Name: 高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出その場でのハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: 学ぶ脳切片における軸索の局在mRNA検出法。マウスおよびヒト組織を用いたin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせにより、神経科学における遺伝子発現の空間分布を可視化する技術です。

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この作業は、アルツハイマー病協会(NIRG-10-171721;U.H.へ)、国立精神衛生研究所(MH096702;U.H.へ)、国立神経障害・脳卒中研究所(NS081333;C.M.T.へ)、そして国立老化研究所が資金提供するコロンビア大学のアルツハイマー病研究センター(AG008702;J.B.およびY.Y.J.)からのパイロット研究賞によって支援されました。コメントや議論をいただいたHengst研究室のメンバーに感謝します

<ol><li>Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+localization+and+local+protein+synthesis+in+nervous+system+assembly%2C+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).</li>
<li>Campbell, D. S., Holt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+responses+of+retinal+growth+cones+mediated+by+rapid+local+protein+synthesis+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation.</a> Neuron. 32, 1013-1026 (2001).</li>
<li>Wu, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+RhoA+regulates+growth+cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Local translation of RhoA regulates growth cone collapse.</a> Nature. 436, 1020-1024 (2005).</li>
<li>Piper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+underlying+Slit2-induced+collapse+of+Xenopus+retinal+growth+cones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones.</a> Neuron. 49, 215-228 (2006).</li>
<li>Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+%CE%B2-actin+mRNA+localization+and+translation+in+Ca2%2B-dependent+growth+cone+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance.</a> Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).</li>
<li>Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+elongation+triggered+by+stimulus-induced+local+translation+of+a+polarity+complex+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).</li>
<li>Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+TC10+is+required+for+membrane+expansion+during+axon+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth.</a> Nat. Commun. 5, 3506(2014).</li>
<li>Preitner, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APC+Is+an+RNA-Binding+Protein%2C+and+Its+Interactome+Provides+a+Link+to+Neural+Development+and+Microtubule+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly.</a> Cell. 158, 368-382 (2014).</li>
<li>Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110, 223-235 (2002).</li>
<li>Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141, 632-644 (2010).</li>
<li>Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153, 1252-1265 (2013).</li>
<li>Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+translation+and+retrograde+trafficking+of+CREB+promotes+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival.</a> Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).</li>
<li>Ji, S. J., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-axonal+translation+of+SMAD1%2F5%2F8+mediates+retrograde+regulation+of+trigeminal+ganglia+subtype+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification.</a> Neuron. 74, 95-107 (2012).</li>
<li>Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+poly%28A%29+mRNA+with+microtubules+in+cultured+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons.</a> Neuron. 12, 571-582 (1994).</li>
<li>Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+subcellular+mRNA+compartmentation+in+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).</li>
<li>Hengst, U., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+and+translational+regulation+of+mRNA+in+developing+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Function and translational regulation of mRNA in developing axons.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).</li>
<li>Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+roles+of+local+translation+from+the+axonal+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome.</a> Open Biology. 2, 120079(2012).</li>
<li>Baleriola, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonally+synthesized+ATF4+transmits+a+neurodegenerative+signal+across+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions.</a> Cell. 158, 1159-1172 (2014).</li>
<li>Gumy, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+of+embryonic+and+adult+sensory+axons+reveals+changes+in+mRNA+repertoire+localization%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization.</a> RNA. 17, 85-98 (2011).</li>
<li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+mRNA+in+uninjured+and+regenerating+cortical+mammalian+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons.</a> J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).</li>
<li>Yoon, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+translation+of+extranuclear+lamin+B+promotes+axon+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance.</a> Cell. 148, 752-764 (2012).</li>
<li>Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+developmentally+regulated+local+translation+of+odorant+receptor+mRNAs+in+the+axons+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).</li>
<li>Willis, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Localization+of+transgene+mRNA+in+mature+PNS+and+CNS+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons.</a> J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).</li>
<li>Kar, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+axonal+trafficking+of+nuclear-encoded+mitochondrial+mRNA+alters+neuronal+mitochondrial+activity+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse.</a> Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).</li>
<li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: past, present and future.</a> J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).</li>
<li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).</li>
<li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization+analysis+of+mouse+pancreas+using+low-power+antigen-retrieval+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique.</a> J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-Color+Ultrasensitive+Bright-Field+RNA+In+Situ+Hybridization+with+RNAscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope.</a> Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).</li>
<li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuropathol.+Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).</li>
<li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSheehan%2C+DC+%22Theory+and+Practice+of+Histotechnology%22">Theory and Practice of Histotechnology</a>. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biol. 12, 55(2014).</li>
<li>Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+localization+of+arc+mRNA+in+dendrites+involves+activity-+and+translation-dependent+mRNA+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience+%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+molecular+diagnostics+%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このレポートでは、軸索ローカライズATF4 mRNAの検出で高解像度のISH技術の使用を記載しています。これらおよび以前発表された研究は、この技術は、組織中の抗体ベースのタンパク質検出、あるいは胚全体33と互換性があることを示しています。重要なことは、最近34海馬ニューロンの樹状突起内のアークのmRNAの検出のために使用されてきました。また、組織染色のための組織学的染料と組み合わせることができます。最後に、複数の標的のRNA 28,30,33の同時検出に適しています。これらの知見は、高解像度のRNA ISH技術の汎用性を例示し、元のプロトコルに若干の修正は、この方法の感度を低下させません。 単一分子分解能で組織中の目的のmRNAを検出するためのZ構造のプローブの使用を記載するオリジナルのプロトコルは、mRNAを含むアンマスキングのための2つのステップを示唆する30,35沸騰プロテアーゼ消化およびサンプル。ここでは、プロテアーゼによって誘発される負アンマスキング...

