Name: 三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学ぶ三次元画像解析による人間表皮内神経線維のミトコンドリア可視化・定量化法。蛍光免疫組織化学と共焦点顕微鏡を用いて、複雑な背景から神経特異的ミトコンドリア信号を分離し、神経疾患の病態理解に貢献する。

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この作品は、国立機関の健康補助金 K08 NS061039-01A2、神経研究のためのプログラムによって支えられた &#38; 探索、および、A. アルフレッド Taubman 医療研究所、ミシガン大学の。この作業には、形態と国内機関の健康の付与 5 P 90 DK-20572 国立糖尿病・消化器・腎臓病からによって資金を供給、ミシガン州糖尿病研究センターの画像解析コアが使用されます。著者感謝したい j. ロビンソン シングルトンとゴードン ・ スミス (ユタ大学) ヒトの皮膚のサンプルの寛大な寄付のため。

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ないの利害衝突を宣言します。

このプロトコルを特定、定量化、サイズと人間の皮膚生検から 3 D で IENFs 内神経固有ミトコンドリアの分布を分析し設計されています。プロトコルのいくつかの重要な手順があります。浮遊蛍光免疫組織化学染色、各サンプルでは、探索的研究44,45より汎用性の高い方法論を提供することで複数の信号を分析して設計されています。この手順は、共焦点顕微鏡画像と 3 D 解析を取得するために必要な 50 μ m セクション全体イメージの獲得を最大化するために、抗体の組織への浸透のためできます。もう一つの重要なステップは、ミトコンドリアを測定するための解像度を維持しながら画像あたり十分な神経をキャプチャ間のバランス イメージ集録パラメーターです。ティッシュ セクションはこれで使用され、標準的な皮膚生検プロトコルが約 3 ミリメートル長い45,46,の47</sup...

ミトコンドリアは、バッファリング、カルシウムと規制壊死とアポトーシス細胞死1,2,3セルのエネルギーを生産を含む重要な細胞機能を提供します。中枢神経系は、ミトコンドリア呼吸を介してニューロンがアデノシン三リン酸 (ATP) の形で高度の細胞のエネルギーを生成することを示唆している体4と比較して高い代謝率は。多くの神経機能が ATP5、特にシナプス6に依存していること証拠書類。したがって、神経細胞内のミトコンドリアの分布は重要です。
最後の 10 年間で多くの情報が示している人身売買および神経細胞のミトコンドリアのドッキングは非常に調整されます。モーター蛋白質ニューロンを通して特定の細胞コンパートメントにミトコンドリアの配布に関与しています。ミトコンドリアの人身売買は、ニューロンの軸索と樹状突起、相馬から遠く離れたプロジェクトのために特に重要です。キネシン モーター蛋白質は主に (相馬) から前向性ダイニン モーター蛋白質直接 (相馬) に向かって逆行運動7,8,9ながら微小管に沿ってミトコンドリアの人身売買を直接します。,10です。 このようなミトコンドリア膜電位とインパルス伝導存在とミトコンドリア人身売買11,12,13の方向に影響を与える携帯電話の信号があります。
ミトコンドリアを輸送に加えて Ranvier のノードやシナプス8,14,などの高エネルギー要求がある特定の細胞コンパートメントにミトコンドリアをローカライズするのには特殊な蛋白質があります。17します。 実際には、軸索内のミトコンドリアの大半が非運動性9,13,18。アクチン細胞骨格19-21に他の蛋白質アンカーのミトコンドリア中の軸索に沿って微小管の syntaphilin アンカー ミトコンドリアのような専門にされた蛋白質。成長因子およびカルシウムなどのイオンは、ミトコンドリアが必要な21,22,23の地域にローカライズするため運動の停止をサポートする報告されています。
一緒に取られて、人身売買とミトコンドリアのドッキングがニューロンの適切な機能のために不可欠です。、これを支持するミトコンドリア輸送の混乱が関連付けられているアルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、シャルコー ・ マリー ・ トゥース病、ハンチントン病、遺伝性痙性を含むいくつかの神経学的な条件対麻痺、視神経萎縮15,24,25,26,27.最近の研究が糖尿病神経障害、糖尿病28,29,30,31 に関連付けられている感覚の損失のための潜在的なメカニズムとしてミトコンドリアの機能低下と病理に焦点を当ててください。 ,32,33。仮説は、糖尿病が皮膚神経の感覚の投射内ミトコンドリアの分布を変更します。したがって、視覚化し、表皮内神経線維 (IENFs)、後根神経節感覚求心性神経の遠位先端内ミトコンドリアを定量化する技術が開発されました。技法を組み合わせた神経固有の分布を測定する強力な 3 D 画像解析ソフトウェアで信号の共焦点顕微鏡 z シリーズ取得特定のミトコンドリアと神経線維のラベルの蛍光免疫組織化学この目標を達成するために人間の皮膚パンチ生検からミトコンドリア。

