Name: ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 学ぶ ヒトiPS細胞由来錐体ニューロンの樹状突起棘を三次元定量化する方法。GFPレンチウイルス標識と共焦点顕微鏡を用いて、シナプス構造の形態学的解析を行います。この技術は神経発達・神経変性疾患研究への応用が期待されます。

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この作業は、パスツール研究所、ベッテンコート・シューラー財団、国立科学研究センター、パリ・ディドロ大学、国立研究庁(ANR-13-SAMA-0006;SynDivAutism)、Conny-Maeva Charitable Foundation、Cognacq Jay Foundation、Orange Foundation、Fondamental Foundationなどの団体です。L.G.は、保健省の学部フェローシップによってサポートされています。私たちは、この作業の初期段階で、BitPlane、特にGeorgia Golfisの助けに感謝します。

1.神経文化注：線維芽細胞の多能性幹細胞におけるリプログラミング、背側終脳の系統へのコミットメント、導出、増幅、及び後期皮質前駆細胞（LCP）の銀行がBoissart ら 4で説明しました。 LCP様細胞の神経分化はまた、わずかな修正を加えたBoissart ら 4に従って行きました。他の手順は、ニューロンへの分化に続いて誘導多能性幹細胞への線維芽細胞の直接再プログラミングのために開発されています。それはピラミッド型グルタミン酸作動性ニューロンの選択的な製造を可能にするため、このプロトコルを保持しました。 <ol><li>ポリオルニチン（DPBSで1/6に希釈し、原液濃度0.01％）、DPBSで3回洗浄し、O / Nでカバーガラスを6ウェル培養プレートを扱います。その後流フードの下で少なくとも10時間（ストック濃度1mg / mlの、DPBS中で500倍に希釈）ラミニンを追加<html> 。 </li><li> DMEM / F12からなる培地3mlの（500 ml）を、N2サプリメントの2バイアル（各5ml）中のガラスカバースリップで6ウェル培養プレート（50,000細胞/ cm 2）低密度でNSCをプレートし、派遣、 B27サプリメントの2バイアル（各10ml）、ペン - ストレプトマイシン（ペニシリン= mlおよびストレプトマイシン= 10,000単位/ mlの10,000単位/）、2-メルカプトエタノール（ストック液：50 mM）の1mlを10ミリリットルとラミニン（1 / 500）、成長因子を含みません。重要なステップ：細胞クラスタリングを減少させるためにゆっくり回転運動を細胞に添加することによって慎重にこの工程を行います。 </li><li>培地を除去します。カバーガラスに付着した神経細胞を維持し、凝集を回避するために、新鮮なラミニン溶液を2μg/ mlを含む新鮮なN2B27培地を追加します。 3日ごとに培地を変更します。乾燥から細胞を防ぐために、新鮮な培地を添加する前に、残りの培地（200μL）の一部を保管してください。また、急速に進行し、全体積（3ml）に変更します。 </li></ol>e_title &quot;&gt; 2。レンチウイルス形質導入注意：GFPレンチウイルスベクターは、親切にパスツール研究所（パリ）で博士ウーヴェMaskos研究所によって提供され、公表されたプロトコール5に従って調製しました。 GFP発現は、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーターにより駆動されます。この研究では、ウイルス力価は、400 ngの/μL（PBS 1Xで原液）でした。 <ol><li>文化ごとのGFPレンチウイルスベクターウェル（6ウェルプレート）の40 ngのを含むストック溶液1μlを追加することにより、ウイルス粒子による成熟のいずれかの段階で人間のiPS細胞由来の神経細胞を形質導入し、新鮮な培養培地中で48時間インキュベートします。注：このプロトコルでは、インキュベーションの期間は、脊椎構造の良好なラベル付けを可能にします。 </li></ol> 3.免疫蛍光注：全脊椎の形態の標識化を改善するために、免疫蛍光標識は、透過処理条件下で、抗GFP抗体を用いて行きました。 </p&gt; <ol><li>培養培地を除去し、室温で10分間、4％パラホルムアルデヒド中でカバーガラス上で形質導入した細胞を固定し、その後、1×PBS中で（10分毎）で3回洗浄します。 </li><li> PBS中で飛び込むのカバーガラスが0.05％トリトン（100倍）し、室温で1時間、10％ウマ血清を補充し、その後、1×PBS中で3回洗浄します。 </li><li> 1×100μlのPBSを加え、GFPに対して惹起され、各カバースリップ上で1000倍に希釈（1 /千）4％ウマ血清及び一次抗体を補いました。暗箱Oでインキュベート/ N 4℃で、次いで1×PBSで3回洗浄します。 </li><li> PBS中でアレクサフルオロ488結合抗体（1/200）を希釈のTween 20の0.5％を補充し、室温で1時間インキュベートします。その後、1×PBS中で3回洗浄し、蛍光顕微鏡用のメディアをマウントして、スライドガラス上にカバースリップをマウントします。 </li></ol> 4.樹状突起棘イメージング<ol><li>共焦点レーザー走査顕微鏡で共焦点イメージングを実行します。 </li><li>ピラミッド型の形態Aとの健全なニューロンを選択NDフル樹状樹枝状分岐し、別々の実験からの条件当たり少なくとも10のニューロンを定量化します。デンドライトあたり100ミクロン - 60を定量化します。 </li><li>目的とGFPの励起のための488nmレーザーライン、20μWの周りのサンプルレベルでの典型的なピークパワーで40X油NA = 1.3を使用して画像を取得します。 80nmの周りにピクセルサイズが適切に樹状突起棘をサンプリングします。 注意：ノイズは樹状突起と棘の適切なセグメント化を妥協しないで画像の後続の解析コールを。前述の空間サンプリングおよび電力設定では、我々は3.15マイクロ秒の画素滞留時間は、そのようなイメージを構築するのに十分な光子を収集するのに十分であることを観察しました。薄暗いサンプルについては、画質が2〜4のスキャンを平均することによって改善することができます。いくつかのXYタイルの獲得は、処理の前に縫合しなければならない関心領域をカバーするために必要とされ得ます。 </li><li>に、Z​​スタックを取得し、全ニューロンの量を試料にZは20〜30のZスライスを得、150ナノメートルから300ナノメートルの範囲でスペーシング。 注：これらの設定で達成横方向の空間分解能は234 nmであると軸方向分解能は591 nmです。ここで選択されたサンプリングは十分であるが、軸方向の解像度が画像化される脊柱の最小サイズよりも大きいように、分析は、樹状突起から側方に延びて棘を好みます。 </li></ol>樹状突起棘の5 3D定量注：以下のセクションでは、具体的には、分析のためのIMARISソフトウェアの使用を記載しています。代替の実装では、同様の結果を提供することができますNeuronStudio 15またはをMetamorph 8、を含む、存在します。 次のキー設定を使用します。 <ol><li>前処理段階として、ソフトウェアが提供する画像処理施設を通じてガウスフィルタを使用。 画像処理&gt; Smoo経由でガウスフィルタ処理を実行します事&gt;ガウスフィルタ。 X-Yの画素サイズに等しくなるように、フィルタの幅を設定します。 </li><li>ソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールを使用して、樹状突起の半自動トレースを実行します。 <ol><li>まず、ソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用することにより、樹状突起の直径を推定します。 </li><li> サーパスタブで、 フィラメントのツールをクリックしてください。優れた堅牢性のために、このプロトコルは、半自動追跡に依存しています。 スキップ自動作成をクリックしてください。モジュールインターフェイスは現在、 描画]タブを示しています。ここでは、タイプ、および入力の方法、 デンドライトと推定デンドライト直径てAutoPathを選択します。 </li><li>ボックスにカーソルを回し、ポインタの選択モードを使用します。樹状突起の出発点に、Shiftキーを押しながら右クリックします。注：このソフトウェアは、最初の計算を実行します。 </li><li>樹状突起に沿ってポインタを移動します。出発点から（表します青い球のようにED）、最も可能性の高い樹状突起のパスを表す黄色の線が示されています。樹状突起のエンドポイントで、Shiftキーを押しながら左クリックします。 </li></ol></li><li>自動化された棘のセグメンテーションを行います。注：トレース樹状突起上の棘は、モジュールインタフェースによって自動的に発見されることになります。 <ol><li>モジュールインターフェイスでは、 作成タブをクリックします。 リビルドドロップダウンリストでは、 デンドライトの直径を再構築し、キープデータ ]チェックボックスをオンに選びます。 [再構築]をクリックします。 </li><li>セグメント化されたボリュームは実際の樹状突起のボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして 、 距離マップからの最短距離を選択します。[次へ]ボタンをクリックします。 </li><li>最小の背骨の頭の直径と最大長を決定し、再びソフトウェアのスライスタブに距離ツールを使用して、その後突破タブに戻ってくるとパラメータを入力します。 Fあるいはこのプロトコルは、200の周り値 - 最小の直径が300nmであり、最大長さ4μmのは良い出発点です。 許可支店棘ボックスをチェックしないでください。 [次へ]ボタンをクリックします。 </li><li>棘を表す青色の点は、実際の背骨の頭に局在するように、 シード点のしきい値を調整します。 [次へ]ボタンをクリックします。注：コアの計算は、現在行われていると長くなる可能性があります。 </li></ol></li><li>モジュールインターフェイスの[ツール]タブに移動して、棘を分類します。 分類棘をクリックします。プロンプトが表示され、ユーザインタフェースでは、次のようにその形態によって定義された4つのクラスが存在することを確認してください：スタビー：長さ&lt;1μmで、キノコ：長さ（背骨）&gt; 3、最大幅（ヘッド）&gt;（首）の幅を意味する×2。ロング薄い：平均幅（ヘッド）≥平均幅（首）;糸状仮足のような：長さ≤4ミクロン（無頭）。 注：MOduleインターフェースは、分類の結果を含む4新しいフィラメントのオブジェクトを生成します。 </li><li>エクスポート統計データ：これらの4オブジェクトインタフェースのいずれかで、[統計]タブに移動します。 ボタンをファイルにエクスポートすべての統計情報をクリックします。 注意：他の統計値は、樹状突起のためにエクスポートすることができます（ 例えば 、長さ、面積、角度、ボリュームを分岐、直径、枝の深さを意味する、 など 。）、および棘のために（明確なの例えば、真直度、添付ファイルの面積、長さとボリューム脊椎部、脊椎直径、密度、 など 。） </li></ol>