軸索のmRNAの募集とローカル翻訳は、時間的および空間的に急性様式1に細胞外刺激に応答する軸索を可能にします。イントラ軸索タンパク質合成は、最良の軸索は、9-11を経路探索し、逆行12,13シグナリング 、それは成長円錐の動作2-8において重要な役割を果たしている神経発達の文脈で理解されています。軸索のmRNAとリボソームのレベルが大幅に14,15に減少している場合にははるかに少ないが、ポスト発達神経細胞における軸索タンパク質合成の機能的意義について知られています。成熟した脊椎動物の軸索は、長い16翻訳不活性であると考えられてきました。しかし、最近の研究では、地元の翻訳は、病理学的条件の下で成熟した軸索に再活性化されることを示しています。例えば、mRNAのサブセットは、神経損傷およびイントラ軸索タンパク質合成は、これらの軸索17の正確な再生のために必要とされる以下の再生軸索に補充されます。さらに、当社グループヘクタールSは、特定のmRNAがアルツハイマー病ペプチドAβ1-42へのローカルの暴露後に軸索に動員されることを実証し、転写因子ATF4のローカル翻訳は軸索のニューロンの細胞体18へのAβ1-42の神経変性作用を伝播するために必要です。最後に、ハイスループット分析は、成熟した軸索は、特に病理学的条件下で、18-21予想以上に複雑で動的なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの研究に照らして、成体の神経系において軸索局在化するmRNAを検出するための高感度かつ特異的な方法が必要とされています。 成熟した軸索におけるmRNA動員およびローカル翻訳の作業の多くは培養ニューロンに行われています。特殊な培養方法はsomato樹状区画18-20からの軸索の単離を可能にする存在するため、トランスクリプトーム解析のために、これは特にそうです。このような研究は、貴重なインを与えているが、成熟した軸索の現地翻訳の役割にIGHTは、培養神経細胞を忠実に生体内でまたはmRNAの募集は、培養条件への軸索の適応応答である場合は、状況を表しているかどうかの質問はまだ開いています。いくつかの研究は、in vivoで軸索を成熟mRNAの動員の証拠を提供しました。例えば、嗅覚マーカータンパク質をコードする転写物は、成人の感覚ニューロンにおける軸索22で検出されています。 βアクチンのmRNAの3 &#39;UTRを含む導入遺伝子は、マウスにおいて、末梢および中枢神経系ニューロンにおける軸索に輸送され、局所的に発達期間23の後に翻訳されます。ラミンB2 mRNAはXenopuesにおける網膜軸索に局在しているオタマジャクシをアフリカツメガエル、その枯渇は軸索の開発21た後、軸索の維持に影響を与えます。チトクロームCオキシダーゼIVをコードするmRNAの軸索輸送との干渉は、マウスの動作24を変化させます。最後に、ATF4 mRNAが成人aで発見されましたAβ1-42との関連で、マウスとヒトの脳のxonsは、神経変性18を誘発しました。 ハイスループットのトランスクリプトーム分析は、 インビトロで 、単離された軸索中のmRNAプロファイルを同定するために有用であることが証明さが、全体の組織の軸索における以降のインビボ研究は単独で見つからないが、神経細胞体、グリア細胞および他の細胞型と混在んために限界があるています。したがって、このような分析は、mRNAの細胞内局在を確認する画像技術と組み合わせされなければなりません。 in situハイブリダイゼーション （RNA ISH） における RNAは、細胞および組織中の特定のRNA配列の検出および視覚化を可能にします。ただし、元のRNA ISHアッセイは、まれにしか軸索ローカライズされたmRNAのためのケースではありません非常に豊富RNAを25の同定に適していました。努力を増加させる最後の数十年のために、単一分子レベルでのmRNAの検出を可能にする新たな技術の開発に置かれています<suP&gt; 25,26。例えば、歌手らは5蛍光非重複50マーを（詳細は27を参照）、標識されたことからなる、単一細胞でのmRNAを検出するためのISHプローブを開発しました。上記の技術と、ここで説明したものとの主な違いは、後者は20ダブルZ-構造（ないリニア）は、典型的には、関心を保証する特異性と低いバックグラウンドレベルのRNAの約1 kbの領域を標的プローブを使用していることです。プローブは、最終的に蛍光標識または発色反応を可能にする酵素と結合しているプリアンプやアンプの配列とハイブリダイズさせます。これらの増幅ステップは、他のISH技術28に比べて、信号対雑音比を改善します。ここでは、蛍光免疫細胞化学または軸索対比を可能にする組織学的染料のいずれかを組み合わせRNAscopeを使用して2つのプロトコルを記述します。両方のプロトコルは、大人のMOにATF4 mRNAの軸索の局在を可視化するのに適しています使用して、人間の脳。

