共焦点顕微鏡イメージングを用いた樹状突起棘の定量化

質導入され、免疫標識されて緑色に蛍光を発する錐体ニューロンを取ります。

画質を確保するために設定を調整した共焦点レーザー走査顕微鏡を使用してニューロンの画像を取得します。

専用のソフトウェアを使用して画像を開き、ガウス フィルターを使用してバックグラウンド ノイズを低減します。

最初に樹状突起の直径を推定して、半自動の樹状突起トレースを実行します。次に、樹状突起の始点、パス、終点を選択します。

スパインの自動セグメンテーションの場合は、[樹状状突起の直径を再構築]を選択し、実際の樹状突起の体積を表すように[樹状突起の体積しきい値]を設定します。

スパインヘッドの最小直径とスパインの最大長の値を指定します。

スパインを表すポイントのしきい値を調整し、実際のスパインヘッドに確実に位置

長さ、頭の直径、形状に基づいてスパインを分類するパラメータを設定します。

棘のある樹状突起の3Dモデルを生成し、さらに分析するためにデータをエクスポートします。

共焦点顕微鏡下で、錐体形態と完全な樹状突起樹枝形成を持つ条件ごとに少なくとも10個の健康なニューロンを選択します。樹状突起あたり60〜100マイクロメートルを定量化するには、40倍、NA 1.3オイル対物レンズと、約20マイクロワットのサンプルレベルで典型的なピークパワーを持つ488ナノメートルレーザーで画像を取得します。

状突起の棘を適切にサンプリングするために、ピクセルサイズを約80ナノメートルに設定します。ニューロン体積全体をサンプリングするには、150〜300ナノメートルのz間隔のZスタックを取得し、20〜30のzスライスを生成します。樹状突起棘の3D定量化を行うには、解析ソフトウェアで以下の設定を行います。

前処理には、画像処理、スムージング、ガウスフィルターを選択して、ガウスフィルタを使用します。フィルター幅をXY平面のピクセルサイズに等しく設定します。樹状突起の半自動トレースを実行するには、[スライス]タブのフィラメントトレーサーモジュールから、[距離]ツールを使用して樹状突起の直径を推定します。

次に、[Surpass]タブで、[フィラメント]ツールをクリックし、[自動作成をスキップ]を選択して堅牢性を高めます。表示された[描画]タブで、方法として[オートパス]を選択し、タイプとして[樹状突起]を選択し、推定された樹状突起の直径を入力します。ポインタの選択モードを使用して、カーソルをボックスに回し、[Shift]を選択して樹状突起の始点を右クリックします。ソフトウェアが初期計算を実行します。

次に、樹状突起に沿ってポインタを移動します。始点から、最も可能性の高い樹状突起経路を表す黄色の線が表示されます。Shiftキーを押しながら、樹状突起の端点を左クリックします。自動スパインセグメンテーションを実行するには、モジュールインターフェイスで[作成]タブをクリックします。再構築ドロップダウンリストで、樹状突起直径の再構築を選択し、データを保持ボックスをオンにします。次に、[再構築] をクリックします。

セグメント化されたボリュームが実際の樹状突起ボリュームに対応するようにしきい値を設定します。アルゴリズムとして、距離マップからの最短距離を選択します。次に、[次へ]ボタンをクリックします。[スライス]タブで、スパインヘッドの最小直径と最大長を決定します。

次に、[Surpass] タブでパラメーターを入力します。最小直径の場合は約200〜300ナノメートル、最大長の場合は約4マイクロメートルの値が適切な出発点です。[スパインを許可] ボックスをオンにせずに、[次へ] ボタンをクリックします。

次に、棘を表す青い点が実際の棘の頭に局在するように、シードポイントのしきい値を調整します。次に、[次へ] をクリックします。コア計算が実行され、時間がかかる場合があります。スパインを分類するには、モジュールインターフェイスの [ツール] タブで [スパインの分類] をクリックします。

テキストプロトコルで概説されているように4つのクラスがあることを確認した後、モジュールインターフェイスは、分類の結果を使用して4つの新しいフィラメントオブジェクトを生成します。最後に、[統計] タブで [すべての統計をファイルにエクスポート] をクリックして、統計データをエクスポートします。