Name: マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: 学ぶマウス脳スライスにおける直流刺激とマルチ電極アレイを用いた発作様活動の記録法。この手法は神経回路における刺激効果を評価し、薬剤抵抗性てんかん治療への応用可能性を示唆する。

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私たちは、中央研究院の神経回路電気生理学コアからの技術サポートに感謝しています。この研究は、全米学術会議(102-2320-B-001-026-MY3および100-2311-B-001-003-MY3)および中央研究院の神経科学プログラムの支援を受けました。

動物被験体が関与する手順は、施設内動物管理と活用委員会、中央研究院、台北、台湾によって承認されました。 1.多電極アレイ記録のための実験的なソリューションと機器を準備<ol><li>人工脳脊髄液（aCSFの調製95％のO 2を通気124ミリモルのNaCl、4.4ミリモルのKCl、1mMののNaH 2 PO 3、2mMのMgSO 4を、2ミリモルのCaCl 2、25mMのNaHCO 3を、10 mMグルコース、および5％CO 2）。 </li><li> 6×10の平面MEAと8×8 MEA：MEAプローブの2種類を使用してください。前者のようなプローブは、皮質、線条体、および視床を備える領域を覆います。後者のプローブは、唯一の皮質領域をカバーしています。 </li><li> 0.1 Hzから1200増幅で3 kHzの間に設定したバンドパスフィルタで60チャンネルアンプを使用してください。 10 kHzのサンプリングレートでデータを取得します。 </li><li> DCS用MEA室内2のAgClコート銀ワイヤを配置します。 AgClを使用してくださいコー​​ティングされた銀ワイヤは、単離された刺激装置によって生成される電界を生成します。 </li><li>タングステン電極（;長さ、7.62センチメートル; 8°ACテーパーチップ;直径、127μmの抵抗、5MΩ）を配置視床刺激のために、およびMEAのチャンバー内の参照電極を配置します。パルス発生器によって制御され、単離された刺激装置を用いて、タングステン電極の電流を供給。 </li></ol> 2.脳スライスの準備<ol><li> 4-8週齢の雄のC57BL / 6Jマウスを、使用してください。食料と水を自由にアクセスできるハウスエアコンの動物（12時間/ 12時間の明/暗サイクル、午前8:00に点灯21-23°C;湿度50％）。 </li><li>ステップ1.1で調製したaCSFの250mlのアリコートを取り、氷を含んでいるビーカーに入れてください。同時に、95％O 2および5％CO 2で構成されている連続的なガスを供給する。 </li><li>手術<ol><li>ガラス中の4％イソフルランで動物を麻酔約3分間の箱。動物は（つま先のピンチへの応答の欠如によって示される）麻酔の外科的な深さに達すると、砕いた氷で満たされている浅いトレイの上に置き、はさみを使用してヘッドを取り外します。 </li><li>頭蓋骨を露出させ、残りの筋肉を切り落とします。次に、骨鉗子を使用して、脳から頭蓋骨の背側表面をはがします。骨鉗子を用いて、頭蓋骨の側面を切り取ります。 75％エタノール溶液で手術器具の全てを滅菌します。 </li><li>スパチュラを用いて、脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断し、脳を取り出します。断頭後、速やかに氷のように冷たい酸素化にaCSFで満たされたビーカーに脳を転送します。 </li></ol></li><li>内側視床（MT）-ACC脳スライスの作製 注：ACC 13へのMTからの経路が含まれているスライスを準備します。 <ol><li>ハンドカットの2矢状カット各半球における正中線に横2.0ミリメートルと脳のブロックを皮質下の解剖学的構造を表示します。その後、2角度付きカットを行います。線条体における可視光ファイバ管への最初のクロスカット、平行してください。 </li><li> thalamocingulate経路に腹側と平行で前交連と視索の間の中間点に小脳と視覚野との間の接続から第二のクロスカットを行います。 </li><li>シアノアクリレート系接着剤で、角板（〜120°）に脳のブロックを取り付け、単に経路の転換点以上のカットを行います。プレートを広げ、それを平らにし、ビブラトームのチャンバステージの上にのり。 </li><li>内側視床-ACC脳切片（厚さの500μm）を作成した後、記録室に氷のように冷たい酸素aCSF.Transferスライスでそれらを浸し、そして1のために酸素aCSFので連続灌流（12ミリリットル/分）下で32℃で維持時間。 </li></ol></li></ol>多電極アレイ記録用灌流チャンバーの調製<ol><li>準備灌流チャンバーの<ol><li>マルチチャネルシステム上MEAプローブを配置し、蠕動ポンプにプローブを接続するために2つの別々のポリエチレン管を使用しています。 MEA室と室の外にaCSFを導くために、他のチューブにaCSFのを案内するために、1つのチューブを使用してください。最後に、継続的に暖かい（29-30℃）で酸素化にaCSF（8 ml /分）で準​​備を灌流。 </li></ol></li><li> MEAに脳スライスを転送します。湿った綿棒を使用して、MEAの脳切片を押したままにします。慎重にACCが電極上に指向されていることを確認するために脳スライスを移動します。 </li><li>スライスアンカーキットを使用して、脳切片を押してダウンを保持します。このステップは、スライスと電極との間の良好な電気的接続を確実にします。 </li></ol> DCSによって電場の4世代注：電界配向の定義はACCにおける軸索樹状突起間の軸の方向に基づいていました。樹状突起と細胞体コンパートメントの向きがありましたゴルジ染色12を使用して確認しました。 <ol><li> ACCにAgCl電極（アノードとして定義される）近位に配置し、ACCの遠位に（陰極として定義される）他の電極を配置します。 MEAによる2つの電界の向き（ACC軸索樹状突起間繊維に平行および垂直）によって生成される電界強度を記録し、刺激を用いた電界の電流を供給します。 </li><li> AgCl電極（約1.5〜2センチメートル）の距離を修正し、ミリアンペア0.5〜2 DCSを作るために刺激装置の現在の強さを調整します。 </li></ol> 5.電気的に誘発された皮質シナプス応答注：プログラム可能な電気刺激発生器は、長方形の二相性の電流パルスを生成するには、MTに電気刺激によってACCにおけるシナプス応答を誘導します。 <ol><li>上記の繰り返しセクション3。 </li><li> MTでタングステン電極を配置し、サールに刺激からのパルスを届けます双極タングステン電極を介して、スライスのアミック地域。 </li><li> ACC応答を誘発するしきい値を決定するために、さまざまな現在の強度を使用してください。ここでは、ほとんどのスライスでACCで80％最大応答を誘発した200マイクロ秒の±150μAの強度および持続時間を、使用しています。 </li><li>最適な応答プロファイルを得るために、MT-ACCスライスに（脳梁にMTから）thalamocingulate経路に沿ってタングステン電極を移動します。 </li><li> ACC応答の10-20スイープを作成し、MTの刺激により誘発されるACCのすべてを自動的に平均化するためのソフトウェアを使用しています。 MT-ACC経路によってMT刺激から誘導されたACCにおけるシナプス応答ISS結果。 </li></ol> 6.電気的に誘発される発作のような活動発作様活性は、4-アミノピリジンの適用により誘導された（4-AP; 250μM）およびビククリン（5μM）：注意してください。前回コントロール研究は、最大かつ安定した応答が現れたことを示しました薬物適用14後の2〜3時間。 <ol><li>上記の繰り返しセクション5。 </li><li>灌流液に薬物を追加します。 4-AP（250μM）を使用し、ビククリン（5μM）。均一に薬を混ぜて、2-3時間灌流を続けます。 </li><li>発作様活性を容易にするために、また、pH勾配のビルドアップを防ぐことができ、比較的速い灌流速度（8ミリリットル/分）、で灌流ポンプを維持します。 </li><li> MTでタングステン電極を配置し、ACCの応答プロファイルを得るために、電気刺激（150μA、200マイクロ秒の持続時間）を提供します。 </li><li> 10-20スイープを作成し、応答を平均します。 </li><li>薬物を洗い流すために、新鮮なaCSFの灌流液を交換してください。繰り返しステップ6.5。 </li></ol>誘発皮質応答に対するDCS 7.テスト効果<ol><li>繰り返しセクション3と4は、Mの内側に配置された2つの並列のAgClコート銀ワイヤ間の電流を流すことにより生成される均一な電界を確認してくださいEA室。問題がない場合、DCSは0.5と2ミリアンペアの間にとどまります。 </li><li> DCSの電源をオフにして、（150μA、200マイクロ秒の持続時間を±）視床を刺激するためにタングステン電極を配置します。 ACCの最大シナプス応答を得るために、10月20日スイープを作成し、応答を平均します。 </li><li>同時に、DCS（2 MV / mmのDCSの強さ）と視床刺激（350μA、200マイクロ秒の持続時間）をオンにします。 DCS中の視床刺激誘発ACC応答の振幅の変化を評価します。 </li><li> DCSの電源をオフにし、灌流液に4-AP（250μM）およびビククリン（5μM）を追加します。その後、2〜3時間を待ちます。薬は脳切片に影響を与える場合には、スライスは、皮質発作応答を生成します。 </li><li> ACC応答の10-20スイープを行い、その後、電気誘発皮質発作応答の振幅と持続時間を測定します。 </li><li>ステップ7.5の後、同時にDCS（2 MV / mmのDCSの強さ）と視床刺激（150μA、200 duratiをオンにしますマイクロ秒に）。 DCSアプリケーションの間に誘発された皮質の発作応答の振幅と持続時間の変化を評価します。 </li><li>薬物を洗い流すために、新鮮なaCSFの灌流液を交換し、リピートは7.2と7.3を繰り返します。 </li><li>異なる実験条件にデータを記録するすべてのデータを収集し、グループ。異なる実験条件の下で皮質発作応答の振幅と持続時間を評価します。 </li></ol> 8.データ解析<ol><li> （ 例えば 、MCラックソフトウェア）が自動的に記録された応答を平均化するためのソフトウェアを使用して、スプレッドシートに生データをエクスポートします。生データの振幅と持続時間を分析し、色の数値を生成します。 </li><li>振動発作イベントを検出するために、ベースライン値と標準偏差（SD）を測定するためのソフトウェアを使用しています。閾値として、ノイズレベルの3 SDを設定します。このしきい値を超える振動イベント中のピークの振幅が自動的に検出されていますエド。 </li><li> スチューデントのt検定を用いて統計分析を行います。 </li><li>スライスの数を示すnのエクスプレスの測定値と平均値±SEとしてテキストで分散分析（ANOVA）の結果の一方向分析は、12を検討しました 。 </li></ol>

