マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

この手順の全体的な目標は、発生中の三叉神経節と歯の細菌を分離し、共培養する方法を示すことです。これは、最初にマイクロ流体デバイスを滅菌、取り付け、コーティングすることによって達成されます。2番目のステップは、目的のマウスの特定の発生段階から三叉神経節と歯の細菌を解剖することです。

次に、三叉神経節と歯の細菌をマイクロ流体デバイスに入れ、共培養します。最後のステップは、細胞を固定し、免疫蛍光法を使用して染色することです。最終的に、顕微鏡検査は、共培養の結果である神経支配パターンを示すために使用されます。

従来の共培養などの既存の方法のこの技術の主な利点は、この方法により、それぞれ独自の最適な培養で異なる臓器や組織の共培養が可能になることです。中程度。この方法は、歯のイノベーションにおけるさまざまな分子の役割や、歯の発達におけるイノベーションの法則など、人工イノベーションの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、マイクロダイセクション鉗子とハサミなどの解剖ツールをオートクレーブします。

次に、24ミリメートル×24ミリメートルのガラスカバースリップのバッチを、摂氏37度のオービタルシェーカー上の1モル塩酸の溶液に24時間入れて滅菌します。次に、カバースリップを滅菌蒸留水で3回洗い、続いて99%エタノールで3回すすぎ、乾燥したら滅菌フローフードの下で乾燥させ、フードUVライトを30分間オンにします。次に、カバースリップが必要になるまで70%エタノールで保管します。

次に、滅菌鉗子を使用して、軸索分離マイクロ流体デバイスをパッケージから慎重に取り出し、滅菌1ミリメートル生検パンチを使用して滅菌ペトリ皿に入れます。サンプルごとにデバイスに 1 つの穴を作成します。文化室の対応で。

マイクログルーブに近づきすぎると、圧力によって損傷する可能性があるため、注意してください。次に、デバイスを70%エタノールで出現させて滅菌します。閉じ込められた空気をすべて取り除くように注意してください。

次に、デバイスをエタノールから取り出し、滅菌フローフードの下で完全に乾燥させます。また、70%エタノール溶液からカバースリップを取り出し、滅菌フローフードの下で乾燥させます。3時間以上待ってからお進みください。

各カバースリップを6ウェルプレート内のウェルに入れます。次に、マイクロ流体デバイスをカバースリップに置き、鉗子で優しくしっかりと押して、アイソレーションデバイスとガラスカバースリップが完全に接着できるようにします。次に、0.1ミリグラム/ミリリットルの150マイクロリットルをピペットで、ポリDリシネを各培養室に注入する。

次に、マイクロ流体デバイスを5分間真空下に置き、チャンバーからすべての空気を取り除きます。チャンバー内にまだ空気が見える場合。ポリDリジン溶液をチャンバーに繰り返します。

、デバイスをポリデリジンと摂氏37度で一晩インキュベートします。滅菌蒸留水でチャンバーを3回洗浄し、次にチャンバーに1ミリリットルあたり5マイクログラムの150マイクロリットル、ラミン作動溶液を充填し、摂氏37度で一晩インキュベートします。次に、添付のテキストプロトコルに記載されているように、三叉神経節および歯の胚芽培養のための修復培地。

解剖領域とステレオスコープをエタノール70%で洗浄し、犠牲に続いて解剖器具を配置します。ステージE 14.5からE 17.5のマウス胚を持つ妊娠中のマウスの下腹部の周りの皮膚を解剖します。次に、はさみを使用して腹部を慎重に開きます。

子宮の位置を特定し、それを取り除き、氷で満たされたチューブに入れます。冷たいPBSは胚を解剖し、氷のように冷たいPBSで満たされた新しいペトリ皿に個別に配置します。すべての胚が余分な胚組織から取り除かれたら、はさみを使用してそれらを斬首します。

マイクロダイセクション、ハサミを使用して、三叉神経節を損傷しないように注意しながら、下顎を頭の残りの部分から分離します。次に、頭を取り、冷やした解剖ガラスのペトリ皿に置きます。鉗子を使用して、皮膚と頭蓋骨を取り除きます。

次に、鉗子をセファロンの下に置き、持ち上げます。頭蓋神経節と小脳を切除するには、三叉神経節を局在化し、鉗子と解剖針を使用して三叉神経節を三叉神経節から分離し、神経節を清掃します。解剖針をナイフとして使用して、冷たいPBSで保存します。

舌と顎の周りの皮膚を取り除きます。顎の正中線に沿って切断することにより、左右の半顎を分離します。次に、歯の細菌を特定し、三叉神経節と歯の細菌を解剖した後、解剖針を使用してそれらを分離し、マイクロ流体デバイスからラミニンを除去し、チャンバーに200マイクロリットルのそれぞれの媒体を満たします。

鉗子を使用して、解剖された三叉神経節と歯の細菌を生検パンチでできた穴にそっと移します。歯の細菌が浮かばないようにし、カバースリップに接触するまで沈むことを確認してください。培養、サンプルを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで培養します。

培地を交換するには、10日間、48時間ごとに培地を交換します。まず、ピペットをウェルの外側に向けて培地を取り出します。次に、培養期間中にチャンバーの反対側にあるウェルの側面に新鮮な予温培地を追加します。

光学顕微鏡を使用して、いつでも共培養物を画像化できます。培養期間後、150マイクロリットルのPBSを1つのチャンバーにつき1つのウェルにピペットで移し、PBSをチャンバー内に流してチャンバーを洗浄します。最後の洗濯に続いて、合計3回の洗濯を繰り返します。

PBSを取り外し、PBS中の4%パラホルムアルデヒド150マイクロリットルを各チャンバーの1つのウェルにピペットで移動し、もう一方のチャンバーに流すことでサンプルを固定します。デバイスを室温で15分間インキュベートします。次に、チャンバーをPBSで2回洗浄し、免疫蛍光染色や成長物のイメージングなどのさらなる分析に進みます。

石炭栽培中、三叉神経節からの神経突起は、その培養区画から分岐し、発育中の歯の胚芽に向かって伸びます。より高い倍率では、マイクロ流体デバイスの軸索チャンバーと微小溝を通って伸びる神経突起を見ることができます。神経成長の進行を経時的に追跡して、イノベーションの発展を説明することができます。

この手順に続いて、RNAやタンパク質化などの他の方法を実行して、例えば、イノベーション後の標的組織における遺伝子発現やタンパク質分泌の変化を研究することができます。