<table><tbody><tr><td>2% Zamboni's Fixative</td><td>Newcomer Supply, Middleton, WI&nbsp;</td><td>1459A</td><td>2%パラホルムアルデヒド、0.2%飽和ピクリン酸、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4</td></tr><tr><td>10xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific, Pittsburgh, PA</td><td>BP399-4</td><td>To make up 1x PBS</td></tr><tr><td>Image-iT FX Signal Enhancer</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>I36933</td> enhances <td>Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding</td></tr><tr><td>Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal)</td><td>Proteintech Group Inc. Rosemont, IL</td><td>14730-1-AP</td><td>PGP9.5と略され、製造中止のAbDセロテック(Cat.No. 7863-0504) 抗体</td></tr><tr><td>抗ピルビン酸デヒドロゲナーゼ E2/E3bp 抗体 (マウス モノクローナル)</td><td>abcam, Cambridge, MA</td><td>ab110333</td><td>略して PDH</td></tr><tr><td>ヤギ アンチマウス 二次抗体 Alexa Fluor 594 コンジュゲート</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11034</td><td>赤色蛍光 コンジュゲート 二次抗体</td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ 二次抗体 アレクサ フロー 488 コンジュゲート</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>A-11032</td><td>緑色蛍光標識二次抗体</td></tr><tr><td>アルブミン, from Bovine Serum</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A7906-100</td><td>略称 BSA</td></tr><tr><td>Triton X- 100</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T9284</td><td>略称 TX-100</td></tr><tr><td>0.22 & micro;m</td><td>フィルターEMDミリポア、ビレリカ MA</td><td>MILLEX GP SLGP 033NS</td><td>0.22 & マイクロ;m ミリポアフィルター</td></tr><tr><td>パラフィルム M</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア</td>州 <td>13-374-10</td><td>カーウッドウィスコンシンLLCパラフィルム M (PM-996)</td></tr><tr><td>非校正ループ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア</td><td>州 22-032092</td><td>デコンによるループ接種 LeLoop (MP 199-25)</td></tr><tr><td>96ウェルアッセイプレート</td><td>コーニングインコーポレイテッド、コーニング、ニューヨーク</td><td>3603</td><td>96ウェルフラットボトムプレート</td></tr><tr><td>プロロングゴールド退色防止試薬DAPI</td>サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州</td><td>P-36931</td><td>原子核のDAPI染色</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス 50 x 24 mm</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア</td><td>州 12-544E</td><td>カバースリップ</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラス 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、ペンシルバニア</td><td>州 12-550-15</td><td>顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>ライカSP5レーザー走査型共焦点顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ、バッファローイリノイ州グローブ</td><td>SP5</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>Volocity x64 ソフトウェア&nbsp;</td><td>Perkin Elmer、Waltham、MA</td><td>バージョン4.4.0</td><td>Volocityソフトウェアは、画像処理</td></tr><tr><td>Imaris x64 3次元分析ソフトウェア</td><td>Bitplane、Concord、MA</td><td>バージョン7.7.1</td>の<td>ステップ3.1と3.2に使用されます Imarisソフトウェアは、画像分析のプロトコルのステップ3.3から3.5に使用されます</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft、レドモンド、WA</td><td>バージョンOffice 2013</td><td>Excelスプレッドシートソフトウェアは、形態測定の特徴を要約するためにプロトコルのステップ3.6に使用されます</td></tr><tr><td>Optimum Cutting Temperature Compound</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA</td><td>4583</td><td>略語 OCT</td></tr><tr><td>Leica Cryostat</td><td>Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL</td><td>CM1850</td><td>Cryostat for cutting 50 & micro;m sections</td></tr><tr><td>CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts</td><td>C10600</td><td>緑色蛍光シグナルでミトコンドリアを標識するためのポジティブコントロールとして使用</td></tr></tbody></table>