<ol><li>Schiller, Y., Najjar, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+response+to+antiepileptic+drugs%3A+effect+of+past+treatment+history%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying the response to antiepileptic drugs: effect of past treatment history.</a> Neurology. 70 (1), 54-65 (2008).</li>
<li>Fregni, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+controlled+clinical+trial+of+cathodal+DC+polarization+in+patients+with+refractory+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">A controlled clinical trial of cathodal DC polarization in patients with refractory epilepsy.</a> Epilepsia. 47 (2), 335-342 (2006).</li>
<li>Auvichayapat, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+direct+current+stimulation+for+treatment+of+refractory+childhood+focal+epilepsy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimul%22%5BJournal%5D)">Transcranial direct current stimulation for treatment of refractory childhood focal epilepsy.</a> Brain Stimul. 6 (4), 696-700 (2013).</li>
<li>Chung, M. G., Lo, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+brain+stimulation%3A+the+potential+for+use+in+the+rehabilitation+of+pediatric+acquired+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Noninvasive brain stimulation: the potential for use in the rehabilitation of pediatric acquired brain injury.</a> Arch Phys Med Rehabil. 96 (4 Suppl), S129-S137 (2015).</li>
<li>Del Felice, A., Magalini, A., Masiero, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow-oscillatory+Transcranial+Direct+Current+Stimulation+Modulates+Memory+in+Temporal+Lobe+Epilepsy+by+Altering+Sleep+Spindle+Generators%3A+A+Possible+Rehabilitation+Tool%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Stimul%22%5BJournal%5D)">Slow-oscillatory Transcranial Direct Current Stimulation Modulates Memory in Temporal Lobe Epilepsy by Altering Sleep Spindle Generators: A Possible Rehabilitation Tool.</a> Brain Stimul. 8 (3), 567-573 (2015).</li>
<li>Garnett, E. O., Malyutina, S., Datta, A., den Ouden, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Use+of+the+Terms+Anodal+and+Cathodal+in+High-Definition+Transcranial+Direct+Current+Stimulation%3A+A+Technical+Note%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromodulation%22%5BJournal%5D)">On the Use of the Terms Anodal and Cathodal in High-Definition Transcranial Direct Current Stimulation: A Technical Note.</a> Neuromodulation. , (2015).</li>
<li>Biraben, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+as+the+main+feature+of+epileptic+seizures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurol.+Neurosurg.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Fear as the main feature of epileptic seizures.</a> J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry. 70 (2), 186-191 (2001).</li>
<li>Zaatreh, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontal+lobe+tumoral+epilepsy%3A+clinical%2C+neurophysiologic+features+and+predictors+of+surgical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Epilepsia%22%5BJournal%5D)">Frontal lobe tumoral epilepsy: clinical, neurophysiologic features and predictors of surgical outcome.</a> Epilepsia. 43 (7), 727-733 (2002).</li>
<li>Karim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+truth+about+lying%3A+inhibition+of+the+anterior+prefrontal+cortex+improves+deceptive+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb.+Cortex%22%5BJournal%5D)">The truth about lying: inhibition of the anterior prefrontal cortex improves deceptive behavior.</a> Cereb. Cortex. 20 (1), 205-213 (2010).</li>
<li>Keeser, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+transcranial+direct+current+stimulation+changes+connectivity+of+resting-state+networks+during+fMRI%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal transcranial direct current stimulation changes connectivity of resting-state networks during fMRI.</a> J. Neurosci. 31 (43), 15284-15293 (2011).</li>
<li>Nelson, J. T., McKinley, R. A., Golob, E. J., Warm, J. S., Parasuraman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+vigilance+in+operators+with+prefrontal+cortex+transcranial+direct+current+stimulation+%28tDCS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroimage%22%5BJournal%5D)">Enhancing vigilance in operators with prefrontal cortex transcranial direct current stimulation (tDCS).</a> Neuroimage. 85 (Pt 3), 909-917 (2014).</li>
<li>Chang, W. P., Lu, H. C., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+direct-current+stimulation+against+cingulate+seizure-like+activity+induced+by+4-aminopyridine+and+bicuculline+in+an+in+vitro+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment with direct-current stimulation against cingulate seizure-like activity induced by 4-aminopyridine and bicuculline in an in vitro mouse model.</a> Exp. Neurol. 265, 180-192 (2015).</li>
<li>Lee, C. M., Chang, W. C., Chang, K. B., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+and+input-specific+short-term+plasticity+in+anterior+cingulate+cortical+neurons+with+intact+thalamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization and input-specific short-term plasticity in anterior cingulate cortical neurons with intact thalamic inputs.</a> Eur. J. Neurosci. 25 (9), 2847-2861 (2007).</li>
<li>Chang, W. P., Shyu, B. C. Involvement of the thalamocingulate pathway in the regulation of cortical seizure activity. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChang%2C+WP+%22Recent+Research+Developments+in+Neuroscience%22">Recent Research Developments in Neuroscience</a>. Pandalai, S. G. 4, Research Signpost. Kerala. 1-27 (2013).</li>
<li>Brummer, S. B., Turner, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+considerations+for+safe+electrical+stimulation+of+the+nervous+system+with+platinum+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Electrochemical considerations for safe electrical stimulation of the nervous system with platinum electrodes.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 24 (1), 59-63 (1977).</li>
<li>Durand, D. M., Bikson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+and+control+of+epileptiform+activity+by+electrical+stimulation%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+IEEE%22%5BJournal%5D)">Suppression and control of epileptiform activity by electrical stimulation: a review.</a> Proc. IEEE. 89 (7), 1065-1082 (2001).</li>
<li>Fritsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+current+stimulation+promotes+BDNF-dependent+synaptic+plasticity%3A+potential+implications+for+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning.</a> Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).</li>
</ol>

