の相関があると長い間考えられてきました。バイオフィルムによる高度の細菌薬剤耐性は、人間の健康を脅かす持続感染につながる可能性があります3,4,5。したがって、細菌の運動性を検出することが重要です。細菌の運動性試験は、主に生きている状態にあるさまざまな形態の細菌の運動性を調べるために使用され、べん毛の有無を間接的に決定できるため、細菌の同定に重要な役割を果たします。
細菌の運動性を検出するための直接的および間接的な方法があります6。べん毛を有する細菌は運動性を示すため、べん毛の有無を検出することで間接的に細菌が運動性であるかどうかを検出することができる。例えば、細菌が運動性であることを示すために電子顕微鏡観察およびべん毛染色によって間接的に運動性を検出することができる。また、懸濁液落下法や半固体穿刺法などの直接法による検出も可能です。 
細菌の運動性を検出するために学部微生物学研究室で一般的に使用される半固体穿刺法は、細菌の増殖の方向に応じて、0.4〜0.8%寒天を含む半固体寒天培地の穿刺に細菌を接種します。細菌が穿刺線に沿って増殖して周囲に広がると、雲のような(ブラシのような)成長痕跡が現れ、べん毛の存在、したがって運動性を示します。穿刺線の成長痕跡がない場合、細菌は鞭毛も運動性もありません。 
しかしながら、この方法はその欠点を有する:細菌は無色透明であり、べん毛活性は生きている細菌の生理学的特性および他の要因、ならびに寒天の濃度および試験管の小径によって影響を受ける。さらに、好気性細菌は寒天表面での増殖にのみ適しており、細菌の運動性の観察に影響を与えます。したがって、この実験を改善するために、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)(無色)を培地に添加して、TTC 7,8,9,10の赤色生成物の形成を触媒する細胞内デヒドロゲナーゼを使用する現在の直接穿刺法よりも、細菌の運動性を決定するより信頼性が高く直感的な方法を確立しました。

<table><tbody><tr><td>バクト寒天</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>緑膿菌</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>サルモネラチフス菌</EM</td><td>>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>ポジティブコントロール</td></tr><tr><td>黄色ブドウ球菌</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>ネガティブ非運動制御</td></tr><tr><td>トリプトース</td><td>&nbsp;OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 自動微生物同定システム</td><td>Bio M&eacute;リュー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

細菌の運動性は、細菌の病原性、バイオフィルム形成、および薬剤耐性にとって非常に重要です。細菌の運動性は、多くの病原性種の侵入および/または拡散にとって非常に重要です。したがって、細菌の運動性を検出することが重要です。酸素、pH、温度などの細菌の増殖条件は、細菌の増殖と細菌べん毛の発現に影響を与える可能性があります。これは、運動性の低下または運動性の喪失につながり、細菌の運動性の不正確な評価をもたらす可能性があります。生細菌の細胞内デヒドロゲナーゼによる2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)の呈色反応に基づいて、TTCを細菌の運動性検出のために従来の半固体寒天に添加しました。その結果、このTTC半固体寒天法は、細菌の運動性を検出するための簡便で操作が容易であり、大型で高価な機器を必要としないことが示されました。結果はまた、0.3%寒天で調製された半固体培地で最も高い運動が観察されることを示した。従来の半固体培地と比較して、結果は評価が容易で正確です。

運動性検出のために標準株と単離株の両方を比較し、結果を表1に示した。べん毛がないため、黄色ブドウ球菌と肺炎桿菌は、従来の培地とTTC半固体培地の両方で接種された線に沿ってのみ成長しました。一方,緑膿菌,大腸菌,ネズミチフス菌はTTC半固体培地で24時間培養した後,接種ライン付近で全方向に増殖を示した。これは、48時間培養後にさらに明らかになりました(図1)。従来の半固体培地では細菌が四方八方に増殖したが、接種ラインの外側の細菌数が少ないため、TTC培地よりも可視化がはるかに困難であった。
<img alt="試験管内の色変化による酸化還元反応実験を行い、化学プロセス観察を紹介します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63706/63706fig01.jpg" data-altupdated...

ここでは、呈色反応に基づいて細菌の運動性を検出するためのプロトコルを提示します。この方法の主な利点は、評価が容易で精度が高く、特殊な機器を必要としないことです。

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

病原性には運動性が重要であるため、細菌の運動性の検出は重要です。ここで説明するプロトコルは、TTCと生菌の細胞内デヒドロゲナーゼとの色反応に基づいているため、細菌の運動性を検出するための信頼性の高い方法です。細菌の運動性を検出するためのTTC半固体寒天法は、シンプルで操作が簡単で、大型で高価な器具を必要としません。この方法は、臨床微生物学者や研究者が病原菌を調査するために使用できます。この手順を実演するのは、私の研究室の上級実験家であるXiyi Zhuangです。まず、10グラムのトリプトース、15グラムの塩化ナトリウム、4グラムの寒天を適切な量の蒸留水に加えて、従来の半固体培地を準備します。pH を 7.2 に調整し、最終容量を 1 、 000 ミリリットルにします。培地を摂氏121度で20分間オートクレーブし、培地を10ミリリットルの試験管に3cmの高さまで分注します。TTC培地を調製するには、オートクレーブ処理した従来の培地を摂氏50度に冷却し、100ミリリットルの培地に5ミリリットルの滅菌1%TTC溶液を加えます。培地を10ミリリットルの試験管に3cmの高さまで混合して分注します。寒天プレートから細菌の単一コロニーを採取し、接種針を使用して穿刺することにより、それらを両方の半固体培地に接種します。非モーダル株をネガティブコントロールとして、モーダル株をポジティブコントロールとして含めることを忘れないでください。寒天濃度が細菌の運動性に及ぼす影響を観察するには、さまざまな寒天濃度を含む半固体培地を調製し、穿刺して接種します。チューブを摂氏37度でインキュベートし、インキュベーションの24〜48時間後に結果を観察します。穿刺線のみが赤い場合は、細菌を非モーダルとして特徴付けます。赤色が穿刺線に沿って外側に広がる場合は、細菌をモーダルとして特徴付けます。細菌の運動性を、従来の半固体培地とTTC半固体培地上のさまざまな菌株で比較し、この表にまとめました。TTC半固体培地で24時間培養した後、黄色ブドウ球菌は接種線に沿って成長を示しました。一方、大腸菌は、接種線の周りのすべての方向に成長を示しました。大腸菌の最も高い運動性は、培地がほぼ完全に赤に変わった0.3%寒天で調製されたTTC半固体培地で観察されました。これに対し、0.5%寒天では赤色拡散の面積が減少し、寒天濃度が0.8%に増加するにつれて拡散が延長されたため、針を用いて接種する前にpHを7.2に調整し、オートクレーブ培地を50°Cまで冷却することが重要である。細菌は、TTCを含む半固体培地に穿刺して接種する必要があります。これは、細菌の運動性を検出するための直接的な方法です。また、電子顕微鏡により間接的に運動性を検出することも可能です。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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単一細胞細菌相互作用の可視化

出典: Scheidweiler, D., 他 流体装置と顕微鏡、フローサイトメトリーを組み合わせて、空間スケールを超えた多孔質培地内の微生物輸送を研究すること。 J. Vis.

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学ぼう、TTC半固体寒天法による細菌運動性の可視化手法。Staphylococcus aureusやEscherichia coliなどの病原菌の運動性を簡便に評価し、病原因子の研究に活用できます。

呈色反応に基づく細菌の運動性の可視化

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