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

このプロトコルの目的は、表皮内神経線維内のミトコンドリアを勉強することです。したがって、神経固有のミトコンドリアを分離し、感覚神経の遠位先端のミトコンドリアの病気による変化を評価する 3 D 画像処理・解析技術が開発されました。プロトコルは、蛍光免疫組織化学、共焦点顕微鏡と神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して 3 D 画像解析手法を組み合わせたものです。詳細なパラメーターは、神経固有のミトコンドリアを分離するこれらのテクニックを使用する方法の具体的な例を提供するために手順の中で定義されます。抗体を用いて神経をラベルし、皮膚の組織切片内ミトコンドリア信号パンチ生検、それぞれ緑、赤の蛍光シグナルとミトコンドリア神経を視覚化する間接蛍光抗体法が続いています。Z シリーズ画像を共焦点顕微鏡で取得した、3 D 解析ソフトウェアが処理し、信号を分析する使用されました。記述されている正確なパラメーターに準拠する必要はありませんが、染色、集録・解析手順全体の選択のものと一致することが重要です。このプロトコルの強さださまざまな状況に適用されるそれ以外の場合、一人で勉強することが可能となるだろう他の信号を分離する 1 つの蛍光信号が使用されています。

可視化と人間 IENFs 内ミトコンドリアの定量化
蛍光免疫染色により, 神経, ミトコンドリアと核を視覚化する人間の皮膚生検内複数信号の同時表示が可能です。96 ウェル プレートは、免疫組織染色の手順を整理するための便利な方法です。図 1は、ソリューションの 12 段階を通じて処理する 8 つのセクションまでこの構成アカウントを示しています。フラット ロッカーで穏やかな攪拌と組み合わせてフローティング メソッドは、抗体に両側からセクションを貫通する十分なアクセス権があることを確認します。プロトコルの完了するために 3 日間は主に神経とミトコンドリアに一貫したラベル 4 ° c、第一次および二次抗体の孵化を一晩のため。
プロシージャの残りの...

このプロトコルは、神経固有のミトコンドリアを定量化を視覚化して三次元 (3 D) 画像処理・解析技術を使用します。テクニックは別の蛍光信号からデータのサブセットを分離する 1 つの蛍光信号が使用されている場合に適用されます。

