三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

このイメージングおよび解析手法の全体的な目的は、複雑なシグナルから特定の情報を抽出することです。具体的に本プロトコルでは、表皮内にある他のミトコンドリアと区別して、神経特異的なミトコンドリアを可視化および定量化する方法について解説します。この手法は、健康な個人の表皮内神経線維におけるミトコンドリアが、神経学的合併症を持つ患者の神経特異的なミトコンドリアとどのように異なるかなど、神経学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。

この手法の主な利点は、複雑な信号から特定の情報を抽出できることです。このプロトコルにより、これらのストロー内の信号のように、周囲の信号から特定の信号を分離することが可能になります。まず、この図式に従って96ウェルプレートにラベルを貼り、皮膚生検組織の蛍光免疫組織化学染色の準備を行います。

次に、二次抗体の非特異的結合を抑制するため、最上段の各ウェルにストック信号増強液を150 microlitersずつピペッティングします。96ウェルプレートの2段目と3段目の各ウェルに1x phosphate buffered salineを150 microlitersずつ加え、洗浄用ウェルを準備します。続いて、4段目のウェルに5%BSAブロッキング溶液を150 microlitersずつ加えます。

一次抗体PGP9.5およびPDHを1% BSA洗浄液 1,500 µLで希釈し、5行目の各ウェルに150 µLずつ加えます。白金耳を用いて、切片を1行目のシグナル増強溶液へと移します。切片を5行目の一次抗体溶液に入れたら、蒸発を防ぐためにプレートをラボフィルムで密閉し、フラットロッカーを用いて室温で1時間攪拌します。

4 °Cで一晩ロッキングしながらインキュベートします。2日目の手順として、96ウェルプレートの6行目、7行目、および8行目のウェルに1% BSA洗浄液を150 µLずつピペッティングします。1,500 µLの1% BSAに蛍光標識二次抗体を加えます。

次に、二次抗体溶液 150 µL を 9 行目の各ウェルにピペッティングします。6、7、8 番目のウェルを通過させて切片を洗浄します。切片が 9 行目の二次抗体溶液に入ったら、プレートをパラフィルムで巻き、アルミホイルで覆って蛍光信号を保護します。

前と同様にロッキングしながらインキュベートします。3日目に、滅菌フィルター済み1x PBSを150 µLずつ行10、11、および12にピペッティングします。サンプルを行10に移動させ、プレートをアルミホイルで覆います。

室温でロッキングしながら1時間 rinsing（洗浄）します。次に、フィルターろ過済みの1x PBSを50 µLピペットでスライドガラスに滴下し、切片の封入準備を行います。洗浄が完了したら、12行目の切片をスライドガラス上に移し、DAPIを含む封入剤を切片の上に直接1〜2滴加えます。

50 mm × 24 mm の 1.5 厚の顕微鏡用ガラスカバースリップを切片の上にそっと被せます。スライドを室温の暗所で一晩静置し、封入剤を硬化させてから、保存またはイメージングを行います。倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡で 40X オイル浸漬対物レンズを選択します。

核、神経線維、およびミトコンドリアをイメージングするために、適切なレーザーと検出器を選択します。顕微鏡ソフトウェアに、強度分解能12-bit、スキャンレート500 Hertz（2フレーム平均化あり）、ズーム2.2のスキャンパラメータを入力します。スキャン分解能に1024 by 1024を選択し、横方向の分解能が最適化されるように顕微鏡ソフトウェアを設定します。

共焦点アパーチャーを1 air unitに、Zステップサイズを210 nanometersに設定し、軸方向分解能と光学セクショニングを最適化します。各シグナルを個別にスキャンし、検出器の電圧とオフセットを調整して、飽和および未飽和ピクセルを除去します。神経シグナルのライブスキャンを有効にし、顕微鏡ソフトウェアのZフォーカスコントロールを調整して、組織切片内の神経シグナルを含む上下の焦点面を検索し、設定します。

蛍光信号のクロストークを排除するため、最終的なZシリーズをシーケンシャルスキャンでスキャンします。元の画像の複製画像上で、選択ツールを用いて表皮の周囲を囲み、角質層および真皮から表皮を分離します。その後、選択範囲に合わせて画像をクロップします。

「calculate spread function」機能を用いて、緑色および赤色の蛍光共焦点信号の点広がり関数を算出します。次に、媒質の屈折率（オイル）を1.515に、40倍オイル浸漬対物レンズの開口数を1.25に設定します。検出器のピンホールを1 air unitに設定し、レーザー励起波長を選択します。

反復復元を100% confidenceに設定し、反復回数の上限を10サイクルとし、緑色および赤色の蛍光信号のデコンボリューションには、それぞれ緑色および赤色のPSFを使用します。「create surface」ツールを使用して、デコンボリューションされた神経信号の周囲にサーフェスを作成します。その際、「smooth feature」のチェックを外し、閾値設定には「absolute intensity」を選択し、下限閾値を3,000、上限閾値を65,535に設定します。10 voxels以上のサーフェスを保持してください。

Nerve surfaceの編集タブを使用して、単一の非神経表面を選択するか、Controlキーを押しながら複数の非神経表面を選択し、それらを除去します。Deleteボタンを押して、選択した非神経表面を削除します。Nerve surfaceの編集タブを使用し、マスクプロパティにある「mask all」ボタンを押します。

新しいウィンドウで、「channel selection」の下にある「channel five mitochondria deconvolved」を選択し、「apply the mask」を適用する前に「duplicate channel」にチェックを入れます。「constant inside/outside」のラジオボタンを押し、「set voxels outside surface」を0.0に設定して「OK」ボタンを押します。最後に、「create surface」ツールを用いて、ミトコンドリア特異的なサーフェスを作成します。「uncheck smooth feature」を選択し、しきい値設定に「background subtraction」を使用することで、マスク処理されたデコンボリューション後のミトコンドリア信号の周囲にサーフェスを作成します。

最大球の直径を1.50 micrometersに、下限閾値を2,000に、上限閾値を最大65,535に設定します。サーフェスは1.0 voxels以上に保つようにしてください。この代表的な3D共焦点顕微鏡画像は、神経特異的な緑色蛍光シグナルを示しています。

神経信号に対して、シアン色で示される3Dサーフェスを作成します。次に、この神経サーフェスをマスキングツールとして使用し、皮膚の他のミトコンドリア信号から神経特異的なミトコンドリア信号を分離します。得られた神経特異的なミトコンドリア赤色蛍光信号を用いて、シアン色で示される神経サーフェス内のミトコンドリア周囲に、マゼンタ色で示されるサーフェスを作成します。

これにより、神経線維内のミトコンドリアを詳細に観察することが可能になります。ここでは、ミトコンドリアの表面データをサイズ頻度ヒストグラムとして提示し、体積に基づいた各屈曲部に存在するミトコンドリアの割合を可視化しています。この手順を行う際は、切片全体に均一で一貫した染色を施すため、染色工程において組織が溶液に完全に浸っていることを確認し、慎重に取り扱うことが重要です。

このビデオを視聴することで、ヒト表皮内神経線維におけるミトコンドリアの可視化および定量方法について十分に理解できるはずです。本詳細プロトコルは、ニューロパチーなどのミトコンドリア関連神経疾患の病態生理学的メカニズムを解明することを目的として、ヒト皮膚生検検体の染色、撮像、処理、および解析方法を他の研究者に指導するために設計されました。