マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

この実験手順の全体的な目標は、脳スライスの直流刺激と、多電極アレイで記録された発作様活動への影響のために、記録チャンバー内の電極の配置にアクセスすることです。これは、直流刺激における重要な疑問や、マウスの脳スライスで発作様活動を記録した多電極アレイの答えに、より適切に答えることができます。この技術の利点は、直流刺激の効果をマウス脳スライスの特定の経路で評価できることです。

この手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるHsiang ChinとWei-Jen Changです。この手順では、実験前にすべての手術器具を75%エタノール溶液で滅菌します。次に、動物の頭蓋骨を露出させ、残りの筋肉を切り取ります。

次に、ロンジャーを使用して頭蓋骨の背側表面を剥がし、側面を切り取ります。その後、へらを使用して、脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断してから、それを取り除きます。氷のように冷たく、酸素化された、ACSFで満たされたビーカーに脳をすばやく移します。

MT-ACC経路を含むスライスを調製するには、各半球の正中線から2 mm外側に矢状切込みを行い、皮質下の解剖学的構造を表示します。次に、線条体の目に見える繊維路に平行に角度のついたクロスカットを作成します。小脳と視覚野の間の接続から、視床帯状回経路に平行で腹側にある前交連と視路の中点まで、2番目の角度付きクロスカットを作成します。

その後、シアノアクリレート接着剤でブレインブロックを角張ったプレートに取り付けます。通路の分岐点のすぐ上に切り込みを入れます。その後、プレートを広げて平らにし、ビブラトームのチャンバーステージに接着します。

続いて、脳スライスを500マイクロメートルの厚さで切片化し、氷冷酸素化ACSFに保持します。スライスを摂氏32度の記録チャンバーに移し、酸素化ACSFを1時間連続して大量に供給します。マルチチャンネルシステムへのMEAプローブの配置を確認します。

一方のチューブを使用してACSFをMEAチャンバーに誘導し、もう一方のチューブを使用してACSFをチャンバーからガイドします。摂氏30度で温かい酸素化ACSFで調製物を継続的に灌流します。濡れた綿棒を使用して、脳スライスをMEAに移します。

ブレインスライスを慎重に動かしてACCを電極の上に向け、スライスアンカーでブレインスライスを安定させて、スライスと電極の間の良好な電気的接続を確保します。その後、アノード電極をACCの近位に、カソード電極をACCの遠位に配置します。MEAの2つの磁場方向で電界強度を記録します。

次に、刺激装置を使用して電流を送ります。2つの塩化銀電極間の距離を約1.5〜2cmに調整し、刺激装置の電流強度を調整して、DCSを0.5〜2ミリアンペアにします。この手順では、MTにタングステン電極を配置し、刺激装置からスライスの視床領域にパルスを送達します。

次に、さまざまな電流強度を使用して、ACC応答を引き出すしきい値を決定します。タングステン電極を視床帯状回経路に沿って移動させ、最適な応答プロファイルを取得します。1〜20のACC応答を記録し、ソフトウェアを使用して、MT刺激を誘発したすべてのACC応答を自動的に平均

発作様の活動を誘発するには、灌流溶液に250マイクロモルの48Pと5マイクロモルのバイキュクリンを加え、スライスを2〜3時間大量に続けます。ポンプを比較的速い灌流速度に維持すると、pH勾配の蓄積を防ぐことができます。次に、タングステン電極をMTに配置し、電気刺激を送達してACC応答プロファイルを取得します。

10 から 20 回のスイープを記録し、応答を平均化します。その後、融合前溶液を新しいACSFと交換して、薬物を洗い流します。この手順では、MEAチャンバー内に配置された2本の平行な塩化銀コーティング銀ワイヤー間に電流を流すことにより、均一な電界の発生を確保します。

問題がない場合、DCSは0.5〜2ミリアンペアにとどまる必要があります。次に、DCSをオフにし、タングステン電極で視床を刺激します。ACCで最大のシナプス応答を取得するには、10〜20の応答を記録し、それらを平均化します。

次に、DCSをオンにし、同時に視床を刺激します。視床刺激が誘発した ACC 応答の振幅変化を評価します DCS 中。次に、DCSをオフにし、250マイクロモルの48Pと5マイクロモルのバイキュクリンを灌流溶液に追加し、2〜3時間待ちます。

薬物が脳スライスに影響を与える場合、スライスは皮質発作反応を引き起こすはずです。その後、10〜20の前帯状皮質反応を収集し、電気的に誘発された皮質発作反応の振幅と持続時間を測定します。巣を作り、DCSをオンにし、同時に視床を刺激します。

DCS適用中に誘発された皮質発作反応の振幅と持続時間の変化を評価します。その後、灌流液を新しいACSFと交換して、薬剤を洗い流します。この図は、ACCにおける視床刺激誘発反応、薬物誘発性発作様活性、視床刺激と薬物誘発性発作様活性の両方を含む、さまざまな誘発反応を示しています。

この図は、電界の異なる配向、視床刺激がDCSで誘発する反応、および陰極DCSが発作様活動に及ぼす影響など、DCSにおける異なる配向の影響を示しています。そしてこの図では、15分間の陰極DCSが効果的に長期のうつ病と抑うつ誘発反応を誘発したことが示されています。発作時間は、DCSを適用しない場合と比較して、陰極DCSの15分後に大幅に減少しました。

より速く、これは技術的には適切に実行されれば4時間で実行できます。この手順に続いて、抵抗性発作を制御するための非侵襲的アプローチを提供するなどの追加の質問に答えるために、経頭蓋磁気刺激などの他の事項を実行できます。この開発の後、この技術は、非侵襲的治療の分野の研究者が動物モデルで発作治療を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、現在の刺激を使用して脳スライスの発作様活動を評価する方法をよく理解しているはずです。