Name: マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学ぶマウス網膜色素上皮への遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ網膜下注射法。鈍針を用いた簡便な手技で、蛍光マーカー発現を免疫蛍光顕微鏡で確認できます。

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この研究は、ソウル大学研究助成（800から20140542）によってサポートされていました、NRF / MESTのパイオニア研究プログラム（2012から0009544）、およびNRF / MESTの生体信号解析技術イノベーションプログラム（2009から0090895）、とNRF / MESTのグラント（2015M3A9E6028949）。

動物の全ての実験は、眼科と視覚研究における動物の使用のためのビジョンと眼科文の研究のための協会に従って実行、およびガイドラインや規制は、ソウル国立大学施設内動物管理使用委員会とソウルで定められました大学病院バイオセーフティ委員会。 1.インジェクションキットおよびウイルスベクターを準備<ol><li>酸化エチレンガスを使用して滅菌33 G鈍針を備えたマイクロシリンジを準備します。マイクロチューブ（ すなわち、1×10 6 TU /μL）で十分な力価のために、PBS中のウイルスベクターを希釈します。シリンジ内の任意のデッドスペースを除去するために、ウイルスベクターを用いて、シリンジを数回フラッシュします。 </li></ol>ウイルスベクターの2網膜下注射<ol><li> tiletamiの混合物の腹腔内注射で-成体マウス（8週齢、すなわち、6）麻酔NE及びゾラゼパム（1：1、2.25 mg / kg体重）及びキシラジン塩酸塩（0.7 mg / kg体重）、または代替の適切な麻酔レジーム。 </li><li>フェニレフリン0.5％の点眼で瞳孔を拡張し、0.5％のトロピカミド。 </li><li>ウイルスベクター2μlの - 1.5でロードすることにより、マイクロシリンジを準備します。 </li><li>まぶたを開いて、便利な注射のための赤道を露出させ、手術用顕微鏡下に集中するために目を突出しています。注入を終えまで突出目の位置を維持する、または針の変位が注入中に発生する可能性があります。しっかりと眼球を保持するために、眼窩縁の外側に指を置きます。 </li><li>角膜表面への眼科用粘弾性溶液の液滴を適用します。 </li><li>網膜を視覚化するために、角膜の上に小さな丸いカバースライドを置きます。 </li><li>さらに網膜下注射のための無菌の30 G 1/2針を使用して角膜縁にわずかに後方に小さな穴を穿刺。劣っFO穴を作りますR右目、利便性のために、左眼のための優れました。 注：穴が時間的または経鼻で行われる場合、それは注射後まぶたによって覆われるのは難しいです。初期パンクはわずか輪部に沿って実行して、容易に認識することができ輪部血管を回避するために、角膜輪部に後方なされるべきです。最初の穿刺をしながら針でレンズを打つないように注意してください。レンズ穿刺を回避するために、針の全体の傘を挿入しないでください。 </li><li>プレパンクチャーホールを介してマイクロリットルの注射器の33 G鈍針を置き、穏やかな抵抗が感じられる点まで、網膜下腔に針を近づけます。 注：網膜下注射のために、針の最良のアプローチ角は、虹彩面に対して約45度であり、鈍い針は乳頭周囲の領域に向かって後方に押されるべきです。点線の四角は網膜下の充血のために硝子体腔を横切る示唆針経路を示しました図1中のn。 注：彼らは非常に柔らかいようピアス（または通過）網膜層ときに抵抗が感じないがあるでしょう。このように、軽度の抵抗の最初の気持ちは、針が既にRPE層に触れた、針の挿入が停止されるべきであることを示しています。針は、潜在的な網膜下腔に配置する必要がありますので、過度の圧力と強膜組織を貫通しないように注意してください。針が過大な力で強膜組織を穿刺した場合、それは抵抗なく外眼軌道の空間に入ります。 （このステップは非常に重要です） </li></ol><img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig1.jpg" /> 網膜下注射の図1の模式図で。H＆Eは、マークされた網膜下注射用の針経路（点線の四角）との構造を描いたマウスの眼の断面を染色しました。