網膜下腔にアクセスするための代替と検証済みの注入方法経由で経強後方アプローチ

この研究の全体的な目標は、ウイルスベクター、薬理学的薬剤を標的とするため、またはマウスの網膜下空間に多能性幹細胞を誘導するために使用できる新しい網膜下注射技術を説明することです。この方法は、網膜変性症に対する新規治療介入の有効性の評価など、視覚科学および眼科分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、高い有効性、最小限の損傷、および網膜の構造と機能の迅速な回復を伴って、網膜下腔に材料を送達するために使用できることです。

手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるSachin Pです。この手順を開始するには、麻酔をかけたマウスのひげをトリミングして視覚化を容易にし、循環水パッドを使用して動物の体温を摂氏37度に保ちます。次に、2.5%フェニレフリン点眼薬で瞳孔を拡張します。

その後、メチルセルロース点眼薬を塗布して乾燥を防ぎ、麻酔薬による一過性白内障を最小限に抑えます。手術前に器具を滅菌してください。その後、希釈したフルオレセインをバイオセーフティキャビネットで調製します。

シリンジに適切な量のフルオレセインを入れます。.次に、つま先をつまんで動物が深く麻酔されていることを確認し、注入する目が上を向いて解剖顕微鏡ではっきりと見えるようにマウスを配置します。側頭結膜を先端の細い鉗子で優しくつまみます。

次に、湾曲したVannas'shirsを使用して約90度の円周方向の切開を行います。下にあるほぞのカプセルで手順を繰り返します。その後、球体を鼻で回転させながら、先端の細い鉗子で周囲の結合の問題を切除します。

視神経から約0.5ミリメートル離れた注射部位に向かって作業し、眼窩後洞を乱さないように細心の注意を払います。重要なステップは、眼球自体や関連する構造を損傷することなく、眼窩の血液嚢への損傷を避けることなく、眼の回転を必要とする注射部位を露出させることです。この手順では、22.5度の眼科用ブレードでアイカップを優しく引っ掻くことにより、注射部位の強膜に小さな切開を行います。

この切開部は、針の先端が強膜を通過できる程度の大きさにする必要があります。次に、斜角のある33ゲージの針を強膜切開に挿入し、斜角を網膜と平行に向けます。プランジャーを均等な圧力でゆっくりと押して、必要な量の0.01%フルオレセインを注入します。

針が網膜下腔にある場合、プランジャーを押すときにわずかな抵抗が感じられることに注意してください。針が網膜に穴を開ける場合は抵抗はありませんが、針が強膜やRPEを貫通しない場合は抵抗が大きくなります。もう一つの重要なステップは、網膜下腔を標的とした注射です。

これは、神経感覚網膜を貫通して硝子体腔に侵入することなく達成されなければなりません。逆流を最小限に抑えるために、針を引き抜く前に数秒待ってください。その後、滅菌生理食塩水で目をすすぎ、目が正常な位置に戻ったことを確認します。

次に、トリプル抗生物質眼科用クリームの厚いコートを注射した目の角膜表面に塗ります。その後、マウスを清潔な孤独なケージに入れて回復させます。麻酔回復中にその呼吸と温度を監視し、胸骨の横臥を維持できることを確認します。

術後の痛み管理のために、カルプロフェンの皮下注射を含む、追加の適切な術後モニタリングと治療を行います。こちらは、注入部位のドーム状のブレブを3Dで再現したものです。次に、ドーム型のブレブを濃い白で塗りつぶして、網膜剥離の程度と縁を示します。

OCTの網膜断面は白く見えますが、RPEと光受容体のレベルで液体で満たされた空間は黒く見えます。そして、この図では、最大網膜剥離部位での代表的なOCTBスキャンが、注射前、注射後10分、および注射後4週間で示されています。この画像は、0.3マイクロリットルの注入によるフラットブレブの形成と分解能を示しています。

また、この画像は0.5マイクロリットルの注入によるドーム型ブレブの形成と分解能を示していますが、この画像は1マイクロリットルの注入によるドーム型ブレブの形成と分解能を示しています。最後に、注射部位での重度の脈絡膜瘢痕化と網膜菲薄化の例を紹介します。網膜はブレブ解消後も正常な機能を保持します。

9 回の照明強度で、0.3 マイクロリットル、0.5 マイクロリットル、および 1 マイクロリットルの注入前と注入後 4 週間の暗所視棒媒介反応の波形が示されています。一度習得すると、このテクニックは片目につき10〜15分で完了することができます。この手順を試みるときは、開始する前に目の健康状態を評価することが重要です。

角膜や水晶体の混濁がある目、またはこの手順が非常に難しい深い目は除外します。この手順に続いて、OCTや眼底イメージングなどの他の方法を実行して、注射の品質を評価することができます。