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

このイメージングおよび解析手法の全体的な目的は、複雑なシグナルから特定の情報を抽出することです。具体的に本プロトコルでは、表皮内にある他のミトコンドリアと区別して、神経特異的なミトコンドリアを可視化および定量化する方法について解説します。この手法は、健康な個人の表皮内神経線維におけるミトコンドリアが、神経学的合併症を持つ患者の神経特異的なミトコンドリアとどのように異なるかなど、神経学分野における重要な問いに答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、複雑な信号から特定の情報を抽出できることです。このプロトコルにより、これらのストロー内の信号のように、周囲の信号から特定の信号を分離することが可能になります。まず、この図式に従って96ウェルプレートにラベルを貼り、皮膚生検組織の蛍光免疫組織化学染色の準備を行います。次に、二次抗体の非特異的結合を抑制するため、最上段の各ウェルにストック信号増強液を150 microlitersずつピペッティングします。96ウェルプレートの2段目と3段目の各ウェルに1x phosphate buffered salineを150 microlitersずつ加え、洗浄用ウェルを準備します。続いて、4段目のウェルに5%BSAブロッキング溶液を150 microlitersずつ加えます。一次抗体PGP9.5およびPDHを1% BSA洗浄液 1,500 µLで希釈し、5行目の各ウェルに150 µLずつ加えます。白金耳を用いて、切片を1行目のシグナル増強溶液へと移します。切片を5行目の一次抗体溶液に入れたら、蒸発を防ぐためにプレートをラボフィルムで密閉し、フラットロッカーを用いて室温で1時間攪拌します。4 °Cで一晩ロッキングしながらインキュベートします。2日目の手順として、96ウェルプレートの6行目、7行目、および8行目のウェルに1% BSA洗浄液を150 µLずつピペッティングします。1,500 µLの1% BSAに蛍光標識二次抗体を加えます。次に、二次抗体溶液 150 µL を 9 行目の各ウェルにピペッティングします。6、7、8 番目のウェルを通過させて切片を洗浄します。切片が 9 行目の二次抗体溶液に入ったら、プレートをパラフィルムで巻き、アルミホイルで覆って蛍光信号を保護します。前と同様にロッキングしながらインキュベートします。3日目に、滅菌フィルター済み1x PBSを150 µLずつ行10、11、および12にピペッティングします。サンプルを行10に移動させ、プレートをアルミホイルで覆います。室温でロッキングしながら1時間 rinsing（洗浄）します。次に、フィルターろ過済みの1x PBSを50 µLピペットでスライドガラスに滴下し、切片の封入準備を行います。洗浄が完了したら、12行目の切片をスライドガラス上に移し、DAPIを含む封入剤を切片の上に直接1〜2滴加えます。50 mm × 24 mm の 1.5 厚の顕微鏡用ガラスカバースリップを切片の上にそっと被せます。スライドを室温の暗所で一晩静置し、封入剤を硬化させてから、保存またはイメージングを行います。倒立型共焦点レーザー走査顕微鏡で 40X オイル浸漬対物レンズを選択します。核、神経線維、およびミトコンドリアをイメージングするために、適切なレーザーと検出器を選択します。顕微鏡ソフトウェアに、強度分解能12-bit、スキャンレート500 Hertz（2フレーム平均化あり）、ズーム2.2のスキャンパラメータを入力します。スキャン分解能に1024 by 1024を選択し、横方向の分解能が最適化されるように顕微鏡ソフトウェアを設定します。共焦点アパーチャーを1 air unitに、Zステップサイズを210 nanometersに設定し、軸方向分解能と光学セクショニングを最適化します。各シグナルを個別にスキャンし、検出器の電圧とオフセットを調整して、飽和および未飽和ピクセルを除去します。神経シグナルのライブスキャンを有効にし、顕微鏡ソフトウェアのZフォーカスコントロールを調整して、組織切片内の神経シグナルを含む上下の焦点面を検索し、設定します。蛍光信号のクロストークを排除するため、最終的なZシリーズをシーケンシャルスキャンでスキャンします。元の画像の複製画像上で、選択ツールを用いて表皮の周囲を囲み、角質層および真皮から表皮を分離します。その後、選択範囲に合わせて画像をクロップします。「calculate spread function」機能を用いて、緑色および赤色の蛍光共焦点信号の点広がり関数を算出します。次に、媒質の屈折率（オイル）を1.515に、40倍オイル浸漬対物レンズの開口数を1.25に設定します。検出器のピンホールを1 air unitに設定し、レーザー励起波長を選択します。反復復元を100% confidenceに設定し、反復回数の上限を10サイクルとし、緑色および赤色の蛍光信号のデコンボリューションには、それぞれ緑色および赤色のPSFを使用します。「create surface」ツールを使用して、デコンボリューションされた神経信号の周囲にサーフェスを作成します。その際、「smooth feature」のチェックを外し、閾値設定には「absolute intensity」を選択し、下限閾値を3,000、上限閾値を65,535に設定します。10 voxels以上のサーフェスを保持してください。Nerve surfaceの編集タブを使用して、単一の非神経表面を選択するか、Controlキーを押しながら複数の非神経表面を選択し、それらを除去します。Deleteボタンを押して、選択した非神経表面を削除します。Nerve surfaceの編集タブを使用し、マスクプロパティにある「mask all」ボタンを押します。新しいウィンドウで、「channel selection」の下にある「channel five mitochondria deconvolved」を選択し、「apply the mask」を適用する前に「duplicate channel」にチェックを入れます。「constant inside/outside」のラジオボタンを押し、「set voxels outside surface」を0.0に設定して「OK」ボタンを押します。最後に、「create surface」ツールを用いて、ミトコンドリア特異的なサーフェスを作成します。「uncheck smooth feature」を選択し、しきい値設定に「background subtraction」を使用することで、マスク処理されたデコンボリューション後のミトコンドリア信号の周囲にサーフェスを作成します。最大球の直径を1.50 micrometersに、下限閾値を2,000に、上限閾値を最大65,535に設定します。サーフェスは1.0 voxels以上に保つようにしてください。この代表的な3D共焦点顕微鏡画像は、神経特異的な緑色蛍光シグナルを示しています。神経信号に対して、シアン色で示される3Dサーフェスを作成します。次に、この神経サーフェスをマスキングツールとして使用し、皮膚の他のミトコンドリア信号から神経特異的なミトコンドリア信号を分離します。得られた神経特異的なミトコンドリア赤色蛍光信号を用いて、シアン色で示される神経サーフェス内のミトコンドリア周囲に、マゼンタ色で示されるサーフェスを作成します。これにより、神経線維内のミトコンドリアを詳細に観察することが可能になります。ここでは、ミトコンドリアの表面データをサイズ頻度ヒストグラムとして提示し、体積に基づいた各屈曲部に存在するミトコンドリアの割合を可視化しています。この手順を行う際は、切片全体に均一で一貫した染色を施すため、染色工程において組織が溶液に完全に浸っていることを確認し、慎重に取り扱うことが重要です。このビデオを視聴することで、ヒト表皮内神経線維におけるミトコンドリアの可視化および定量方法について十分に理解できるはずです。本詳細プロトコルは、ニューロパチーなどのミトコンドリア関連神経疾患の病態生理学的メカニズムを解明することを目的として、ヒト皮膚生検検体の染色、撮像、処理、および解析方法を他の研究者に指導するために設計されました。