著者らは、競合する利益はないと宣言する。

本研究では、ACC発作様活性にDCSの持続時間と方向の効果を試験しました。マウス脳切片で安定したデータを取得するには、どのようにMT-ACC経路の整合性を保つために、それは、2角度を付け腹カットと皮質の背側カットが行われている、特にステップキーである損傷を避けるために。また、脳スライスを準備する時間も新鮮で強い脳を維持するための最短時間であるべき脳切片の活性に影響を与えることができます。以前の研究では、標的組織への電気化学的な損傷はin vivoでの準備15で発生する可能性があることを示しました。 インビトロでの脳スライス標本は、この問題を回避するために使用することができます。 in vitroでの準備では、組織は、直接このように、電気化学的効果16を最小限に抑え、電極に接触しません。 DCSの効果は、異なる方向に配向された電極と比較しました。ときelectrodESは90°、270°に配向された、DCSは誘発活性（ 図3）には影響しませんでした。した...

てんかんは一般的な神経障害です。てんかん患者の30%が薬剤耐性発作に苦しんでいます1。経頭蓋直流刺激(tDCS)は、発作などの大きな脳領域にわたるネットワーク活動を制御または変更するための非侵襲的なアプローチを提供します。臨床研究では、tDCSが難治性発作を効果的に治療し2、発作3-5に対して短期的および長期的な抑制効果を生み出すことができることが示されています。しかし、tDCSの作用の治療メカニズムはまだ不明です。提示された脳スライスモデルは、tDCS作用の治療メカニズムが発作様脳活動の症状をどのように変化させるかを調べるためのin vitro法です。したがって、その最適な効果を得るためには、方位、電界強度、刺激持続時間などの特定の刺激パラメータを実験モデルでテストする必要があります。これまでの研究では、治療効果を得るためには電界の向きが重要であることが示されています6。したがって、試験された脳スライスの位置に対する電極の向きを試験し、配置することが可能です。
前頭葉てんかんと前帯状皮質（ACC）発作は、しばしば薬剤耐性です7,8.いくつかの研究では、帯状皮質9-11におけるtDCSの適用が報告されています。tDCSは、ACC活動の変化を通じて警戒、意思決定、および感情に影響を与えることが示されており、この脳領域のニューロンの興奮性と発作活動を調節することができます12。したがって、ACC発作に対するtDCSの抑制効果は、臨床治療や代替治療の評価に役立つ可能性があります。
現在のプロトコルは、脳スライスのDCSのための記録チャンバー内の電極の準備と、それが多電極アレイ(MEA)による発作様活動記録に及ぼす影響を説明しています。

<table><tbody><tr><td><ストロング>麻酔薬:</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ハロカーボンプロダクツコーポレーション&nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>aCSF(total:1 L):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucose</td><td>MERCK</td><td>1.08337.1000</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>MERCK</td><td>1.06329.0500</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>MERCK</td><td>1.06404.1000</td><td>124</td></tr> <tr><td>mM(+)-ナトリウム L-アスコルビン酸、>=98%</td><td>SIGMA</td><td>A4034-100G</td><td>0.15 g/2 c.c</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム、無水、試薬プラス</td><td>SIGMA</td><td>M7506-500G</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>MERCK</td><td>1.02382.1000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム一水和物</td><td>MERCK</td><td>1.06346.1000</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>5月 &Baker Ltd Dagenham England</td><td>MS 7616</td><td>4.4 mM</td></tr><tr><td>Name</td><td>企業</td><td>カタログ番号</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drugs:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Bicuculline</td><td>TOCRIS</td><td>0130</td><td>5 &micro;aCSF</td></tr><tr><td>4-アミノピリジン</td><td>TOCRIS</td><td>0940</td><td>250 &micro の MA CSF</td></tr><tr><td>Name</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Brainスライス 準備:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>Series 1000</td><td>Block slicing into 500 &micro;m thick</td></tr> <tr><td>slices名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>MEAシステム:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multielectrode Array(MEA)プローブ:6 x 10平面MEA</td><td>マルチチャネルシステム</td><td>60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10</td><td>電極径、30 & マイクロ;m;電極間隔、500 & マイクロ;m;インピーダンス、50 k&Ω;200 Hz</td></tr><tr><td>マルチ電極アレイ(MEA)プローブ:8 x 8 MEA&nbsp;</td><td>Ayanda Biosystems</td><td>60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8</td><td>ピラミッド型電極; 直径, 40 & マイクロ;m;先端の高さ、50&マイクロ;m;電極間隔、200&マイクロ;m;インピーダンス、1,000 k&Omega;200 Hzで</td></tr><tr><td>60チャンネルアンプを使用し、バンドパスフィルターを0.1 Hz〜3 KHzに設定、1,200倍増幅でマルチ</td><td>チャンネルシステム</td><td>MEA-1060-BC</td><td></td></tr><tr><td>MCラックソフトウェア、10 KHzサンプリングレートで</td>マルチ<td>チャンネルシステム</td> パルス発生器の<td>データ収集と録音制御用マルチ</td>チャンネルシステム <td></td></tr><tr><td></td><td>STG</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>スライスアンカーキットとホールドダウン</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>SHD-26H / 10;WI64-0250</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ-ミニパルス3</td><td>ギルソム</td><td>MINIPULS3</td><td>灌流速度:8 ml /分</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>刺激システム:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolated stimulator</td><td>AMシステム</td><td>モデル2100</td><td>の強度&plusmn;350 μ;A 、持続時間 200 &mu;視</td></tr><tr><td>床に配置された</td>secタングステン<td>電極</td><td>AMシステム</td><td>575300</td></tr></tbody></table>