<table><tbody><tr><td>マウスAtf4 mRNA (NM_009716)の残基20-1,381を標的とするカスタムプローブ</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td></td><td>ヒトATF4 mRNA (NM_001675.2)</td><td></td>310043</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>の残基15-1,256を標的とするカスタムプローブポジティブコントロールプローブ-マウスPolr2A(オプション)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>312471</td><td>プローブ</td></tr><tr><td>ポジティブコントロールプローブ-ヒトPPIB(オプション)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>313901</td><td>プローブ</td></tr><tr><td>RNAscope蛍光マルチプレックス試薬キット(蛍光検出用)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>320850</td><td>in situハイブリダイゼーションキット</td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD 試薬キット - BROWN (発色検出用)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310035</td><td>in situ ハイブリダイゼーションキット</td></tr><tr><td>ヤギ ポリクローナル抗ChAT抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>ルクソールFast Blue-Cresyl Echt バイオレットステインキット</td><td>American MasterTech</td><td>KTLFB</td><td></td></tr><tr><td>Clearifyクリアリング剤(キシレン代替品)</td><td>American MasterTech</td><td>CACLEGAL</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 埋込&nbsp; 媒体 DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>DPX 埋込媒体</td><td>Sigma</td><td>6522</td><td></td></tr></tbody></table>

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmrnaの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAはしばしば、脊椎動物軸索に局在していると、地元の翻訳は、軸索の経路探索やpostdevelopmental期間中、開発中の分岐やメンテナンスのため、修理または神経変性のために必要とされます。ハイスループット分析は最近、軸索は、以前に予想以上にダイナミックで複雑なトランスクリプトームを持っていることを明らかにしました。これらの分析は、しかし、主に軸索はsomato樹状コンパートメントから単離することができる培養神経細胞で行われてきました。これは、in vivoでの組織全体でそのような分離を達成することは事実上不可能です。したがって、mRNAの採用や、動物全体におけるそれらの機能的関連性を検証するために、トランスクリプトーム解析は、理想的には、 その場でのmRNAの可視化を可能にする技術と組み合わせる必要があります。最近では、単一分子レベルでのRNAを検出する新規なISH技術が開発されています。 mRNAの細胞内局在を分析する際に特に重要です、ローカライズされたRNAは、典型的には、低レベルで見出されているからです。ここでは、新規の超RNA ISH技術を使用して、軸索に局在するmRNAの検出のための2つのプロトコルを記述します。我々は、成熟したマウスとヒトの脳におけるin vivoでの軸索にATF4 mRNAの募集を検証するために、蛍光免疫組織化学または組織学的染料を使用して軸索対比でRNAscope ISHを組み合わせています。

上記の手順の概要は図1に示されています。 ATF4 mRNAの最適な検出は、熱誘導アンマスキングを使用して、コリン作動性軸索に顆粒 mRNAの軸索の局在を評価する際には、軸索を識別することができるように、低豊富なRNAを可視化できることが重要です。ここで説明するRNA ISH技術は、単一分子分解能でのRNAの検出を可能にします。プロテアーゼ誘発性及び熱誘導アンマスキング28：この技術を使用して標準的なプロトコルは、効率的に標的RNAを検出するための2つのアンマスキングの手順の組み合わせを提案します。 ISHは、軸索を識別するために、免疫組織化学と組み合わせた場合しかし、プロテアーゼ誘発性脱マスクは、最適な抗原検出29をもたらさない可能性があります。 使用した抗体は、Cを認識することができなかったので、ここで説明した第一のプロトコルでは、プロテ...