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<li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997(2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

錐体ニューロンの形態学的特徴の定量化は、ソフトウェアに依存していました。フィラメントトレーサーインタフェースはニューロンおよび棘の分割のために使用し、XTモジュールは、それらの分析に使用しました。 私たちの技術の精度を分析するには、まず文化6、7、ヒト脳組織3ラット成熟錐体ニューロンを使用して発行されていると測定された形態学的パラメータ（長さ、面積、および全脊椎ボリューム該当）を、比較しました。密度は、全ての場合において同等でした。総脊椎ボリュームが少し私たちのデータと比較して減少したのに対しませボリュームデータは、ボリュームの再構築のために独自のプロトコルを使用してベナビデス-Piccione 3の研究では、（2次元解析は著者によって使用されるソフトウェアで報告された）ラットの神経細胞に記載されませんでした選択された棘上。このような差異は、細胞の地域の起源とそのために使用される蛍光色素によって説明することができますラベリング。 いくつかの重要なポイントは、主に...

皮質錐体ニューロンの樹状突起棘は、げっ歯類、霊長類、およびヒトの脳におけるこれらのニューロンのサブタイプの基礎と先端樹状突起に沿って分布している小型・薄型の突起があります。彼らは、ほとんどの興奮性シナプスのサイトであり、学習や認知過程における重要な機能を表示します。ヒト樹状突起棘の詳細な構造は、技術的には、電子顕微鏡2によって研究されています。しかし、このようなアプローチは、時間がかかり、重いワークロードを表します。より最近では、樹状突起棘の形態の三次元（3D）再構成は、大きな手動脊椎分析3に合わせた特定のソフトウェアを使用してヒト脳皮質において報告されています。 免疫蛍光に結合された緑色蛍光タンパク質（GFP）技術は、蛍光顕微鏡によって脊椎の識別および形状測定のための正確なツールを表します。このアプローチは、容易に培養されたニューロンに適用することができます。ハウ版、データは人工多能性幹細胞（iPS細胞）由来のヒト神経細胞のスパインの成熟と形態の分析に報告されていません。 本研究の目的は 、in vitroで培養したヒトの神経細胞からの樹状突起棘のイメージングを可能にするプロトコルを記述するためでした。 IMARISソフトウェアのフィラメントトレーサーモジュールとGFP標識、共焦点顕微鏡および三次元解析は、本プロトコールに使用しました。神経幹細胞（NSC）からIVへの層IIの皮質グルタミン酸作動性ニューロンを得るために必要な培養ステップはまた、ここで簡単に説明されています。人間NSCの生産のためのプロトコル全体は、すでに他の場所で4公開されています。

<table><tbody><tr><td>D-PBS (1x), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>マウスラミニン</td><td>Dutscher</td><td>Dominique 354232</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement w/o Vitamin A(50倍)</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Med SFM</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Steptomycin</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td><td>ギブコ/ Life Technologies</td><td>A-6455</td><td></td></tr><tr><td>馬用美容液</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ アンチウサギ&nbsp;</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>ポリクローナル抗ベータIIIチューブリン抗体</td><td>ミリポア</td><td>AB9354</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス 13 mm</td><td>VWR</td><td>631-0150</td><td></td></tr><tr><td>DAPI付きプロロングゴールド退色防止試薬</td><td>Gibco/ Life Technologies</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma Aldrich Chimie</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ヒト線維芽細胞</td><td>Coriell Cell Line Biorepository</td><td>GM 4603 および GM 1869</td><td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ツァイス (ドイツ)</td><td>LSM 700</td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software</td><td>Bitplane AG, Zurich</td><td>6.4.0 バージョン</td><td>フィラメントトレーサーとイマリス XT モジュールが必要です</td></tr>。<tr><td>Huygensソフトウェア</td><td>Huygensソフトウェア、SVI、Netherlands</td><td>Proバージョン</td><td>オプション(デコンボリューションテスト用)</td></tr></tbody></table>

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

樹状突起棘は、中枢神経系の興奮性シナプスのシナプス後の区画に対応して小さな突起があります。これらは、樹状突起に沿って分布しています。その形態は、神経活動に大きく依存している、と彼らは動的です。樹状突起棘は、その表面上およびシナプス後密度のレベルでグルタミン酸受容体（AMPAおよびNMDA受容体）を発現します。各脊椎は、ニューロンが独立して、その状態や地域活性を制御することができます。脊椎形態は広範囲のin vivoアプローチやげっ歯類組織より得られた神経細胞培養の両方を使用して、脳皮質のグルタミン酸作動錐体細胞で研究されています。齧歯類培養ニューロンと一次元の定量分析1に示すように、神経病理学的条件は、変更された脊椎誘導および成熟に関連することができます。本研究は、人間corticを使用して、脊椎の形態の3次元定量分析のためのプロトコルについて説明しアルニューロンは、神経幹細胞（後期皮質前駆細胞）に由来します。これらの細胞は、最初に誘導された多能性幹細胞から得ました。このプロトコルは、異なる培養期間での脊椎形態の分析を可能にし、精神疾患を有する患者から得られたものと対照個体から得られた人工多能性幹細胞との間の比較可能性を有します。

