Name: 多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶ多孔質膜挿入とRT-ddPCRを用いた軸索mRNA単離・定量法。神経細胞体と神経突起を分離し、低コピー転写産物の高感度検出を実現。軸索におけるmRNA輸送と局所翻訳の研究に有用です。

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<table><tbody><tr><td>6ウェルプレート用細胞培養挿入物、1.0&nbsp;&mu;m 毛穴サイズ、無菌</td><td>コーニング</td><td>353102</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>6ウェルプレート用細胞培養挿入物、3.0&nbsp;&mu;m 毛穴サイズ、無菌</td><td>セルトリート</td><td>230603</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>狭刃付きセルリフター</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>CELLSTAR 6ウェル組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ddPCR 96-ウェルプレート&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td>12001925</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ddPCRドドロップレットリーダーオイル&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td>1863004</td><td>試薬</td></tr><tr><td>QX200/QX100 ドロップレットジェネレーター用のDG8カートリッジ</td><td>バイオラッド</td><td>1864008</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>試薬</td></tr><tr><td>LunaScript RTスーパーミックスキット</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>試薬</td></tr><tr><td>蛍光ベースの96ウェル黒色マイクロプレート</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>M33089</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>PCRプレート熱封、ホイル、ピアス可能</td><td>バイオラッド</td><td>1814040</td><td>消耗品</td></tr><tr><td>ポリリジン</td><td>シグマ</td><td>P1274</td><td>試薬</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 サーマルサイクラー</td><td>バイオラッド</td><td>12015382</td><td>装備</td></tr><tr><td>クアンタソフトソフトウェア</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td>PCRデータ解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>Quant-it リボグリーン試薬およびRNAアッセイキット</td><td>サーモ・フィッシャー</td><td>R11490</td><td>試薬</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR エヴァグリーン・スーパーミックス</td><td>バイオラッド</td><td>1864034</td><td>試薬</td></tr><tr><td>QX200 エヴァグリーン用液滴生成オイル</td><td>バイオラッド</td><td>1864005</td><td>試薬</td></tr><tr><td>QX200 液滴発生器</td><td>バイオラッド</td><td>17005227</td><td>装備</td></tr><tr><td>QX200 ドロップレットリーダー</td><td>バイオラッド</td><td>17005228</td><td>装備</td></tr><tr><td>トリゾル試薬</td><td>インビトロジェン</td><td>15-596-026</td><td>試薬</td></tr></tbody></table>

