高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出その場でのハイブリダイゼーション

次の実験の全体的な目標は、成体脳サンプル中の偶然に局在したmRNAを検出することです。これは、前処理によって達成されます。サンプルを沸騰させ、プロテアーゼ消化してmRNA分子のマスクを解除することにより、第2のステップとしてハイブリダイゼーションが行われ、続いて増幅および検出ステップが行われ、目的のmRNAの可視化が可能になります。

次に、目的のmRNAが軸索に局在していることを確認するために、抗体または色素で軸索を染色します。その結果、顕微鏡分析に基づく染色法である、さまざまな非マスキング手順とカウンターを使用して、脳サンプル中にTF 4 mRNAが存在することが示されています。この方法は、どのmRNAがエクソンなしで局在化および翻訳されるかなど、神経科学の質問に答えるのに役立ちます。

この方法は、イントラコンタンパク質合成に関する洞察を得ることができますが、樹状突起やmRNAの局在が起こる非ニューロン細胞および組織などの他のシステムにも適用できます。脳スライスを固定した後、書かれたプロトコルの指示に従って、60ミリリットルの抗原賦活化溶液が入ったコピンジャーを準備し、スライドを溶液に浸します。次に、1リットルのビーカーに蒸留水を入れ、電子レンジに入れて熱を緩めます。

マスキング解除を行うときは、スライドと回収溶液が入ったコプランジャーを電子レンジに入れます。スライドを高出力で5分間茹でます。溶液の沸騰が止まった直後に、スライドを再び高出力でさらに5分間加熱します。

スライドを室温で冷まします 冷却後、スライドをPBSを含む皿に浸して洗浄し、さらに2回洗浄を繰り返します 洗浄後、スライドを平らな面に置き、コントロールとして2〜3滴または100マイクロリットルのDAP B.Probeを2つまたは3つの脳セクションに追加します。バックグラウンド染色を評価するには、実験切片にターゲティングプローブを2〜3滴加えます 目的のRNAを検出するために、マウスの残基20〜1381をターゲティングするプローブA TF 4つのRNAがここで使用されます。鉗子を使用してスライド上にパラメータを配置し、プローブの蒸発を防ぎます。

次に、スライドをハイブリダイゼーションオーブン内の加湿スライドボックスに入れ、摂氏40度で2時間インキュベートします。インキュベーション時間が経過したら、スライドを1 x Wash Bufferの入ったディッシュで室温で2分間洗浄します。次に、増幅試薬1 MPを各脳スライスに2〜3滴加えます。

次に、新鮮なパラフィルムで覆い、スライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で15分間インキュベートします。前回と同様にスライドを洗浄した後、各脳スライスに増幅試薬A MP four flを2〜3滴加え、パーフィルで覆います。スライドボックス内のスライドを摂氏40度でハイブリダイゼーションオーブンで15分間インキュベートします。

スライドを1 x 洗浄バッファーで室温で 2 回ずつ 2 回洗浄します。最後の洗浄に続いて、各スライスを100〜200マイクロリットルのブロッキング溶液で覆い、3ミリグラム/ミリリットルのBSA、100ミリモルグリシン、およびPBS中の0.25%Triton X 100を含むブロッキング溶液で覆い、各スライドをパラフォームで覆い、30分間インキュベートしますインキュベーション後の室温で、ブロッキング溶液で希釈した抗体の100〜200マイクロリットルをスライドに加えます。ここでは、スライドをperfilで覆った後、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体を4°Cで2日間インキュベートします。

必要に応じて脳スライスが乾燥しないように、インキュベーションの24時間後に抗CHATT抗体溶液を脳スライスに再塗布します。スライドを1つのXPBSで5分間3回洗浄した後。室温で、100〜200マイクロリットルの適切なAlexa標識二次抗体をスライドに加えます。

パラムで覆い、1時間が経過した後、光から保護しながら室温で1時間インキュベートします。スライドを前と同じように1つのXPBSで5分間ずつ3回洗浄し、次に蒸留水で1回洗浄します。DPIを含む封入剤でスライドをマウントし、蛍光顕微鏡で脳スライスを視覚化します。