倍率：40X、スケールバー：<html> 500ミクロン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53030/53030fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <ol start="9"><li>不要な組織の損傷を避けるため、ゆっくりと針を撤回する震えずに網膜下の空間に静かにウイルスベクター（ すなわち、1×10 6 TU /μl）を注入します。 2.4で説明したように、注射の際にしっかりと眼球を保持します。 </li><li>何の網膜出血がないことを確認する手術用顕微鏡下で注入後の網膜下ブレブの形成を観察します。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53030/53030fig2.jpg" /> 図2.網膜出血せずに網膜下Belb形成。手術用顕微鏡下での網膜下注射後の網膜下belbの顕微鏡図は、網膜出血のない成功ブレブ形成を示します。M /ファイル/ ftp_upload / 53030 / 53030fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 <ol start="11"><li>静かに自己封止用注射部位をカバーするために瞼を閉じます。ホームケージにマウスを返し、評価まで生き続けます。 注：研究者は手順に慣れた後、彼らはこれらのステップをスキップすることにより、迅速な手順で再現性のある結果を得ることができます（2.5、6、および10） </li></ol>網膜色素上皮における遺伝子送達の有効性の評価3。 <ol start="1"><li> CO 2チャンバー内でマウスを生け贄に捧げます。はさみを使用して、目を摘出。 </li><li>数日に最低1時間、4℃で4％パラホルムアルデヒド溶液中で目を修正しました。 </li><li>細かい鉗子で角膜をつかみ、マイクロはさみで角膜を穿刺。角膜輪部に沿ってシザリング後の角膜を削除します。ピンセットでレンズを取り外してください。 </li><li> mの毛様体トリムicro-はさみ網膜剥離を可能にします。静かRPE /脈絡膜/強膜複合体からの全網膜を引っ張ります。フラットマウント用4〜8葉を作るために視神経に近い中心に周囲から放射状に数回RPE /脈絡膜/強膜複合体をカットします。 </li><li>ダウンRPE側を行い、筋肉、結膜および視神経を含む強膜側の残りのすべての組織をトリミングするRPE /脈絡膜/強膜複合体を反転します。残りの組織は複雑な凹凸を作るため、この手順は、フラットRPE /脈絡膜/強膜複合体を作ることが重要です。 </li><li> （詳細な方法のための参考文献を参照して、オプション）特定の研究目的のために一次および二次抗体との複合体をインキュベートします。スライドガラス上のRPE /脈絡膜/強膜複合体をフラットマウントし、吸収性スポンジを含むPBSを吸収します。 </li><li>取付溶液30μlを添加して、カバースライドを配置します。フルオレセイン顕微鏡下でベクター送達の有効性のためのサンプルを観察します。でサンプルを保ちますさらに観察用冷蔵庫。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このビデオの記事では、RPE /脈絡膜/強膜フラットマウントの代表的な結果で詳細に輪部-アプローチ網膜下注入技術を説明しました。これは、RPEへのウイルスベクターの網膜下注射のための簡単​​で便利な技術です。注入時のブレブ形成の直接可視化は初心者のための正確な配達のための重要なステップです。可視化実験8-10誌で紹介し、いくつかの網膜下注入技術があります。網膜下腔は網膜とRPEの間の潜在的な空間であり、したがって、網膜下腔に接近するための2つの可能なルートがあります。一つは、硝子体と網膜を介して網膜下腔への内部的なアプローチであり、他方は、RPEおよび強膜を介して外部のアプローチです。この縁-アプローチ網膜下注入技術は、硝子体内空間と網膜を介して、前者です。この技術は、後者に比べて後方ブレブ形成を提供するという利点を有しているため、後者のApproachは周辺網膜を介して行われるべき、強膜トンネルまたは切開を介して周辺側からブレブを行います。また、シンプルな輪部穿刺は、網膜の浸透せず、強膜トンネルよりも容易です。新生仔マウスの場合、しかし、それは外部のアプローチ9を用いることが</s...