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope ISHと免疫組織化学または組織学的色素との組み合わせを使用して、マウスおよびヒトの脳切片の軸索に局在するmRNAを成功裏に検出する方法を示します。

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

本実験の全体的な目的は、成体脳サンプルにおいて偶発的に局在化したmRNAを検出することです。まず、サンプルを沸騰させプロテアーゼ消化を行う前処理を施し、mRNA分子を露出させます。次に、ハイブリダイゼーションを行い、続いて増幅および検出ステップを行うことで、目的のmRNAを可視化します。次に、目的のmRNAが軸索に局在していることを確認するため、抗体または染料を用いて軸索を染色します。結果は、異なるアンマスキング手順とカウンターを用いた脳サンプルにおけるTF four mRNAの存在を、顕微鏡解析に基づく染色法を用いて示しています。この手法は、どのmRNAが軸索内で局在し、翻訳されているかという神経科学における問いに答えるのに役立ちます。この手法は、ニューロン内のタンパク質合成に関する知見を得るために有用ですが、樹状突起や、mRNAの局在化が起こる非ニューロン細胞および組織などの他の系にも適用可能です。書面によるプロトコルの指示に従って脳スライスを固定した後、60 mLの抗原賦活化液を入れたコピンジャーを用意し、スライドを溶液に浸します。次に、1 Lのビーカーに蒸留水を満たし、熱を緩衝させるために電子レンジにセットします。アンマスキングを行う際は、スライドと retrieve 液を入れたコプランジャーを電子レンジに入れます。高出力で5分間、スライドを煮沸します。溶液の沸騰が止まった直後に、再び高出力でさらに5分間、スライドを加熱します。スライドを室温で冷却します。冷却後、スライドをPBSを含むディッシュに浸して洗浄し、さらに2回洗浄を繰り返します。洗浄後、スライドを平らな面に置き、コントロールとして2〜3枚の脳切片にDAP B.Probeを2〜3滴、または100 µL添加します。バックグラウンド染色を評価するため、実験群の切片にターゲットプローブを2〜3滴添加します。目的のRNAを検出するために、ここではマウスa TF four RNAの20番目から1381番目の残基をターゲットとするAプローブを使用します。プローブの蒸発を防ぐため、ピンセットでスライドの上にパラフィルムを被せます。次に、スライドをハイブリダイゼーションオーブン内の加湿スライドボックスに入れ、40 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過した後、スライドを1x 洗浄バッファーが入ったディッシュに入れ、室温で2分間洗浄します。続いて、各脳切片に増幅試薬 AMP1FL を2〜3滴滴下します。その後、新しいパラフィルムで覆い、スライドボックスに入れて、ハイブリダイゼーションオーブンで40 °Cで15分間インキュベートします。前述と同様にスライドを洗浄した後、各脳切片に増幅試薬A MP four flを2〜3滴滴下し、パラフィルムで覆います。スライドボックスに入れたスライドを、ハイブリダイゼーションオーブンで40 °Cで15分間インキュベートします。室温で1×洗浄バッファーを用いて、スライドを2分間ずつ2回洗浄します。前と同様に、最後の洗浄後、3 mg/mL BSA、100 mM グリシン、および0.25% Triton X 100を含むPBSベースのブロッキング溶液を100〜200 µLずつ各切片に滴下します。各スライドをパラフィルムで覆い、室温で30分間インキュベートします。インキュベート後、ブロッキング溶液で希釈した抗体を100〜200 µLずつスライドに添加します。ここでは抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体を使用します。スライドをパラフィルムで覆った後、4 °Cで2日間インキュベートします。脳切片が乾燥しないように注意し、必要に応じて、インキュベーションの24時間後に抗CHATT抗体溶液を脳切片に再塗布します。スライドを1×PBSで5分間、3回洗浄した後、室温で適切なAlexa共役二次抗体を100〜200 µL、スライドに加えます。パラフィルムで蓋をし、遮光した状態で室温で1時間インキュベートします。1時間経過後、前述と同様に1x PBSで5分間ずつ3回洗浄し、その後、蒸留水で1回洗浄します。DPIを含む封入剤でスライドを封入し、蛍光顕微鏡下で脳切片を観察します。プロトコルの記述部分にある指示に従って、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）処理を施したヒト脳サンプルを準備した後、スライドを高温のPre-treat 2溶液に浸漬し、15分間煮沸して、熱誘導抗原賦活化を行います。