網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法経由で経強後方アプローチ
December 7th, 2016
網膜下注射は、タンパク質やウイルスベクターなどの大きな治療薬を光受容体や網膜色素上皮に送達するための最も一般的な技術です。ここでは、付随的な損傷を最小限に抑え、迅速な回復時間で網膜下腔をうまく標的とするマウスの代替方法について説明します。
この研究の全体的な目標は、ウイルスベクター、薬理学的薬剤を標的とするため、またはマウスの網膜下空間に多能性幹細胞を誘導するために使用できる新しい網膜下注射技術を説明することです。この方法は、網膜変性症に対する新規治療介入の有効性の評価など、視覚科学および眼科分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、高い有効性、最小限の損傷、および網膜の構造と機能の迅速な回復を伴って、網膜下腔に材料を送達するために使用できることです。
手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるSachin Pです。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスのひげをトリミングして視覚化を容易にし、循環水パッドを使用して動物の体温を摂氏37度に保ちます。次に、2.5%フェニレフリン点眼薬で瞳孔を拡張します。
その後、メチルセルロース点眼薬を塗布して乾燥を防ぎ、麻酔薬による一過性白内障を最小限に抑えます。手術前に器具を滅菌してください。その後、希釈したフルオレセインをバイオセーフティキャビネットで調製します。
シリンジに適切な量のフルオレセインを入れます。.次に、つま先をつまんで動物が深く麻酔されていることを確認し、注入する目が上を向いて解剖顕微鏡ではっきりと見えるようにマウスを配置します。側頭結膜を先端の細い鉗子で優しくつまみます。
次に、湾曲したVannas'shirsを使用して約90度の円周方向の切開を行います。下にあるほぞのカプセルで手順を繰り返します。その後、球体を鼻で回転させながら、先端の細い鉗子で周囲の結合の問題を切除します。
視神経から約0.5ミリメートル離れた注射部位に向かって作業し、眼窩後洞を乱さないように細心の注意を払います。重要なステップは、眼球自体や関連する構造を損傷することなく、眼窩の血液嚢への損傷を避けることなく、眼の回転を必要とする注射部位を露出させることです。この手順では、22.5度の眼科用ブレードでアイカップを優しく引っ掻くことにより、注射部位の強膜に小さな切開を行います。
この切開部は、針の先端が強膜を通過できる程度の大きさにする必要があります。次に、斜角のある33ゲージの針を強膜切開に挿入し、斜角を網膜と平行に向けます。プランジャーを均等な圧力でゆっくりと押して、必要な量の0.01%フルオレセインを注入します。
針が網膜下腔にある場合、プランジャーを押すときにわずかな抵抗が感じられることに注意してください。針が網膜に穴を開ける場合は抵抗はありませんが、針が強膜やRPEを貫通しない場合は抵抗が大きくなります。もう一つの重要なステップは、網膜下腔を標的とした注射です。
これは、神経感覚網膜を貫通して硝子体腔に侵入することなく達成されなければなりません。逆流を最小限に抑えるために、針を引き抜く前に数秒待ってください。その後、滅菌生理食塩水で目をすすぎ、目が正常な位置に戻ったことを確認します。
次に、トリプル抗生物質眼科用クリームの厚いコートを注射した目の角膜表面に塗ります。その後、マウスを清潔な孤独なケージに入れて回復させます。麻酔回復中にその呼吸と温度を監視し、胸骨の横臥を維持できることを確認します。
術後の痛み管理のために、カルプロフェンの皮下注射を含む、追加の適切な術後モニタリングと治療を行います。こちらは、注入部位のドーム状のブレブを3Dで再現したものです。次に、ドーム型のブレブを濃い白で塗りつぶして、網膜剥離の程度と縁を示します。
OCTの網膜断面は白く見えますが、RPEと光受容体のレベルで液体で満たされた空間は黒く見えます。そして、この図では、最大網膜剥離部位での代表的なOCTBスキャンが、注射前、注射後10分、および注射後4週間で示されています。この画像は、0.3マイクロリットルの注入によるフラットブレブの形成と分解能を示しています。
また、この画像は0.5マイクロリットルの注入によるドーム型ブレブの形成と分解能を示していますが、この画像は1マイクロリットルの注入によるドーム型ブレブの形成と分解能を示しています。最後に、注射部位での重度の脈絡膜瘢痕化と網膜菲薄化の例を紹介します。網膜はブレブ解消後も正常な機能を保持します。
9 回の照明強度で、0.3 マイクロリットル、0.5 マイクロリットル、および 1 マイクロリットルの注入前と注入後 4 週間の暗所視棒媒介反応の波形が示されています。一度習得すると、このテクニックは片目につき10〜15分で完了することができます。この手順を試みるときは、開始する前に目の健康状態を評価することが重要です。
角膜や水晶体の混濁がある目、またはこの手順が非常に難しい深い目は除外します。この手順に続いて、OCTや眼底イメージングなどの他の方法を実行して、注射の品質を評価することができます。
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概要
この研究は、マウスの網膜下腔に治療薬を送達するための新しい網膜下注射技術を説明しています。この方法は、網膜の構造と機能の迅速な回復を確保しながら、付随的な損傷を最小限に抑えることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 視覚科学
- 眼科学
背景
- 網膜下注射は一般的に治療薬の送達に使用されています。
- 既存の方法は付随的な損傷や長期の回復時間を引き起こす可能性があります。
- この研究は、改善された結果を持つ代替技術を提示しています。
研究の目的
- 網膜下注射の新しい技術を説明すること。
- 網膜変性に対する治療介入の有効性を評価すること。
- ウイルスベクターや薬理学的薬剤の送達を促進すること。
使用した方法
- 可視化のために麻酔状態のマウスのひげを整えます。
- 循環水パッドを使用して体温を摂氏37度に保ちます。
- 2.5%のフェニレフリン点眼薬で瞳孔を開大させます。
- 訓練を受けた技術者が手順を実演します。
主な結果
- この技術は材料の送達に高い効果を発揮します。
- 網膜構造への損傷は最小限に抑えられます。
- 網膜機能の迅速な回復が達成されます。
結論
- この新しい網膜下注射技術は研究に有効です。
- 眼科学における治療戦略を進展させる可能性を秘めています。