正式で固定されたパラフィン包埋ヒト脳サンプルを調製した後、プロトコルの書かれた部分の指示に従って、スライドを高温の前処理2溶液に浸し、15分間煮沸することにより、熱誘起抗原のマスキング解除を行います。蒸留水で3〜5回、新鮮な100%エタノールで3〜5回洗浄した後、スライドを室温で5分間乾燥させて、プロテアーゼ誘導抗原のマスキング解除を行います。4滴のプレトリートメントを加え、3つをパーフィルで覆い、蒸留水で3〜5回洗浄した後、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で30分間インキュベートします。

前回と同様に、バックグラウンド染色を評価するために脳スライスを制御するためにDAP Bプローブセットを4滴追加し、実験切片にターゲティングプローブセットを4滴追加します。フィルムで覆われたスライドのペアをスライドボックスに入れ、ハイブリダイゼーションオーブンで摂氏40度で2時間インキュベートします。記載されたプロトコールの手順に従って目的のmRNAのDABシグナルを作成した後、明視野顕微鏡でシグナルの存在を確認します。

カウンター染色手順全体で点の存在をモニターする脳サンプルの参照領域を定義します。汚れ対策に。まず、スライドを摂氏60度に予熱した豪華なファストブルーに入れ、摂氏60度で30分間インキュベートします。

インキュベーション後、スライドを蒸留水で数回すすぎ、次にスライドを0.05%炭酸リチウム溶液に数回浸して分化を開始します。次に、スライドを新鮮な75%エタノールに2回浸し、蒸留水ですすいでください。明視野顕微鏡で脳スライスを確認します。

灰白質と白質は区別可能になり始め、RNA顆粒はまだ紺色の黒色のプンクタとして見えるはずです。軸索が水色の繊維として現れ始めることを確認し、ルクサルブルー染色手順を繰り返し、ルクサルブルーと10〜20分ステップでインキュベートし、最適な染色が達成されたときに対比染色とRNA顆粒の存在を注意深く監視します。リンススライドをクレスタルバイオレット溶液に入れ、インキュベーション後10分間インキュベートします。

スライドを蒸留水ですすいでください。スライドを70%エタノールに5〜10回浸し、ドラフト内で100%エタノールを3回すばやく交換して脱水します。キシレンで2回インキュベートすることにより、脳のスライスをクリアにします。

代替清算機関を2分間、3回目を5分間。室温で、脳スライスをキシレンベースの永久封入剤にマウントし、明視野顕微鏡で分析します。魚類は、プロテアーゼ誘導アンマスキングと続いて赤で示されているコリンアセチルトランスフェラーゼの抗体検出を使用して行いました。

この抗体は、プロテアーゼ処理を行ったときにチャットを認識できませんでした。非ターゲットプローブとa TF 4ターゲティングプローブで得られた結果の例を、同じ顕微鏡設定と画像調整を使用して示します。軸索局在が不明瞭な緑色のATF4つの陽性顆粒は、疑問符で示されています。

青い部分は、熱誘起抗原を使用して魚を行ったときの薄汚れた核です。チャット免疫蛍光染色のマスキング解除に成功し、再び赤色で示しました。軸索に局在するTFの4つの正の顆粒はオレンジ色に見え、液体の軸索がルクソールで対比染色された後、大丈夫とマークされています。

ファストブルーとニューロンSOTAは、クレスタルバイオレットサブ最適ルクサルで対比染色されました。温度を下げると、青色の染色が急速に進む可能性があります。ここでは、サンプルを摂氏40度のルクサルファストブルーで4時間染色しました。

A TF の 4 つの正の顆粒で、偶然の局在が不明瞭なものは疑問符で示されています。最適でない染色は、ここで見られるように、インキュベーション期間が短い後にカウンター染色の強度がチェックされない場合にも発生します。ここでは、ノンターゲットプローブまたはa TF four ターゲティングプローブを使用した ish と組み合わせた最適な LFB 染色の例を示します。

画像取得は、最適な信号対雑音比になるように自動的に調整されました。軸索はTFに局在し、4つの顆粒が問題ないとマークされています。一度マスターしたら。

この技術は、開発後に選択した対比染色方法に応じて、1〜3日で実行できます。この技術は、神経科学者がニュアンスにおけるmRNAの翻訳と局在を探求するための道を開きます。