多孔質膜挿入およびrtddpcrを用いた軸索mrnaの単離および定量

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

一次胚の齧歯類皮質ニューロン、海馬ニューロン、PLL被覆1μm挿入物にプレートされたBFCNは強固に接着し、神経質を5〜7日間in vitro (DIV)に延長します。11 DIVまでに、文化は密集したネットワークを示します。成体ラットのDRGでは、PLL被覆された3μm挿入部にラミニンを一層加えることで、軸索延長が5DIV分に相当します。これらの観察は、挿入物が長期的な神経細胞成長を支え、下流RNA抽出に必要な十分な軸索材料を提供できることを確認しています。必要に応じて、複数のインサートを組み合わせて十分な素材を確保します。
個々の挿入物からTRIzolを抽出することで、逆転写およびその後のddPCRに必要な十分なRNAが得られます。RiboGreen定量により、全ニューロン分画からは一貫したRNA収量(212.85 ng/挿入)が確認され、神経突起分からは低い収量(42.75 ng/挿入)が確認されました(図2)。一般的に、神経細胞が豊富に使われる部分に比べて、全ニューロン分画から約5〜7倍のRNAが得られます。
すべてのプライマーはRTddPCR実験前に検証されています。各ターゲット転写産物に対して、少なくとも2つのプライマーセットを注文し、同じニューロンサンプルから生成されたcDNAに対して従来のPCRを用いて試験します。最も強く特異的な帯を作るプライマーペアがRTddPCRのために選ばれます(図3A)。例えば、 Gap43にはプライマーセット1を選びました。 Actγのように曖昧な結果がある場合には、アニーリング温度を最適化するために勾配PCRを行います(図3B)。これにより、絶対定量には十分に検証されたプライマーのみが使用され、液滴分離におけるアーティファクトの可能性が低減されます。
スクレーピングと綿棒採取の手順は、体性区画と神経系区画を確実に分離します。全ニューロン分画から単離されたRNAは、Actγ 46,47,48,49(図4)などの転写産物の濃縮を示します。対照的に、軸索・神経突起の割画は体積が制限されていることと一致し、総RNAの量は著しく少ないものの、Gap43(図4)など遠位突起に局在することが知られている転写産物の濃縮が見られます。体細胞制限転写本の交差検出が最小限であることは、挿入物を慎重に取り扱い最適な密度でプレートした場合に高い区画純度を示します。
良好な結果として特徴づけられるのは、(1) 軸索が明確に伸長した完全な神経形態、(2) 膜の破裂なしに区画がきれいに分離していること、(3) 陽性と陰の液滴を明確に分離する実証済みプライマー、(4) 軸索転写産物に対する強いRTddPCRシグナルがあること。最適でない実験では、RNA収量の低下、神経突起分のソーママーカーによる交差汚染、またはプライマー二量体化による液滴「雨」の増加などのRTddPCRアーティファクトが発生します。これらの問題は、インサート膜の損傷、過剰なスクレーピング圧力、プライマーのアニーリング温度最適化の不十分に関連していることが多いです。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
図1:膜挿入を用いた区画特異的RNA分離の概要。 齧歯類ニューロンは、1〜3μmの孔径を持つ半透性挿入物で培養され、これにより神経突起の伸長が可能でありながら体細胞性を制限しました。全ニューロンの準備では、上部区画の細胞を無菌細胞スクレーパーで削り取り、ペレット状にしてTRIzolで溶解し、RNA単離、cDNA合成、RTddPCRを行いました。残留細胞の残渣は無菌綿棒で挿入膜から除去されました。ニューライト製備のために、ニューライトのみを含む挿入膜を逆さにしてメス刃で切断し、TRIzolに直接浸し、その後RNA分離、cDNA合成、RTddPCRを行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてください。</a>
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
図2:RiboGreenアッセイを用いた標準RNA濃度曲線。 (A) 希釈されたRNA標準の系列で、RiboGreen RNA定量アッセイを用いて蛍光強度を測定しました。線形回帰解析により、RNA濃度と蛍光信号の間に強い相関が認められました(R² = 0.9956)。R²値が1に近いことは、RiboGreenアッセイのRNA定量に対する優れた線形性と信頼性を示しています。(B)Aで得られた傾きの式(y=19.738x + 14.905)を用いて、各区画の総RNAを算出した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
図3:PCRおよびアガロースゲル電気泳動によるプライマー検証。 (A) Actγ および Gap43 のcDNAを用いたPCR増幅産物を2%アガロースゲル上で分離し、プライマー特異性を評価しました。各遺伝子に対して、2つの独立したプライマーセット(セット1とセット2)がテストされました。DNAのサイズマーカー(はしご)は隣接レーンに分子量(10 kb、0.5 kb、0.1 kb)を示しています。期待されるサイズの異なる単一バンドは、選択されたプライマーセットの増幅と特異性の成功を裏付けます。(B) PCR増幅は、温度勾配(55-65°C)に沿って Actγ プライマーセット2を用いて最適なアニーリング温度を決定しました。増幅生成物はDNAラダー(レーン2、サイズ表示)とともに2%アガロースゲルで分離されました。試験範囲全体で期待されるサイズの一貫した単一帯が観察され、最も強い増幅は55°Cで検出され、このプライマーセットにとって最適な温度であることが示唆されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
図4:選択された転写本のRTddPCR解析およびmRNAコピーの定量化。(A,B) (A) Actγおよび(B) Gap43の液滴分離を示す代表的な一次元振幅プロット。各点は単一の液滴を表し、青い液滴は正の増幅を示し、灰色の滴は負の増幅を示します。Y軸は振幅を表し、X軸はddPCRプレート内のウェル位置を示します。陽(青)と陰(灰色)の滴が明確に分離されていることで、指示されたプライマーセットによる標的転写産物の堅牢な検出が確認されました。(C) 全ニューロンおよび神経突起画におけるActγおよびGap43転写産物のコピー数/μLおよびコピー数/gをまとめた表。コピー数推定は、ddPCRドロップレットカウントを用いた絶対定量から得られました(パネルA、Bに示されています)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>

多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量

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