マイクロトロイドの光共振器を用いたラベルフリー単一分子検出

この手順の全体的な目標は、光共振器技術と周波数ロックに基づく技術を使用して、ラベルを使用せずに単一分子および超小型ナノ粒子を検出することです。この方法は、タンパク質のフォールディングや結合速度論などの生化学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標的分子を検出するために標識する必要がないことです。

この手法のセットアップには、マイクロOIDチップを光ファイバーに結合することが含まれます。まず、マイクロOIDチップを入手します。これは、約6.5mm×5.5mmのシリコンチップにマイクロOIDを作製したものです。

この画像のように、マイクロOIDの長径は80〜100マイクロメートル、短径は2マイクロメートルです。とりあえず、チップを結合するためにチップを脇に置き、ファイバーを準備します。スプール上のシングルモードファイバーを操作し、ファイバーの約1メートルを巻き戻します。

ワイヤーストリッパーを入手し、巻き戻し繊維のほぼ中央に置きます。それらを使用して、ポリマーコーティングの2.5センチメートルのセグメントを繊維から剥がします。このストリップ領域は、ファイバーの結合領域です。

繊維を剥がした後、糸くずの出ないワイプとイソプロパノールアルコールを使用して、剥がれた部分を清掃します。次に、磁気クランプ付きのファイバーホルダーを使用して、洗浄された部分を所定の位置に保持します。次のステップでは、ファイバーを反対方向に引っ張るようにステッピングモーターを配置します。

ストッパーモーターをストリップ領域の両側のファイバーに取り付けられるように、ファイバーホルダーを配置します。また、ファイバーの一端にレーザーを取り付けて光源として使用します。ステッピングモーターを反対方向に動かしてファイバーを伸ばし、水素トーチを使用してファイバーの剥がれた部分を溶かします。

ファイバーから横方向に散乱した光を常に監視します。点滅は、ファイバーを通る光の透過率が変動し、さらに細くなる必要があることを示しています。点滅が止まったら、約500ナノメートルまで細くなっていた繊維の加熱と引っ張りを止めます。

ファイバーが細くなったら、光源を取り外し、ファイバーとその磁気クランプホルダーを頑固なモーターから取り外します。次に、ファイバーを位置決めステージを備えた空気圧で隔離されたベンチに移動します。サンプルチップの前の支持ブロックにある磁気クランプホルダーにファイバーを置きます。

位置決めステージは、3軸マイクロメータの上に3軸ナノ位置決めステージを載せたものです。ナノポジショニングステージに加えて、アライメントに役立つ上面図と側面図のイメージングカラムがあります。繊維の被覆を剥がされた部分が位置決め段階の近くにあることを確認して、ファイバーでの作業を続けます。

繊維フリーエンドを測定システムに導入する準備をします。自由端を切断した後、裸のファイバーアダプターに挿入します。アダプターを使用して、オシロスコープに接続された自動バランス写真レシーバーの入力にファイバーを接続します。

次に、ファイバーのもう一方の端に焦点を当てます。まず、この端を光カプラーに取り付けます。次に、ファイバーをインライン偏光子の出力に結合し、インライン偏光子には50 50ビームスプリッターとATT調整可能なダイオードレーザーからの入力があります。

このポイントまでの接続の概略図を次に示します。ビームスプリッターの2番目の出力はインライン偏光子を通過し、オートバランスフォトレシーバーの基準として使用されることに注意してください。次のステップは、ステンレス製のサンプルホルダーを使用してmicro OIDチップを取り付ける準備をすることです。

両面テープを使用して、チップをサンプルホルダーに固定します。次に、マイクロチップをサンプルホルダーの上に置きます。次に、チップをナノポジショニングステージの上にサンプルホルダーを取り付けます。

ここでは、ホルダーとチップが3つのXsマイクロメーターで位置決めステージに配置されています。粗い位置は、サンプルチップを繊維に対して。こちらがコースポジショニング完了後のチップとファイバーです。

次に、ポジショナーをさらに調整し、イメージングカラムを使用してチップを光ファイバーに平行に整列させますファイバーのレーザー波長を持つマイクロOIDを使用すると、この画像はファイバーとマイクロットの画像です。細かい位置決めステップの後、視野の中央付近にある円形のステッカーが位置決め補助です。次に、マイクロの共振波長の検索に移ります。

三角波電圧信号を生成して、レーザー波長を約635ナノメートル±2.5ナノメートルに調整します。次に、波長をスキャンして共振を探します。オシロスコープでファイバーを介した伝送を観察します。

共振波長では、透過率が低下することに注意してください。この時点で、レーザー光の偏光を調整します。インライン偏光コントローラーを調整して、光ファイバー内のレーザー光の偏光を最適化します。

View オシロスコープでフォトレシーバーの出力を表示し、測定された透過率のくぼみが最も狭くなるまで偏光を調整します。分極を最適化した後、サンプルチャンバーを構築します。サンプルステージ上。

チャンバーは、顕微鏡にエポキシ樹脂をスリップしたガラスカバーで構成されています。滑る。スライドはスペーサーとして機能し、カバースリップがチップとファイバーに張り出すことができます。1ミリリットルのシリンジポンプとチューブを配置して、実験サンプルを1分間に1ミリリットルでチャンバーに導入します。

次に、1ミリリットルの室温平衡化サンプルを取り出してポンプにロードします。この場合、5ナノメートルのシリカビーズを含む溶液です。ロードしたら、サンプルチャンバーを観察し、サンプルを注入します チャンバーが満たされると、5ナノメートルのシリカビーズを含む溶液で満たされたこのチャンバーでサンプル注入が停止します。

振動の影響を最小限に抑えるために30秒待った後、マイクロの共振波長を探します。ここでも、オシロスコープを使用して、共振時のファイバを介したディップと伝送を観察します。これは、この時点での実験セットアップの概略図であり、比例積分微分またはPIDコントローラーが含まれています。

積分器とディザ。コントローラを自動ロックモードで実行し、ピークトップをロックします。ディザ周波数を 2 キロヘルツに設定し、波長の振動振幅を 19 フェムトメートルに設定します。

PID設定を経験的に見つけた後、レーザーの波長をマイクロイドの共振波長に自動ロックします。フィードバックコントローラーの出力を記録してデータを収集します。これは、フェムトメートル単位の共鳴シフトの代表的なトレースと、サイズ順に3つの異なる結合粒子を使用したプロトコルで生成された秒単位の時間です。

粒子はエキソソームまたはナノベシクルです。5ナノメートルのシリカビーズとヒトインターロイキン2分子。各データセットの垂直AEと水平AEの両方のスケールが異なることに注意してください。

データで異なる粒子サイズの異なるスケールを観察することは、技術が正しく実行されていることを示しています。粒子がOIDに結合すると、OIDの共振波長が増加し、トレースがステップアップします。粒子が結合解除されると、共鳴波長が減少し、ステップダウンにつながります。

各波長ステップの高さは、粒子のサイズとマイクロイド上の位置によって決まります。タイムスケールは粒子OIDダイナミクスによって決定されます 一度習得すると、この手法は正しく行われれば約3時間で実行できます。この手順を試みるときは、すべてをできるだけ清潔でほこりのない状態に保つことを忘れないでください。