- さらなる研究で網膜変性における応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This transcleral posterior subretinal injection method addresses a key challenge in preclinical ophthalmology: delivering therapeutic agents to the subretinal space while minimizing surgical trauma and preserving retinal integrity. By avoiding retinal penetration and vitreous disruption, the technique enables more accurate assessment of drug efficacy in rodent models of retinal degeneration. This supports de-risking of target validation and lead identification efforts in vision science pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables precise delivery of viral vectors, pharmacological agents, or stem cells to the subretinal space for functional target validation in retinal disease models.
- Operational Value: Minimizes confounding tissue damage, allowing clearer interpretation of therapeutic effects on photoreceptors and RPE.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces consistent, reproducible subretinal delivery with quantifiable outcomes via OCT and fundus imaging.
- Operational Value: Standardizes injection depth and location (0.5 mm from optic nerve), reducing variability across experiments and operators.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports longitudinal assessment of retinal structure and function due to rapid retinal reattachment and minimal chronic scarring.
- Operational Value: Compatible with postoperative monitoring using OCT, fundus imaging, and ERG to evaluate therapeutic durability.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by enabling reliable delivery of candidate therapeutics to the subretinal space, a critical step before efficacy testing in degenerative retinal models.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing targeted delivery of agents to interrogate retinal pathways and cell-specific functions.
- Screening: Enables standardized preparation of disease models for compound screening with minimal procedural failure.
- Analytics: Generates clear OCT- and fundus-based readouts to quantify retinal detachment resolution and functional recovery over time.
- Translational Research: Supports continuity from discovery to preclinical validation by preserving retinal architecture for accurate biomarker and functional assessments.
- Enterprise Reuse: Reusable across studies involving viral vectors, proteins, or cell-based therapies for retinal degeneration.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing surgical artifacts that could mask or mimic therapeutic effects.
- Operational Value: Short procedure time (10–15 minutes per eye) and low failure rate improve throughput in preclinical studies.
- Strategic Value: Reduces biological noise in efficacy data, supporting better go/no-go decisions in target prioritization.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of retinal therapeutics by providing cleaner preclinical data on mechanism and durability.
Implementation Considerations
- Requires microsurgical expertise and fine motor control for sclerotomy and needle placement.
- Dependent on specialized instrumentation including Vannas scissors, 22.5° ophthalmic blade, and 33-gauge beveled needle.
- Necessitates standardized postoperative care including antibiotics, analgesics, and monitoring for retinal reattachment.
- Adaptation to other model systems may require adjustment of incision size and needle angle based on ocular anatomy.
- Limited to posterior segment access; not suitable for anterior segment or intravitreal delivery applications.
