ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

この手順の全体的な目標は、ヒト誘発多能性幹細胞に由来するペラルニューロンから樹状突起スパインを画像化し、それらを3次元で定量化することです。これは、神経幹細胞を培養するために、まず6つのウェルプレートのカバースリップをポリウレタンとラミニンで処理することによって達成されます。次に、培養液で希釈した神経幹細胞。

ミディアムは、穏やかに回転するピペットの動きを使用してメッキされ、培養で最大70日間区別することができます。培地を定期的に更新することにより、細胞にGFPレンチウイルスを形質導入し、抗GFP抗体で染色して視覚化します。最後に、培養物を固定し、樹状突起スパインを共焦点顕微鏡を用いて画像化します。

最終的に、ヒト樹状突起スパインの画像データは、分類と定量化のために3Dで再構築されます。このプロトコルは、人間の脳皮質の第2層から第4層のグルタミン酸作動性ニューロンを取得するための段階的な手順を提供します。これには、以前に発表された方法に基づいて、ヒト線維芽細胞に由来するヒト誘導前効性幹細胞に由来する神経幹細胞の使用が含まれます。

この手法の既存の方法の主な利点は、DON rightとPYを3Dで自動的にセグメンテーションできることです。これにより、通常は2D解析のみで準備する既存のソフトウェアに比べて、かなりの時間短縮が可能になります。分類のdonrとspyは非常に便利で使いやすいです。

ニューロン培養を準備するには、ガラスカバースリップを6つのウェルカルチャーディッシュに入れ、ポリオルニチンを翌日フローフードの下で一晩インキュベートします。DPBSを使用してカバースリップを3回洗浄し、ラミニンを添加してフローフードの下で少なくとも10時間インキュベートします。以下の成分を含む培地を調製します。

次に、培地を使用して神経幹細胞またはNSCSを50、000細胞/平方センチメートルの密度でプレート化し、ディスパッチします。成熟のどの段階でも、新鮮な培地を含む培養ウェルごとに40ナノグラムのGFPレンチウイルスベクターを含むストック溶液1マイクロリットルを追加し、摂氏37度で48時間インキュベートします。免疫蛍光法用の細胞を調製するには、培地を取り出し、4%ホルムアルデヒドを使用して、形質導入した細胞を室温で10分間固定します。

次に、1つのXPBSを使用して、細胞を3回、それぞれ10分間洗浄します。次に、カバースリップを0.05%Triton X 110%horse serumを添加したPBSに浸し、室温で1時間インキュベートします。次に、PBSを使用してカバースリップを3回洗います。

100 μLのPBS 4%馬用血清に1000番目のGFP一次抗体を1枚ずつ各カバースリップに加えます。4°Cの暗い箱で一晩インキュベートします。次に、Alexa Fluor 4 88標識抗体をPBS 0.5%tween 20で1:200に希釈し、PBSを使用してスライドを3回洗浄した後、抗体溶液と室温で1時間細胞をインキュベー

封入剤を使用して、蛍光顕微鏡用のスライドをマウントします。共焦点顕微鏡下で、パラメタル形態と折り畳み樹状突起樹状突起化を使用して、樹状突起あたり60〜100マイクロメートルを定量化するために、条件ごとに少なくとも10個の健康なニューロンを選択します。40 x na、1.3オイル対物レンズ、488ナノメートルレーザーで、サンプルレベルで約20マイクロワットの一般的なピークパワーで画像を取得し、ピクセルサイズを約80ナノメートルに設定して、樹状突起スパインを適切にサンプリングします。

ニューロンの全体積をサンプリングするには、Z間隔が150〜300ナノメートルのZスタックを取得し、20〜30のZスライスを生成して、樹状突起スパインの3D定量化を実行します。前処理用の解析ソフトウェアには、以下の設定を使用します。ガウス フィルタリングを使用するには、画像処理スムージング ガウス フィルターを選択します。

フィルター幅をXY平面のピクセルサイズと等しく設定して、フィラメントトレーサーモジュールから樹状突起の半自動トレースを実行します。スライスタブで、距離ツールを使用して樹状突起の直径を推定します。次に、surpassedタブで、フィラメントツールをクリックし、 自動作成をスキップして堅牢性を向上させる ドロータブで。

ここで、方法として自動パスを選択し、タイプとして樹状突起を選択し、推定された樹状突起の直径を入力します。ポインタの選択モードを使用して、カーソルをボックスに回し、シフトを選択して樹状突起の開始点を右クリックします。ソフトウェアが初期計算を実行します。

次に、始点から樹状突起に沿ってポインターを移動します。最も可能性の高い樹状突起の経路を表す黄色の線が表示されます。Shift キーを押しながら左を押します。

樹状突起のエンドポイントをクリックして、モジュールインターフェースで自動スパインセグメンテーションを実行します。再構築ドロップリストの「作成」タブをクリックします。[樹状突起の直径を再構築] を選択し、[データの保持] ボックスをオンにします。

次に、[再構築] をクリックします。セグメント化されたボリュームが実際の樹状突起のボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして、距離マップから最短距離を選択します。

次に、スライスタブの下の次のボタンをクリックして、最小の背骨、頭の直径、および最大の長さを決定します。次に、 surpass タブで、パラメータ値を入力します 約200〜300ナノメートル 最小直径用、4マイクロメートル 最大長は良いです 開始点 チェックせずに スパインを許可する ボックスをクリックし、次へボタンをクリックします。次に、シード ポイントのしきい値を調整して、スパインを表す青いポイントが実際のスパインの頭に位置するようにします。

次に、[次へ]をクリックします。これでコア計算が実行され、モジュールインターフェースのツールタブでスパインの分類に時間がかかる場合があります。[スパインの分類]をクリックします。テキストプロトコルで概説されている4つのクラスがあることを確認した後、モジュールインターフェースは分類の結果とともに4つの新しいフィラメントオブジェクトを生成します。

最後に、[統計]タブで[すべての統計をファイルにエクスポート]をクリックして、統計データをエクスポートします。この図は、抗ベータ3チューブリン抗体と標識されたヒトニューロンの培養を示しています。ここでも細胞クラスタリングの傾向が明らかです。

ここに示されているのは、後期皮質前駆細胞からの分化後40日後のGFP標識パラメタルニューロンです。表在皮質層から。挿入図は、見かけの細胞体でより低い倍率を示しています。

これらのパネルは、成熟のさまざまな段階での樹状突起スパインのセグメントの3D再構築を表しています。脊椎密度と脊椎頭体積の定量分析を示します。予想通り、これら2つのパラメータは培養期間中に増加します。

培養手順を試みる際には、細胞のコリンを減らすために、神経幹細胞をゆっくりと回転運動でゆっくりと追加することにより、神経幹細胞を非常に慎重にプレートして発送することが重要です。実際、この方法では個々のニューロンの同定が必要です。