マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

この手順の全体的な目的は、発達中の三叉神経節と歯胚を単離し、共培養する方法を示すことです。まず、マイクロ流体デバイスの滅菌、マウント、およびコーティングを行います。次に、目的のマウスの特定の発生段階から三叉神経節と歯胚を摘出します。

次に、三叉神経節と歯胚をマイクロ流体デバイスに配置し、共培養します。最終ステップとして、細胞を固定し、免疫蛍光染色を行います。最終的に、顕微鏡を用いて共培養の結果として得られた神経支配パターンを確認します。

従来の共培養などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、異なる臓器や組織を、それぞれに最適な培養液を用いて共培養できる点にあります。この手法は、歯の形成におけるさまざまな分子の役割や、歯の発生における形成の規則性など、人工的な形態形成の分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。まず、マイクロ解剖用ピンセットと鋏を含む解剖器具をオートクレーブで滅菌します。

次に、24 mm × 24 mmのガラスカバースリップの一群を、1 Mの塩酸溶液に入れ、オービタルシェーカーを用いて37 °Cで24時間処理し、滅菌します。その後、カバースリップを滅菌蒸留水で3回洗浄し、続いて99%エタノールで3回すすぎます。滅菌フローフード内で乾燥させ、乾燥後、フードのUVライトを30分間点灯させます。その後、使用時までカバースリップを70%エタノール中で保存します。

次に、滅菌済みピンセットを使用して、軸索分離マイクロ流体デバイスをパッケージから慎重に取り出し、滅菌済みの1mmバイオプシーパンチを用いて、滅菌済みペトリ皿に配置します。培養チャンバーに対応するように、サンプル1つにつきデバイスに1つの穴を開けます。

圧力によってマイクログルーブが損傷する可能性があるため、その近くをパンチしないように注意してください。次に、デバイスを70% ethanolに浸して滅菌します。その際、内部に空気が残らないように注意してください。

次に、デバイスをエタノールから取り出し、無菌フローフード内で完全に乾燥させます。同様に、カバーガラスを70% ethanol溶液から取り出し、無菌フローフード内で乾燥させます。次の工程に進む前に、最低3時間待ちます。

各カバーガラスを6ウェルプレートの各ウェルに入れます。次に、マイクロ流体デバイスをカバーガラスの上に置き、ピンセットで優しく、かつしっかりと押し付けて、分離デバイスとガラスカバーガラスを完全に密着させます。続いて、各培養チャンバーに0.1 mg/mLのポリDリシンを150 µLずつピペットで分注します。

次に、マイクロ流体デバイスを5分間真空状態に置き、チャンバー内からすべての空気を除去します。チャンバー内にまだ空気が見られる場合は、ポリDリシン溶液を再度チャンバーに注入してください。

デバイスをpoly-D-lysineとともに37°Cで一晩インキュベートし、翌日に、チャンバーを滅菌蒸留水で3回洗浄します。次に、5 µg/mLのlaminワーキングソリューション150 µLをチャンバーに満たし、37°Cで一晩インキュベートします。続いて、付随するテキストプロトコルに従い、三叉神経節および歯胚培養用の培地を調製します。

解剖エリアと実体顕微鏡を 70% ethanol で清掃し、安楽死させたマウスの解剖器具を準備します。胚ステージが E 14.5 から E 17.5 のpregnant mouse の下腹部周囲の皮膚を切り開きます。その後、ハサミを使用して慎重に腹腔を開きます。

子宮を特定して摘出し、氷を満たしたチューブに入れます。冷えたPBSを用いて胚を剥離し、氷冷PBSを満たした新しいシャーレに個別に移します。すべての胚を胚外組織から取り出した後、はさみを用いて脱頭します。

マイクロダイセクション用ハサミを用いて、三叉神経節を傷つけないように注意しながら、下顎を頭部の残りの部分から分離します。次に、頭部を取り出し、冷却した解剖用ガラスシャーレの上に置きます。ピンセットを使用して、皮膚と頭蓋骨を除去します。

次に、鉗子を頭部に差し込み、持ち上げます。頭部と小脳を取り出すには、三叉神経節を特定し、鉗子と解剖針を用いて三叉神経節を三叉神経から分離して、神経節を洗浄します。解剖針をナイフとして使用し、冷PBS中で保存します。

舌と顎周囲の皮膚を取り除きます。顎の中央線に沿って切開し、左側と右側の半顎を分離します。次に歯胚を確認し、解剖針を用いて単離します。三叉神経節と歯胚の解剖後、マイクロ流体デバイスからラミニンを除去し、各チャンバーにそれぞれの培地を200 microliters充填します。

ピンセットを用いて、摘出した三叉神経節と歯胚をバイオプシーパンチで作成した穴に慎重に移植します。このとき、歯胚が浮いていないことを確認し、カバーガラスに接触するまで沈ませてください。サンプルを37°C、5% CO2のインキュベーター内で培養します。

培地を交換するため、10日間にわたり48時間ごとに培養液を交換します。まず、ピペットをウェルの外側に向けて培地を除去します。次に、培養期間中、チャンバーとは反対側のウェル壁面に、あらかじめ温めておいた新鮮な培地を添加します。

光学顕微鏡を用いて、任意のタイミングで共培養系のイメージングを行います。培養期間終了後、各チャンバーのウェルに150 µLのPBSをピペッティングし、PBSをチャンバー内に流して洗浄します。最後の洗浄を含め、計3回洗浄を繰り返します。

PBSを除去し、各チャンバーの1つのウェルに4%パラホルムアルデヒド（PBS溶液）を150 µLピペッティングして別のチャンバーへ流し込むことで、サンプルを固定します。デバイスを室温で15分間インキュベートします。その後、チャンバーをPBSで2回洗浄し、免疫蛍光染色やアウトグロースのイメージングなどのさらなる解析に進みます。

共培養において、三叉神経節からの神経突起は培養コンパートメントから分枝し、発達中の歯胚に向かって伸展します。高倍率で観察すると、マイクロ流体デバイス内の軸索チャンバーおよびマイクログルーブを通って伸展する神経突起を確認できます。神経成長の経過を時間経過とともに追跡することで、神経支配の発達過程を記述することが可能です。

この手順の後、例えば、導入後の標的組織における遺伝子発現やタンパク質分泌の変化を調べるために、RNA解析やタンパク質分析などの他の手法を実施することができます。