<html>本研究は、iPS細胞由来錐体ニューロンの培養樹状突起のスパイン・定量化のための標準化されたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、脊椎の人間の神経細胞の成熟と標準的なげっ歯類の神経細胞培養におけるスパインの成熟などにおける in vivo動物モデルとの比較可能性の分析を可能にします。 図1Aは、皮質錐体ニューロンの生成を可能にする培養物の種々のステップの概要を表します。このような略図をより良く棘の異なるカテゴリに恵まれ錐体ニューロンの生成のグローバルタイムスケーリングを理解するために提供されます。 Reprogrammation工程は、しかしながら、本研究の範囲外であり、他の場所4に記載されています。健康なニューロンは、65までの培養中に保持することができる- 。70日図1Bは、イメージングおよび棘の3D定量のワークフローを示しています。 「ove_content&gt; 図2Aは、抗ベータIIIチューブリン抗体...

錐体ニューロンの樹状突起棘は、哺乳類の脳皮質の中で最も興奮性シナプスのサイトです。この方法は、人工多能性幹細胞由来のヒト皮質錐体グルタミン酸作動性ニューロンにおける脊椎形態の3次元定量分析を記載します。

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

この手順の全体的な目的は、ヒト人工多能性幹細胞由来の神経細胞から樹状突起棘をイメージングし、それらを三次元的に定量化することです。これは、まず6ウェルプレート内のカバーガラスをポリウレタンとラミニンで処理して神経幹細胞を培養できるようにし、次に培養液で希釈した神経幹細胞を播種することで達成されます。緩やかな回転pipette操作を用いて培地を播種し、培養中で最大70日間分化させる。定期的に培地を交換した後、細胞にGFPレンチウイルスを導入し、抗GFP抗体で染色して可視化する。最後に、培養物を固定し、共焦点顕微鏡を用いて樹状突起棘を撮影する。最終的に、ヒト樹状突起スパインの画像データは、分類および定量化のために3Dで再構成されます。本プロトコルでは、ヒト大脳皮質の第2層から第4層のグルタミン酸作動性ニューロンを得るための段階的な手順について説明します。本手法では、既報の方法に基づき、ヒト線維芽細胞由来のヒト人工多能性幹細胞から誘導された神経幹細胞を使用します。既存の手法に対する本手法の主な利点は、DON右側およびPYの3Dでの自動セグメンテーションが可能であることです。これにより、通常は2D解析のみを行う既存のソフトウェアと比較して、大幅な時間の短縮が期待できます。また、donrおよびspyの分類は非常に便利で使いやすくなっています。神経細胞培養を準備するために、6ウェル培養皿にガラスカバースリップを配置し、ポリ-L-オルニチンを加えてフローフード下で一晩インキュベートします。翌日、DPBSを用いてカバースリップを3回洗浄し、ラミニンを加えてフローフード下で少なくとも10時間インキュベートします。以下の成分を含む培養液を調製します。次に、この培地を用いて、神経幹細胞（NSCs）を1平方センチメートルあたり50,000個の密度で播種し、ヒトiPSC由来ニューロンへの導入に向けた準備を行います。この際、細胞の凝集を抑えるため、ゆっくりと円を描くようにピペッティングしてください。分化の任意の段階で、新鮮な培養液とともに、GFPレンチウイルスベクターを40 ng含有するストック溶液1 µLを各培養ウェルに加え、37 °Cで48時間インキュベートします。免疫蛍光染色の準備として、培養液を除去し、4%ホルムアルデヒドを用いて導入後の細胞を室温で10分間固定します。次に、XPBSを用いて細胞を10分間ずつ3回洗浄します。続いて、0.05% Triton X 110および馬血清を添加したPBSにカバーガラスを浸し、室温で1時間インキュベートします。その後、PBSを用いてカバーガラスを3回洗浄します。各カバースリップに、PBS 4% horse serumで1/1000に希釈したGFP一次抗体を100 µLずつ添加します。暗箱内、4 °Cで一晩インキュベートします。次に、Alexa Fluor 488結合抗体をPBS 0.5% tween 20で1/200に希釈します。PBSでスライドを3回洗浄した後、抗体溶液を用いて細胞を室温で1時間インキュベートします。封入剤を用いて、蛍光顕微鏡観察用のスライドを封入する。共焦点顕微鏡下で、各条件につき、錐体状の形態と折り畳まれた樹状突起の分枝を持つ健康なニューロンを少なくとも10個選択し、樹状突起1本あたり60から100 µmを定量化する。