多孔質膜挿入およびRTddPCRを用いた軸索mRNAの単離および定量

私たちの研究は、局所タンパク質合成がどのように調節されるか、そしてそれらが神経修復、発達、変性に果たす役割を調査しています。最近の進展には、gdPCRのような高感度mRNA検出技術があり、低存在量の軸索MRNAを同定し、神経細胞培養を区画化しています。まず、250マイクロリットルのトリアゾールを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに注ぎ込みます。これは各挿入点に対応し、1つのウェルまたは6ウェルプレートの挿入部に入ります。

必要な時までチューブは取っておきましょう。2枚目の6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルの滅菌PBSを加え、インサートの数とウェルまたはプレートの数が一致するようにします。インサートの上部底部から培地をピペットで取り出し、PBSを含む6ウェルプレートにインサートを移します。

次に鉗子を使ってインサートを優しく置き、その上にPBSを2ミリリットル加えます。両側からPBSを吸引し、これを繰り返して2回洗浄します。その後、インサートは新しいPBSに浸したままにします。

次に、滅菌細胞スクレーパーを使ってインサートの上部からニューロン全体をこすり取ります。インサートからソーマ溶解液を採取してください。1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。

チューブを10,000から15,000Gで2分間遠心分離します。上清液を捨て、250マイクロリットルのトリゾールに再懸浮させます。このチューブをニューロン全体の部分としてラベル付けしてください。

神経突起の部分を採取するには、滅菌綿棒の一端をインサートのニューロン側全体をジグザグにゆっくり動かします。インサートを90度回転させ、綿棒の反対側で繰り返します。その後、綿棒を捨てます。

新しい綿棒を使い、インサートの中心から外側に向かって同心円状に動かし、周囲も必ず掃除してください。インサートを逆さまにしてニューライト側を上にします。新しい滅菌メスの刃で膜を切ってください。

切断した膜をトリゾールを含む6ウェルプレートにニューライト側を下向きに置きます。膜が水没していることを確認しましょう。次に、ウェルからニューライト溶解液を含むトリゾールを採取します。

1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブに移します。RNA単離を進めるか、ソーマとニューライト溶解液をマイナス80度の温度で保存して後処理します。Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mixを用いて逆転写液滴デジタルPCR反応を準備し、適切な相補DNAで特定のプライマーを標的にします。

反応混合物を液滴生成カートリッジにピペットで移します。次に、カートリッジの指定された井戸に生成油を加えます。次に、ガスケットでカートリッジを密封します。

ドロップレットジェネレーターを使ってドロップレットを生成します。液滴が生成されたら、96ウェルのPCRプレートに移し、ホイルで密封してからプレートをサーモサイクルラーに入れます。QXマネージャーソフトウェアを開いて分析を開始します。

「ブラウズ」オプションをクリックして、解析するファイルを開きます。ファイルが読み込まれると、左側のパネルにダッシュボードビューが表示されます。Ctrlキーを押しながらクリックすることで、興味のある井戸を選択します。

1次元振幅をクリックすると、ドットプロットを視覚化できます。複数のウェルに同じ閾値を適用するために「閾値複数井戸」を選択します。正と負の滴の間に明確な分離が見られる場所に基づく閾値を入力します。

次に、サンプルの説明、濃度値、許容される液滴数、そして正負の滴数を示すデータセクションをよく見てください。「保存」をクリックして閾値測定の結果を記録します。リボグリーンアッセイを用いたRNA定量により、全ニューロン分画は挿入1回あたり212.85ナノグラムのRNAを得られ、神経突起分は42.75ナノグラムであることが明らかになりました。

PCR検証により、プライマーセット1はGap43転写産物に最も特異的であり、明確な単一バンドであることが確認されました。ガンマアクチンのPCR結果が曖昧だったため、プライマーセット2を用いた温度勾配試験が行われ、55度で最も強い増幅が認められました。RT-ddPCR振幅プロットでは、全ニューロンサンプルおよび神経突起サンプルの両方でガンマアクチンの液滴分離が明確に示され、信頼性の高い転写本検出が確認されました。

Gap43では、mRNAプールの約23%がニューライトに存在しているのに対し、ガンマアクチンは神経系全体に比べてわずか5%しか存在しません。生理学的条件下で軸索にストレス顆粒構造が存在し、局所的なタンパク質合成を阻害していることが示されました。当プロトコルは、神経細胞の区画を単離し、低環境mRNAを検出するための信頼性が高く一貫した方法を提供します。

今後の解析は、成長錐体や軸索軸などの異なる軸索サブドメインの分離と特徴付けに焦点を当て、バルク解析を超えて行う予定です。