蒸留水で3〜5回、次いで新鮮な100% ethanolで3〜5回洗浄し、室温で5分間乾燥させてから、プロテアーゼ誘導抗原賦活化を行います。Pre-treat 3を4滴滴下し、Perfilで密封し、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて40 °Cで30分間インキュベートします。その後、蒸留水で3〜5回洗浄します。前述のとおり、バックグラウンド染色を評価するために、コントロール脳スライスにDAP Bプローブセットを4滴加え、実験区の切片にターゲットプローブセットを4滴加えます。フィルムで覆った一対のスライドをスライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンを用いて40 °Cで2時間インキュベートします。書面によるプロトコルの手順に従い、目的のmRNAのDAB信号を発色させた後、明視野顕微鏡下で信号の有無を確認します。対比染色手順全体を通じて点状構造（puncta）の存在を確認するため、脳サンプルの参照領域を定義します。対比染色のために、まずスライドを60 °Cに予熱したLuxol Fast Blueに入れ、60 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、スライドを蒸留水で数回洗浄し、次に0.05%炭酸リチウム溶液に数回浸して分化を開始させます。続いて、スライドを新鮮な75%エタノールに2回浸し、蒸留水で洗浄します。明視野顕微鏡下で脳切片を確認してください。灰白質と白質が区別でき始め、RNA顆粒が濃い青黒色の点状構造として依然として視認できることを確認してください。軸索が淡い青色の繊維として現れ始めていることを確認し、10〜20分刻みでLuxal Blue溶液とともにインキュベートしてLuxal Blue染色手順を繰り返し、対比染色とRNA顆粒の有無を注意深く観察してください。最適な染色が得られたら、すすぎ済みのスライドをクリスタルバイオレット溶液に入れ、インキュベート後に10分間静置してください。スライドを蒸留水で洗浄します。スライドを70% ethanolに5〜10回浸し、その後、ドラフトチャンバー内で100% ethanolを3回素早く交換して脱水させます。キシレンに2回浸漬し、脳切片を透いさせます。代替透明化剤を用いて2分間、さらに3回目として5分間処理します。室温で、キシレンベースの永久封入剤を用いて脳切片を封入し、明視野顕微鏡下で分析します。魚の組織では、プロテアーゼによるアンマスキングの後、コリンアセチルトランスフェラーゼの抗体検出を行い、赤色で示しました。プロテアーゼ処理を行ったところ、抗体はchatを認識しませんでした。同一の顕微鏡設定および画像調整を用いて得られた、非標的プローブおよびATF4標的プローブによる結果の例を示します。軸索への局在が不明確なATF4陽性の緑色顆粒を疑問符で示しています。青色の領域は、熱誘起抗原露出法を用いて魚類で実施した際のダッピー染色された核である。赤色で示される抗原遮蔽解除後の免疫蛍光染色の再試行は成功した。軸索に局在するTF four陽性顆粒はオレンジ色に見え、これらはOKとしてマークされている。その後、軸索をluxalで対比染色した。Fast blueおよびneuronal SOTAを、cresyl violet suboptimal luxalで対比染色した。温度を下げると、Fast blue染色の結果に影響が出る可能性がある。本手法では、サンプルを40 °Cで4時間、luxal fast blueを用いて染色した。不確実な偶発的局在を示すTF four陽性顆粒を疑問符で示しています。ここに見られるように、短いインキュベーション期間後に対比染色の強度が確認されない場合、染色の質が低下することがあります。非標的プローブまたはTF four標的プローブを用いたishとLFB染色の最適な組み合わせの例をここに示します。画像取得は、最高の信号対雑音比が得られるように自動調整されました。Axonにより、TF four顆粒の局在が確認され、良好であるとマークされました。マスター化が完了しました。この手法は、発現後の対比染色の方法に応じて、1日から3日で完了します。この手法により、神経科学者はmRNAの翻訳と局在を詳細に探索することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶ脳切片における軸索の局在mRNA検出法。マウスおよびヒト組織を用いたin situハイブリダイゼーションと免疫組織化学の組み合わせにより、神経科学における遺伝子発現の空間分布を可視化する技術です。

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

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