40倍（NA 1.3）の油浸対物レンズと488 nmのレーザー（試料レベルでの典型的なピーク出力は約20 µW）を用いて画像を撮影し、樹状突起棘を適切にサンプリングできるよう、ピクセルサイズを約80 nmに設定する。ニューロンの全体積をサンプリングするために、Z間隔を150から300ナノメートルとしてZスタックを取得し、樹状突起スパインの3D定量化を行うために20から30枚のZスライスを得ます。前処理には、解析ソフトウェアで以下の設定を使用してください。画像処理の「smoothing Gaussian filter」を選択し、ガウスフィルタリングを行ってください。フィラメントトレーサーモジュールを用いて樹状突起の半自動トレースを行うため、フィルター幅をXY平面のピクセルサイズに設定します。スライス（slice）タブで、距離ツールを使用して樹状突起の直径を推定してください。次に、サーパスト（surpassed）タブでフィラメントツールをクリックし、描画（draw）タブでの堅牢性を高めるために「自動作成をスキップ（skip automatic creation）」を選択します。次に、「select auto path」をメソッドとして、「dendrite」をタイプとして選択し、推定される樹状突起の直径を入力します。ポインターの選択モードを使用してカーソルをボックス状にし、Shiftキーを押しながら樹状突起の開始点を右クリックします。これにより、ソフトウェアによる初期計算が実行されます。次に、開始点から樹状突起に沿ってポインターを移動させます。最も可能性の高い樹状突起の経路が黄色の線で表示されます。Shiftキーと左クリックを押してください。モジュールインターフェースで、樹状突起の末端をクリックしてスパインの自動セグメンテーションを実行します。「rebuild」ドロップダウンリストの「creation」タブをクリックします。「rebuild dendrite diameter」を選択し、「keep data」ボックスにチェックを入れます。次に、rebuildをクリックします。セグメンテーションされた体積が実際の樹状突起の体積と一致するようにしきい値を設定してください。アルゴリズムには、distance mapからのshortest distanceを選択します。次に、「slice」タブの下にある「next」ボタンをクリックし、最小のスパイン頭部径と最大長を決定します。続いて、「surpass」タブの下でパラメーター値を入力します。最小径に200から300 nanometers、最大長に4 micrometers程度を入力することが、適切な開始点となります。「allow spines」ボックスにチェックを入れない状態で、「next」ボタンをクリックしてください。次に、「seed points」のしきい値を調整し、スパインを示す青い点が実際のスパイン頭部に位置するようにします。次に、「next」をクリックします。これによりコア計算が実行されますが、完了まで時間がかかる場合があります。モジュールインターフェースの「tools」タブにある「classify spine」をクリックします。テキストプロトコルに記載されている通り、4つのクラスがあることを確認すると、モジュールインターフェースによって分類結果として4つの新しいフィラメントオブジェクトが生成されます。最後に、「statistics」タブにある「export all statistics to file」をクリックして、統計データをエクスポートします。この図は、抗β3-tubulin抗体でラベル化したヒトニューロンの培養を示しています。ここでは、細胞が凝集する傾向も見て取れます。ここでは、後期皮質前駆細胞から分化して40日後の、GFPで標識されたパラメタルニューロンを示しています。これは皮質浅層に位置しています。挿入図は低倍率で、細胞体と思われる部分を示しています。これらのパネルは、成熟の異なる段階にある樹状突起棘のセグメントを3D再構成したものです。ここでは、棘密度と棘頭体積の定量分析を示しています。予想通り、これら2つのパラメータは培養期間に伴い増加しています。培養手順を行う際は、細胞の凝集を抑えるため、緩やかに回転させながらゆっくりと細胞を添加し、神経幹細胞を非常に慎重に播種および分散させることが重要です。実際、この手法では個々のニューロンを識別させる必要があります。

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

数々の最近の研究では、脳の病理学に関連したシナプス蛋白の変異を同定した。初代培養皮質ニューロンは樹状突起スパイン形態と運動性にこれらの疾患関連タンパク質の影響を調べることで最大限の柔軟性を提供します。...