眼科では、遺伝子治療は、単一遺伝子継承網膜症における治療法として浮上しています。レーバー先天性amurosis 1,2、網膜色素変性症3、および先天性脈絡膜欠如4を含む網膜色素上皮（RPE）における遺伝子に関連した継承された網膜症があります。遺伝子治療の研究分野は、前臨床研究や、 アデノ -関連ウイルス（AAV）、 レンチウイルス （LV）およびアデノウイルス （AD）などのウイルスベクターを用いた臨床試験の両方に拡大している5。別のウイルスベクターは、網膜内の異なる親和性を有しています。安全かつ効果的な遺伝子治療のために、ウイルスベクターは、注意深く標的細胞および標的遺伝子に応じて選択されるべきです。 遺伝子送達の経路は、従って、それは慎重に同様に選択されるべきで、また、細胞を標的とする効果的な遺伝子送達のために重要です。ウイルスベクターの眼内送達のための2つの最も一般的な方法は、subretされていますinal注射や硝子体内注射6。後者は、硝子体内注射は、広く滲出型加齢黄斑変性症（AMD）および糖尿病性網膜症7の黄斑浮腫で脈絡膜血管新生を治療するための薬物送達のために使用されています。硝子体内経路は、硝子体と内側の網膜へのウイルスベクターの露出を提供していますが、外側の網膜へのベクターの拡散が制限されています。一方、網膜下の経路は、ローカライズ胞を誘導する、網膜とRPEの間の潜在的な空間へのウイルスベクターの直接送達を提供します。したがって、網膜下注射は、現在、光受容体細胞およびRPEを標的とする、より効率的なルートであると考えられます。外科的アプローチの面では、プラナは、ヒト患者における網膜の損傷を避けるために硝子体内注射のための安全なエリアとして選択されているPARS。単にマウスにこの方法を変更することによって、私たちは輪部アプローチを介して、網膜下またはintravireallyウイルスベクターを注入することができます。 このビデオで記事は、我々は、マウスのRPEへのウイルスベクターの網膜下注射の簡単で便利な方法を示しています。 30 G 1/2針で角膜輪​​部の後方に単一の穿刺後、33 G鈍針搭載マイクロリットルのシリンジは輪部穿刺部位を介して網膜下腔に挿入されます。 1.5のウイルスベクター - 2μlのボリュームが網膜下ブレブを誘発網膜とRPEとの間の潜在的な空間に注入されます。この手順では、手術用顕微鏡を用いて直接可視化の下で行うことができます。反復練習も、ブレブ形成の直接可視化することなく、複製の結果を保証します。これは、研究者がマウスのRPEにおける網膜下の遺伝子送達のために、正確かつ時間節約実験を行うのに役立ちます。

<table><tbody><tr><td>ピンセット DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0.1 x 0.06 mm TIPS</td><td>WPI</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>VANNAS Scissers S/S, 105 mm</td><td>WPI</td><td>555583S</td><td></td></tr><tr><td>33 G 鈍針</td><td>WPI</td><td>NF33BL-2</td><td></td></tr><tr><td>NanoFil シリンジ, 10 マイクロリットル&nbsp;</td><td>WPI</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>RPE-KIT</td><td>WPI</td><td>RPE-KIT</td><td>片手で簡単に注射できる</td></tr><tr><td>30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm) BD PrecisionGlideTM ニードル</td><td>BD</td><td></td><td>305107 網膜下注射用初期穿刺</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー メガネ (No. 1 3 mm 直径)</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>64-0720&nbsp;(CS-3R)</td><td></td></tr><tr><td>ライカ手術顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>LM M80</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセシン顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>エクリプス 80i</td><td></td></tr><tr><td>レンチウイルス</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>TMO.LV-Ctr</td><td>ベクターの希釈に使用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td>ベクターの希釈に使用</td></tr><tr><td>トロペリン (フェニレフリン 0.5% - トロピカミド 0.5%)</td><td>Hanmi</td><td></td><td>拡張用</td></tr><tr><td>プロパラカイン 塩酸塩点眼液 USP, 0.5% (滅菌)</td><td>Bausch&局所</td><td>麻酔のための</td>Lomb<td></td></tr>、<tr><td>Healon、GV、OVD、</td><td>Abbott Medical Optics、Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゾレチル50(次亜塩素酸チレタミンおよび次亜塩素酸ゾラゼパム)</td><td>ビバック</td><td></td><td>全身麻酔用</td></tr><tr><td>ロンプン注射(キシラジンHCl)</td><td>バイエル</td><td></td><td>全身麻酔用</td></tr></tbody></table>

マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

Limbal Approach-Subretinal Injection of Viral Vectors for Gene Therapy in Mice Retinal Pigment Epithelium

目は小さく、閉じ込められた器官であり、遺伝子治療の理想的なターゲットとなっています。近年、網膜症の遺伝子治療には、網膜および網膜色素上皮(RPE)への非ウイルス性およびウイルス性遺伝子送達を用いた様々な戦略が応用されている。網膜下注射は、ウイルスベクターをRPE細胞に直接送達するための最良のアプローチです。遺伝子治療の臨床試験の前に、さまざまな網膜症の動物モデルで治療の有効性を検証することは避けられません。このように、マウスへの網膜下注射は、眼の遺伝子治療の基本的な技術となります。このプロトコルでは、実験マウスへのウイルスベクターの網膜下注射のための簡単で複製可能な技術を提供します。この技術は、眼科クリニックで広く使用されている技術である硝子体内注射から変更されています。RPE/脈絡膜/強膜複合体フラットマウントの代表的な結果は、この技術の有効性を理解し、遺伝子導入の程度に合わせてウイルスベクターの量と力価を調整するのに役立ちます。

このプロトコルにより、ウイルスの遺伝子導入の網膜下注射の有効性を評価するために、我々は、インジケータ用GFPおよびRFPの両方を発現するCMVプロモーターを有する市販のLVベクターを使用していました。目は研究目的に応じて適切な期間の後に摘出しました。代表的な結果を得るためには、目が網膜下注射後10週および20週に摘出しました。上述の方法を用いて網膜を完全に除去した後、RPE /脈絡膜/強膜複合体の平らなマウントは、蛍光顕微鏡下で評価しました。代表的な結果を図3（a）（網膜の完全な除去との良好な例）および図3B（無傷の網膜と悪い例）に示しました。 RPE層の上に残存神経網膜（特に光受容体の外節）の存在はRPEにおける遺伝子送達の領域を分析するために干渉しなかったが、それは、GFP / RFPおよび阻害し、直接visuaの蛍光をブロックさらなる分析のためにRPE層のlization。従って、RPE /脈絡膜/強膜複合体からの神経網膜の完全な除去は、より良い結果を提供するであろう。 <img alt="図3" src="...

網膜下注射は、マウスの眼の網膜色素上皮に効果的な遺伝子送達を行うための外科的技術です。 ここでは、実験マウスでウイルスベクターを網膜色素上皮に網膜下注射するための簡単で再現可能な方法について説明します。

The eye is a small and enclosed organ which makes it an ideal target for gene therapy. Recently various strategies have been applied to gene therapy in ...

