マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

この実験手順の全体的な目的は、脳切片への直流刺激における記録チャンバー内の電極配置を検討し、それがマルチ電極アレイで記録されるてんかん様活動に及ぼす影響を評価することです。これにより、直流刺激およびマウス脳切片におけるマルチ電極アレイで記録されたてんかん様活動に関する重要な疑問の解決に寄与します。本手法の利点は、マウス脳切片の特定の経路における直流刺激の効果を評価できることです。

手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるHsiang ChinとWei-Jen Changが行います。この手順では、実験前にすべての手術器具を75% ethanol溶液で滅菌してください。その後、動物の頭蓋骨を露出し、残っている筋肉を取り除きます。

次に、ロンジュールを用いて頭蓋骨の背側表面を剥離し、側面を切り落とします。続いて、スパチュラを使用して、脳を摘出する前に脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断します。速やかに、氷冷し酸素飽和させたACSFを満たしたビーカーに脳を移します。

MT-ACC経路を含む切片を調製するために、まず各半球の中線から外側に2 mmの位置で矢状切断を行い、皮質下解剖構造を露出させます。次に、線条体に見える繊維束に平行に、斜めに交差切断を行います。2回目の斜め交差切断は、小脳と視覚野の接続部から、視床帯状経路の腹側かつ平行に位置する前交連と視索の中点に向かって行います。

その後、シアノアクリレート系接着剤を用いて、脳ブロックを角度付きプレートに固定します。経路の転換点の直上で切断します。次に、プレートを展開して平らにし、ビブラトームのチャンバーステージに接着します。

続いて、脳スライスを500 micrometers の厚さで切断し、氷冷した酸素飽和ACSF中に保持します。スライスを、酸素飽和ACSFを連続灌流させた32 degrees Celsius の記録室へ移し、1時間置きます。マルチチャネルシステム上のMEAプローブの配置を確認します。

1本のチューブをMEАチャンバーへのACSF導入用に、もう1本のチューブをチャンバーからのACSF排出用に使用します。30 °Cに加温し酸素飽和させたACSFで、試料を連続的に灌流させます。濡らした綿棒を用いて、脳切片をMEAに転送します。

脳切片を慎重に移動させてACCを電極の上に配置し、次にスライスアンカーで脳切片を固定して、切片と電極との間で良好な電気的接続を確保します。その後、陽極電極をACCの近位に、陰極電極をACCの遠位に配置します。MEAの2つの電界方向を用いて電界強度を記録します。

次に、刺激装置を用いて電流を印加します。2本の塩化銀電極間の距離を約1.5～2 cmに調整し、刺激装置の電流強度を調整して、DCSを0.5～2 mAの間に設定します。この手順では、タングステン電極をMTに配置し、切片の視床領域に刺激装置からパルスを印加します。

次に、さまざまな電流強度を用いて、ACC反応を誘発する閾値を決定します。タングステン電極を視床帯状路に沿って移動させ、最適な反応プロファイルを得てください。1〜20回のACC反応を記録し、ソフトウェアを使用して、MT刺激によって誘発されたすべてのACC反応を自動的に平均化します。

発作様活動を誘導するため、灌流液に250 µMの48Pおよび5 µMのbicucullineを添加し、スライスへの灌流を2〜3時間継続させます。pH勾配の形成を防ぐため、ポンプを比較的速い灌流速度で維持してください。次に、タングステン電極をMTに配置し、電気刺激を与えてACC応答プロファイルを取得します。

10〜20回のスイープを記録し、応答の平均値を算出します。その後、プレフュージョン溶液を新鮮なACSFに交換し、薬剤を洗い流します。この手順では、MEAチャンバー内に配置した2本の平行な塩化銀コーティング銀線間に電流を流すことで、均一な電場が形成されるようにしてください。

問題がなければ、DCSは0.5から2ミリアンペアの間に維持されるはずです。次に、DCSをオフにし、タングステン電極で視床を刺激します。ACCにおいて最大のシナプス応答を得るために、10〜20回の応答を記録し、それらを平均化します。

次に、DCSをオンにし、同時に視床を刺激します。DCS中の視床刺激誘発ACC反応の振幅変化を評価します。ここでDCSをオフにし、灌流液に250 µMの48Pおよび5 µMのbicucullineを添加し、2〜3時間待ちます。

薬物が脳スライスに影響を与えた場合、スライスは皮質てんかん発作反応を示すはずです。続いて、前帯状皮質反応を10～20回収集し、電気刺激によって誘発された皮質てんかん発作反応の振幅と持続時間を測定します。次に、DCSをオンにし、同時に視床を刺激します。

DCS適用中の誘発皮質てんかん反応の振幅および持続時間の変化を評価します。その後、灌流液を新鮮なACSFに交換して薬剤を洗浄します。この図は、ACCにおける視床刺激誘発反応、薬剤誘発性のてんかん様活動、および視床刺激と薬剤誘発性の両方によるてんかん様活動を含む、異なる誘発反応を示しています。

この図は、電場内での向きの違い、DCSによる視床刺激誘発反応、およびカソードDCSが発作様活動に及ぼす影響など、DCSにおける異なる方向性の影響を示しています。また、この図では、15分間のカソードDCSが長期抑圧を効果的に誘導し、誘発反応を抑制したことが示されています。DCSを適用しなかった場合と比較して、15分間のカソードDCS適用後には、発作持続時間が有意に短縮しました。

適切に実施すれば、技術的には4時間で完了させることも可能です。本手順に続き、耐性てんかん発作を制御するための非侵襲的アプローチの提供など、さらなる疑問を解消するために、経頭蓋磁気刺激などの他の手法を実施することができます。この展開を経て、本手法は非侵襲的療法の分野の研究者が動物モデルにおける発作治療を探索するための道を開きました。

このビデオを視聴することで、電流刺激を用いて脳スライスにおけるてんかん様活動を評価する方法について、十分に理解することができます。