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

このビデオでは、神経幹細胞の接着と成長を促進するために、ポリオルニチンとラミニンでコーティングされたガラスカバースリップを準備する方法を説明しています。この手法には、シーケンシャルインキュベーションと洗浄が含まれ、ニューロンに見られる構造を模倣して、ニューロン細胞の成長と分化を促進する支持マトリックスの形成を促進します。...

ヒト神経幹細胞からの皮質錐体ニューロンの生成

出典: Gouder, et. al.ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量化J. Vis. 経験。(2015)。このビデオでは、共焦点顕微鏡を使用した形質導入された免疫標識錐体ニューロンにおける樹状突起棘のイメージングと分析を示します。バックグラウンドノイズが低減され、樹状突起の直径と長さを推定することで樹状突起がトレースされます。自動スパインセグメンテーションには、樹状突起とスパインの寸法のパラメータの設定とスパインの分類が含まれます。3D...

共焦点顕微鏡イメージングを用いた樹状突起棘の定量化

この記事では、構造化照明顕微鏡（SIM）を使用してインビトロで海馬ニューロンからイメージ樹状突起棘にワーキングプロトコルについて説明します。 SIMを使用して超解像顕微鏡法は、改善されたディテール個体樹状突起棘の画像化を可能にする、有意にすべての3つの空間次元における光の回折限界を超えて画像解像度を提供する。...

構造化照明顕微鏡を用いてラット初代海馬ニューロンの樹状突起棘を画像化

私たちは、マウスモデルの海馬における樹状突起形成の可視化と定量化のための2つの方法、すなわちリアルタイムイメージングと拡張被写界深度イメージングについて説明します。前者の手法では、高度な地形トレースや分岐範囲の定量化が可能になるのに対し、後者では樹状突起樹のスピーディーな可視化が可能です。...

マウスの海馬領域の歯状回における樹状樹枝状分岐の評価

このプロトコルは、シナプス可塑性をモデリングするための樹状脊椎を持つ樹状セグメントの3次元(3D)モデルを開発します。構築されたメッシュは、CellBlender および MCell を使用するソフトウェア プログラム Blender を使用して、長期的なシナプス可塑性における AMPA...

シナプス可塑性を用いた樹状脊椎の3Dモデリング

神経化学的および行動異常の根本にある可能性のあるニューロンおよび樹状脊椎の形態変化の可能性を評価するために重要な錐体ニューロンを標識し、分析するプロトコルを提示する。...

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

プロトコルは、ラットの海馬および内側前頭前野のニューロンを染色するための、神経系の任意の部分に適合させることができる迅速ゴルジ法の改変を記載している。...

海馬および前頭前野における樹状突起脊椎の可視化のための迅速なゴルジ染色

樹状突起棘は、ほとんどの興奮性シナプスのシナプス後コンパートメントです。樹状突起スパインの形態の変化は、神経発達、老化、学習、および多くの神経学的および精神医学的障害の間に起こり、信頼性の高い樹状突起スパイン解析の重要性が強調されています。このプロトコルでは、自動 3 次元ニューロン再構成ソフトウェアを使用して、樹状突起スパインの形態を正確かつ再現性よく定量化する方法について説明します。...

自動三次元ニューロン再構成ソフトウェアによる樹状突起スパインの定量化

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。...

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

学ぶ ヒトiPS細胞由来錐体ニューロンの樹状突起棘を三次元定量化する方法。GFPレンチウイルス標識と共焦点顕微鏡を用いて、シナプス構造の形態学的解析を行います。この技術は神経発達・神経変性疾患研究への応用が期待されます。

ヒト人工多能性幹細胞由来の錐体ニューロンからの樹状突起棘の三次元定量

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