この手順の全体的な目的は、生存しているマウスの網膜色素上皮に標的遺伝子を導入することです。まず、まぶたを開き、眼球を突出させて赤道を露出させることでこれを達成します。次のステップは、角膜輪後方に小さな穴を開けることです。鈍端針を用いてウイルスベクターを網膜下腔に注入し、網膜下水疱の形成を確認します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、注入したウイルスによって導入された蛍光マーカーが網膜色素上皮で発現していることを示します。本手法は、網膜色素上皮へのウイルスベクター網膜下注入における、効率的で簡便な手法です。網膜下注射試験は実施が困難であるため、本手法を視覚的に実演することが極めて重要です。初心者の方は、まず、エチレンオキサイドガスで滅菌した33ゲージの鈍端針付きマイクロリッターシリンジを準備してください。次に、マイクロ遠心チューブ内でウイルスベクターをPBSで希釈し、力価が約100万unit/µLになるように調製します。次に、シリンジに充填する際、溶液で数回フラッシュしてシリンジ内のデッドスペースを取り除きます。ウイルスベクター注入用に、1.5〜2µLを準備します。成人マウスをジアゼパムと生理食塩水の腹腔内投与により麻酔し、反射の消失によって麻酔状態であることを確認します。麻酔を確認後、0.5%フェニレフリンおよび0.5%イプラトロピウムを1滴点眼して瞳孔を散瞳させます。次に、手術用顕微鏡下で眼瞼を開き、眼球を突出させて赤道を露出させます。眼窩縁の外側に指を置くことで、眼球をこの位置に固定します。次に、角膜表面に眼科用粘弾性溶液を塗布し、角膜の上に小さな円形カバーガラスを配置します。これにより、右眼では輪部よりわずかに後方かつ下方から、左眼では上方から網膜を観察することができます。滅菌済みの30ゲージのハーフニードルを用いて、側方または鼻側に小さな穿刺孔を作成します。孔は覆うことが困難なため、適切な選択肢ではありません。穿刺の際は、輪部血管や水晶体に当たらないように注意し、網膜下注射を行う際にニードルのシャフト全体を挿入しないでください。ベクトル注入針を、虹彩面に対して45度の角度で孔に通します。針を乳頭周囲領域に向かって後方に押し込みます。マークされた経路に従って硝子体腔を通過させます。軽い抵抗を感じるまで、針を網膜下腔へと進めます。この抵抗は、RPE層に到達したことを示しています。針は潜在的な網膜下腔に配置されるべきであるため、過剰な圧力をかけて強膜組織を貫通させないように注意してください。過剰な力で針が強膜組織を穿刺した場合、抵抗なく眼窩外腔に進入してしまいます。その後、ウイルスベクターを網膜下腔にゆっくりと注入します。組織の損傷を防ぐことは非常に重要であるため、針を動かさないように静止させます。その後、同様に慎重に針を抜きます。これで眼球を取り出すことができます。ベクターの蓄積を示す網膜下ブレビング（blabbing）が確認できるはずです。最後に、まぶたをそっと閉じて注入部位を覆います。注入孔は自然に閉鎖します。遺伝子導入を評価するため、二酸化炭素による安楽死でマウスを犠牲にし、死亡を確認します。鋏を用いて眼球を摘出してください。眼球を4% PFAで4 °Cにて、少なくとも1時間、できれば数日間固定します。ピンセットとマイクロ鋏を用いて角膜を把持し、穿孔させます。その後、角膜除去に続き、角膜輪部に沿って切開し、角膜を取り除きます。ピンセットを用いて水晶体を取り除きます。次に、毛様体をトリミングします。続いて、網膜を剥離した後、RPE-脈絡膜-強膜複合体から網膜全体を引き離します。複合体を周辺部から視神経付近の中心に向かって放射状に切断し、4～8枚の花びらのような形状にすることで、マウントに適した平坦な構造にします。次に、複合体を裏返しにしてRPE側を下向きにし、筋肉、結膜、視神経を含む強膜側の残りの組織を切り取り除去します。これにより、ガラススライド上でより平坦なRPE-脈絡膜-強膜複合体のフラットマウントを作成できます。余分なPBSは吸収スポンジで吸収させてください。封入剤を約30 µL滴下し、カバーガラスで複合体を封入します。観察していない間は、スライドを4 °Cで保存してください。上述のプロトコルを用いて、GFPとRFPの両方を発現するCMVプロモーターを備えた市販のLVベクターを注入しました。10週間後に眼球を摘出し、RPEフラットマウント標本を作製した。GFPおよびRFPの信号強度は注入部位のRPE細胞間で異なり、形質導入は注入時の出血が認められた領域に限定されていた。倍率を4倍から400倍に上げることで、Iの病理学的評価をより高い解像度で行うことが可能となった。ここでは示していませんが、導入された細胞は注入から36週間後でもベクターを発現していました。一度習得すれば、適切に実施することでこの手法は5分で完了させることができます。本手順を行う際は、網膜下腔が形成された後に、針を慎重かつ正確に挿入することを忘れないでください。この手法により、眼科学分野の研究者が、先天性単一遺伝性疾患や加齢黄斑変性の治療に向けた遺伝子治療を探求する道が開かれました。

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Research

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神経科学

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マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

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