マイクロ流体デバイスを用いた神経筋接合部の生成

グルーブを介して接続された鏡面コンパートメントを備えた相互接続されたウェルを備えたポリマーコーティングされたマイクロ流体デバイスから始めます。

神経前駆細胞を1つのコンパートメントのウェルに播種します。

それらが相互接続されたチャネルに移動し、ポリマーに付着できるようにします。

運動ニューロンへのニューロンの成熟を促進するために、成長培地と重ね合わせます。

反対側のコンパートメントで、相互接続されたチャネルに移動して付着する筋肉前駆細胞をウェルに播種します。

培地を分化培地に置き換え、筋前駆細胞の融合を誘導し、多核筋細胞を形成します。

成長因子を含むニューロン分化培地を筋細胞含有コンパートメントに加えます。

間、半分の容量の成長因子フリー培地を神経細胞含有コンパートメントに加えます。

成長因子と反対側のコンパートメント内の大量の培地は、運動ニューロンがマイクログルーブを介してそのプロセスを拡張するように促進します。

これらのニューロンプロセスは筋肉細胞と接続し、神経筋接合部を形成します。

マイクロ流体デバイスに神経前駆細胞(NPC)をプレートするには、200マイクロリットルのピペットを使用して、デバイスのマイクロ溝の片側にある2つのウェルからDPBSを除去します。デバイスごとに60〜100マイクロリットルの10日目の運動ニューロン培地に合計250,000人のNPCを右上のウェルに播種するには、細胞懸濁液の半分をチャネル開口部の近くに45度の角度で播種します。

細胞懸濁液の残りの半分を下部ウェルに加える前に、細胞懸濁液がチャネルを流れるように数秒間一時停止します。ペンを使用して、シード面をNPCまたは同等のものとしてマークし、顕微鏡なしでデバイスの向きを簡単に把握し、細胞付着のために5分間インキュベートします。次に、2つのNPC播種ウェルに10日目のモーターニューロン培地を追加して、ウェルあたり200マイクロリットルの総容量までゆっくりと補充します。200マイクロリットルのピペットを使用して、播種したばかりのNPCの反対側のマイクロ溝の反対側にある2つのウェルからDPBSを除去します。

ウェルあたり200マイクロリットルの10日目の運動ニューロン培地を、シードされていないウェルに加えます。次に、インキュベーション中の培地の蒸発を防ぐために、デバイスの周囲の10センチメートルの皿あたり6ミリリットルのDPBSを追加します。

培地を変更するには、200マイクロリットルのピペットチップをチャネル開口部の反対側のウェル壁の下端に配置して、NPCを含む両方のウェルの培地をゆっくりと除去します。強い培地の流れがチャネル内の細胞に損傷を与えるのを防ぐために、上部と下部のウェルの間で連続的に変更することにより、各ウェルに50〜100マイクロリットルの新鮮な運動ニューロン培地をゆっくりと追加します。各ウェルに200マイクロリットルの培地が含まれるまで、このプロセスを繰り返します。

運動ニューロン分化の17日目に、200マイクロリットルのピペットでデバイス内のマイクログルーブの播種されていない側にある運動ニューロン培地を取り除き、ウェルをDPBSで洗浄します。細胞懸濁液の半分を上部ウェルに播種することにより、デバイスあたり60〜100マイクロリットルの増殖培地に合計200,000個のヒト初代中血管芽細胞またはMABを播種します。

濁液がチャネルを通って流れるように数秒間一時停止してから、細胞懸濁液の残りの半分を下部ウェルに播種します。細胞接着のためにデバイスを5分間インキュベートします。次に、MABを播種したばかりの2つのウェルに追加の増殖培地を補充し、実証されているように再度インキュベートします。

運動ニューロン分化の21日目に走化性および体積勾配を開始するには、成長因子を含む運動ニューロン基礎培地のウェルあたり200マイクロリットルを筋管コンパートメントに追加します。次に、成長因子を含まない運動ニューロン基礎培地のウェルあたり100マイクロリットルを運動ニューロンコンパートメントに追加します。