ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

この手順の全体的な目的は、ヒト人工多能性幹細胞由来の神経細胞から樹状突起棘をイメージングし、それらを三次元的に定量化することです。これは、まず6ウェルプレート内のカバーガラスをポリウレタンとラミニンで処理して神経幹細胞を培養できるようにし、次に培養液で希釈した神経幹細胞を播種することで達成されます。

緩やかな回転pipette操作を用いて培地を播種し、培養中で最大70日間分化させる。定期的に培地を交換した後、細胞にGFPレンチウイルスを導入し、抗GFP抗体で染色して可視化する。最後に、培養物を固定し、共焦点顕微鏡を用いて樹状突起棘を撮影する。

最終的に、ヒト樹状突起スパインの画像データは、分類および定量化のために3Dで再構成されます。本プロトコルでは、ヒト大脳皮質の第2層から第4層のグルタミン酸作動性ニューロンを得るための段階的な手順について説明します。本手法では、既報の方法に基づき、ヒト線維芽細胞由来のヒト人工多能性幹細胞から誘導された神経幹細胞を使用します。

既存の手法に対する本手法の主な利点は、DON右側およびPYの3Dでの自動セグメンテーションが可能であることです。これにより、通常は2D解析のみを行う既存のソフトウェアと比較して、大幅な時間の短縮が期待できます。また、donrおよびspyの分類は非常に便利で使いやすくなっています。

神経細胞培養を準備するために、6ウェル培養皿にガラスカバースリップを配置し、ポリ-L-オルニチンを加えてフローフード下で一晩インキュベートします。翌日、DPBSを用いてカバースリップを3回洗浄し、ラミニンを加えてフローフード下で少なくとも10時間インキュベートします。以下の成分を含む培養液を調製します。

次に、この培地を用いて、神経幹細胞（NSCs）を1平方センチメートルあたり50,000個の密度で播種し、ヒトiPSC由来ニューロンへの導入に向けた準備を行います。この際、細胞の凝集を抑えるため、ゆっくりと円を描くようにピペッティングしてください。分化の任意の段階で、新鮮な培養液とともに、GFPレンチウイルスベクターを40 ng含有するストック溶液1 µLを各培養ウェルに加え、37 °Cで48時間インキュベートします。免疫蛍光染色の準備として、培養液を除去し、4%ホルムアルデヒドを用いて導入後の細胞を室温で10分間固定します。

次に、XPBSを用いて細胞を10分間ずつ3回洗浄します。続いて、0.05% Triton X 110および馬血清を添加したPBSにカバーガラスを浸し、室温で1時間インキュベートします。その後、PBSを用いてカバーガラスを3回洗浄します。

各カバースリップに、PBS 4% horse serumで1/1000に希釈したGFP一次抗体を100 µLずつ添加します。暗箱内、4 °Cで一晩インキュベートします。次に、Alexa Fluor 488結合抗体をPBS 0.5% tween 20で1/200に希釈します。PBSでスライドを3回洗浄した後、抗体溶液を用いて細胞を室温で1時間インキュベートします。

封入剤を用いて、蛍光顕微鏡観察用のスライドを封入する。共焦点顕微鏡下で、各条件につき、錐体状の形態と折り畳まれた樹状突起の分枝を持つ健康なニューロンを少なくとも10個選択し、樹状突起1本あたり60から100 µmを定量化する。40倍（NA 1.3）の油浸対物レンズと488 nmのレーザー（試料レベルでの典型的なピーク出力は約20 µW）を用いて画像を撮影し、樹状突起棘を適切にサンプリングできるよう、ピクセルサイズを約80 nmに設定する。

ニューロンの全体積をサンプリングするために、Z間隔を150から300ナノメートルとしてZスタックを取得し、樹状突起スパインの3D定量化を行うために20から30枚のZスライスを得ます。前処理には、解析ソフトウェアで以下の設定を使用してください。画像処理の「smoothing Gaussian filter」を選択し、ガウスフィルタリングを行ってください。

フィラメントトレーサーモジュールを用いて樹状突起の半自動トレースを行うため、フィルター幅をXY平面のピクセルサイズに設定します。スライス（slice）タブで、距離ツールを使用して樹状突起の直径を推定してください。次に、サーパスト（surpassed）タブでフィラメントツールをクリックし、描画（draw）タブでの堅牢性を高めるために「自動作成をスキップ（skip automatic creation）」を選択します。

次に、「select auto path」をメソッドとして、「dendrite」をタイプとして選択し、推定される樹状突起の直径を入力します。ポインターの選択モードを使用してカーソルをボックス状にし、Shiftキーを押しながら樹状突起の開始点を右クリックします。これにより、ソフトウェアによる初期計算が実行されます。

次に、開始点から樹状突起に沿ってポインターを移動させます。最も可能性の高い樹状突起の経路が黄色の線で表示されます。Shiftキーと左クリックを押してください。

モジュールインターフェースで、樹状突起の末端をクリックしてスパインの自動セグメンテーションを実行します。「rebuild」ドロップダウンリストの「creation」タブをクリックします。「rebuild dendrite diameter」を選択し、「keep data」ボックスにチェックを入れます。

次に、rebuildをクリックします。セグメンテーションされた体積が実際の樹状突起の体積と一致するようにしきい値を設定してください。アルゴリズムには、distance mapからのshortest distanceを選択します。

次に、「slice」タブの下にある「next」ボタンをクリックし、最小のスパイン頭部径と最大長を決定します。続いて、「surpass」タブの下でパラメーター値を入力します。最小径に200から300 nanometers、最大長に4 micrometers程度を入力することが、適切な開始点となります。「allow spines」ボックスにチェックを入れない状態で、「next」ボタンをクリックしてください。次に、「seed points」のしきい値を調整し、スパインを示す青い点が実際のスパイン頭部に位置するようにします。

次に、「next」をクリックします。これによりコア計算が実行されますが、完了まで時間がかかる場合があります。モジュールインターフェースの「tools」タブにある「classify spine」をクリックします。テキストプロトコルに記載されている通り、4つのクラスがあることを確認すると、モジュールインターフェースによって分類結果として4つの新しいフィラメントオブジェクトが生成されます。

最後に、「statistics」タブにある「export all statistics to file」をクリックして、統計データをエクスポートします。この図は、抗β3-tubulin抗体でラベル化したヒトニューロンの培養を示しています。ここでは、細胞が凝集する傾向も見て取れます。

ここでは、後期皮質前駆細胞から分化して40日後の、GFPで標識されたパラメタルニューロンを示しています。これは皮質浅層に位置しています。挿入図は低倍率で、細胞体と思われる部分を示しています。

これらのパネルは、成熟の異なる段階にある樹状突起棘のセグメントを3D再構成したものです。ここでは、棘密度と棘頭体積の定量分析を示しています。予想通り、これら2つのパラメータは培養期間に伴い増加しています。

培養手順を行う際は、細胞の凝集を抑えるため、緩やかに回転させながらゆっくりと細胞を添加し、神経幹細胞を非常に慎重に播種および分散させることが重要です。実際、この手法では個々のニューロンを識別させる必要があります。