three-dimensional-imaging-analysis-mitochondria-within-human

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:ハミド、H.S.、他.Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intradermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (2017)...

表皮内神経線維内のミトコンドリアの可視化

痛みを伴う神経障害（PN）における侵害受容性表皮内神経線維（IENFs）の変化を調べるために、我々が直接侵害受容IENFsで観察された三次元形態学的変化を調べることができるプロトコルを開発した。...

人間の皮膚生検における侵害受容性表皮内神経線維の三次元イメージング

動的な縦イメージングレポータートランスジェニックマウスにおける神経終末の選択的レーザ病変のためのプロトコルが提供される。...

皮膚における単一神経終末のin vivo二光子顕微鏡で

四次元（4D）画像化は、脊椎動物の神経末端を生体内エンドソームの2種類のうちの挙動および相互作用を研究するために利用される。これらの小さな構造の移動は、例えばエンドソーム融合およびエキソサイトーシスなどのイベントの確認を可能にする、三次元を特徴としている。...

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ミトコンドリアの輸送および形態の障害は、様々な神経変性疾患に関与している。提示されたプロトコルは、遺伝性痙攣対麻痺におけるミトコンドリア輸送および形態を評価するために、誘導多能性幹細胞由来前脳ニューロンを使用する。このプロトコルは、軸索に沿ったミトコンドリア人身売買の特徴付けとその形態の分析を可能にし、神経変性疾患の研究を容易にする。...

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光活性化可能なニューロフィラメントタンパク質を発現するトランスジェニックマウス由来の末梢神経の単一ミリン化軸索におけるニューロフィラメントの軸索輸送を解析する蛍光光活性化法について説明する。...

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

トランスジェニック蛍光マウスを用いて、生きた動物における無傷の坐骨神経の運動軸索および感覚軸索内のシグナル伝達エンドソームおよびミトコンドリアの インビボ 軸索輸送を評価するための詳細なプロトコールが記載されている。...

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。...

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マウス皮膚における触覚感覚軸索形態のバイタル2光子イメージング

ミトコンドリア染料標識の局所注射、シュワン細胞ミトコンドリアの生 体内...

マウスの筋肉および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の 現場 定量方法

学ぶ三次元画像解析による人間表皮内神経線維のミトコンドリア可視化・定量化法。蛍光免疫組織化学と共焦点顕微鏡を用いて、複雑な背景から神経特異的ミトコンドリア信号を分離し、神経疾患の病態理解に貢献する。

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

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