マウス網膜色素上皮における遺伝子治療用ウイルスベクターの縁アプローチ、網膜下注射

この手順の全体的な目標は、生きているマウスの網膜色素上皮に標的遺伝子を送達することです。これは、最初にまぶたを開き、眼球を突き出して赤道を露出させることによって達成されます。次のステップは、輪部の後方に小さな穴を開けることです。

鈍い針からウイルスベクターを網膜下腔に注入し、網膜下ブレブの形成を観察します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法を使用して、網膜色素上皮に注入されたウイルスによって送達される蛍光マーカーの発現を示します。これは、ウイルスベクターを網膜色素に網膜下注射するための脳波および便利な技術です。

上皮 この方法の視覚的なデモンストレーションは、網膜下注射検査が肺に難しいため、非常に重要です。初心者向け。まず、エチレンオキシドガスを使用して滅菌する33ゲージの鈍い針でマイクロリットルの注射器を準備します。

次に、ウイルスベクターをPBSに希釈し、マイクロフュージチューブ内でマイクロリットルあたり約100万力価単位で調製します。ここで、シリンジをロードするときは、溶液で数回洗い流して、シリンジのデッドスペースを取り除きます。ウイルスベクター注射で1.5〜2マイクロリットルを注入する準備をします。

lena diazepamの腹腔内注射で成体マウスを麻酔し、slayeは、動物が反射の欠如によって麻酔されたことを確認しました。麻酔が確認されたら、0.5%フェニレフリンと0.5%ideを滴下して瞳孔を拡張します 次に、手術顕微鏡の下で、まぶたを開いて目を突き出します。赤道を公開するため。

指を眼窩縁の外側に置いて、この位置に目を保持します。次に、眼科用粘弾性溶液を角膜表面に塗布し、角膜の上に小さな丸いカバースライドを置きます。したがって、網膜は、現在、辺縁部のわずかに後方に、右眼では下方に、または左眼では上方に見ることができます。

滅菌済みの30ゲージハーフニードルを使用して、一時的に配置された、または鼻に配置された小さな穴を開けます。穴はカバーするのが難しいため、良い選択ではありません。穿刺中は、辺縁血管や水晶体に当たったり、針の戦い全体を挿入したりしないでください網膜下注射用。

ベクトル注入針を虹彩面に対して45度の角度で穴に挿入します。針を乳頭周囲に向かって後方に押します。示された経路をたどって、硝子体腔を横切ります。

RPE層に到達したことを示す軽度の抵抗が感じられるまで、針を網膜下腔に近づけます針は、針が潜在的な網膜下空間に配置されるべきであるため、過度の圧力で強膜組織を貫通しないでください。針が過剰な力で核組織に穴を開けると、抵抗なく眼球外眼窩腔に入ります。次に、ウイルスベクターを網膜下腔に穏やかに注入します。

組織の損傷を防ぐために、針を非常に動かさないでください。次に、針を同じように優しく引き抜きます。これで眼球を解放できます。

ベクター蓄積を示す網膜下ブラビングが見えるはずです。最後に、まぶたをそっと閉じて注射部位を覆います。穴のセルフシールが発生します。

遺伝子送達を評価するには、二酸化炭素窒息法を用いてマウスを生贄に供し、安楽死が確認された後である。ハサミで目を核形成します。4°Cの4%PFAに目を少なくとも1時間、できれば数日後に固定します。

鉗子とマイクロハサミを使用して角膜をつかみ、穴を開けます。次に、角膜の除去に続いて角膜を除去するために、リンバスに沿ってcuします。鉗子を使用してレンズを取り外します。

次に、毛様体をトリミングします。次に、網膜を切除した後、RPE Choroid Sclera 複合体から網膜全体を引き出します。複合体を視神経付近の周辺から中心まで放射状に切断して、4〜8ペダルのような形状にし、取り付け用に構造を平らにします。

次に、複合体をRPE側を下にして、筋肉、結膜、視神経など、強膜側に残っている組織をすべて切り取ります。これにより、RPE Cortスクレラルコンプレックスをスライドガラス上にフラットマウントすることができます。余分なPBSを吸収スポンジで吸収します。

約30マイクロリットルの封入剤を塗布し、複合体をスリップします。スライドは、表示しないときは摂氏4度で保管してください。記載されたプロトコルを使用して、GFPおよびRFPの両方を発現するCMVプロモーターを有する市販のLVベクターを注入した。

10週間後に眼球を除核し、RPEフラットマウントスライドを作製しました。GFPとRFPのシグナル強度は、注射部位のRPE細胞間で異なり、形質導入は注射血液が形成された領域に限定されていました。倍率をDXの4倍から400倍に増やすことで、Iの病理をさらに高分解能で評価することが可能になりました。

ここには示されていませんが、形質導入された細胞は、注入後36週間でもベクターを発現しています。1つはマスター。この手法は、適切に実行すれば5分で実行できます。

この手順を試みるときは、針を配置するか、創造的に網膜下空間に配置することを覚えておくことが重要です その開発後。この技術は、眼科の研究者が出生、単一遺伝子遺伝性障害、および加齢性黄斑変性症の治療のための遺伝子治療を探求する道を開きました。