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

陰極経頭蓋直流刺激（TDCの）は、薬剤耐性発作の抑制効果を誘導します。効果的なアクションを実行するために、刺激パラメータ（ 例えば 、配向、磁界強度、および刺激期間）は、マウスの脳スライス標本で検査する必要があります。試験マウスの脳切片の位置に電極の向きを配置も可能です。本発明の方法は、前帯状皮質の発作のような活動にDCSの効果を評価するthalamocingulate経路を保持します。マルチチャンネル・アレイ・レコーディングの結果は陰極DCSが大幅に4-アミノピリジン及びビククリン誘発性発作様活性の刺激誘発応答の振幅および持続時間を減少することが示されました。この研究はまた15分で陰極DCSアプリケーションがthalamocingulate経路の長期不況を引き起こしたことがわかりました。本研究は、thalamocingulat上のDCSの影響を調査します電子シナプス可塑性および急性発作のような活動。現在の手順は、in vitroマウスモデルにおける配向、磁界強度、および刺激期間を含む最適な刺激パラメータをテストすることができます。また、この方法は、両方の携帯電話やネットワークレベルでの皮質発作のような活動にDCSの効果を評価することができます。

ThalamocingulateスライスとMEA記録システムのセットアップの準備マウスからのMT-ACCスライスはthalamocingulate経路の電気生理学的特性の探査を可能にする特殊なスライス標本である。 図1Aは、MT-ACCスライスが用意された方法を示しています。マウスの脳を速やかに除去し、（ 図1A、B）クール酸素aCSFの中に保持しました。皮質下の解剖学的構造を明らかにするために、脳2.0 mmは矢状脳ブロック（ 図の1A、C、D）を取得するために、各半球に正中線からの横切断しました。二つの傾斜腹カットはthalamocingulate経路を保持するために、脳のブロ​​ックで行われました。最初のクロスカットは、脳のブロ​​ックの前に線条体における可視光ファイバ管に平行に行われました。第二クロスカットは、接続ベットから脳ブロックの後部に...

研究によると、陰極経頭蓋直流刺激は薬剤耐性発作に対する抑制効果を生み出すことができます。本研究では、マウスの脳切片調製において、直流刺激と発作様活動の多電極アレイ記録を評価するin vitro実験装置を考案した。直流刺激パラメータを評価しました。

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

この実験手順の全体的な目的は、脳切片への直流刺激における記録チャンバー内の電極配置を検討し、それがマルチ電極アレイで記録されるてんかん様活動に及ぼす影響を評価することです。これにより、直流刺激およびマウス脳切片におけるマルチ電極アレイで記録されたてんかん様活動に関する重要な疑問の解決に寄与します。本手法の利点は、マウス脳切片の特定の経路における直流刺激の効果を評価できることです。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるHsiang ChinとWei-Jen Changが行います。この手順では、実験前にすべての手術器具を75% ethanol溶液で滅菌してください。その後、動物の頭蓋骨を露出し、残っている筋肉を取り除きます。次に、ロンジュールを用いて頭蓋骨の背側表面を剥離し、側面を切り落とします。続いて、スパチュラを使用して、脳を摘出する前に脳の腹側表面に沿って嗅球と神経接続を切断します。速やかに、氷冷し酸素飽和させたACSFを満たしたビーカーに脳を移します。MT-ACC経路を含む切片を調製するために、まず各半球の中線から外側に2 mmの位置で矢状切断を行い、皮質下解剖構造を露出させます。次に、線条体に見える繊維束に平行に、斜めに交差切断を行います。2回目の斜め交差切断は、小脳と視覚野の接続部から、視床帯状経路の腹側かつ平行に位置する前交連と視索の中点に向かって行います。その後、シアノアクリレート系接着剤を用いて、脳ブロックを角度付きプレートに固定します。経路の転換点の直上で切断します。次に、プレートを展開して平らにし、ビブラトームのチャンバーステージに接着します。続いて、脳スライスを500 micrometers の厚さで切断し、氷冷した酸素飽和ACSF中に保持します。スライスを、酸素飽和ACSFを連続灌流させた32 degrees Celsius の記録室へ移し、1時間置きます。マルチチャネルシステム上のMEAプローブの配置を確認します。1本のチューブをMEАチャンバーへのACSF導入用に、もう1本のチューブをチャンバーからのACSF排出用に使用します。30 °Cに加温し酸素飽和させたACSFで、試料を連続的に灌流させます。濡らした綿棒を用いて、脳切片をMEAに転送します。脳切片を慎重に移動させてACCを電極の上に配置し、次にスライスアンカーで脳切片を固定して、切片と電極との間で良好な電気的接続を確保します。その後、陽極電極をACCの近位に、陰極電極をACCの遠位に配置します。MEAの2つの電界方向を用いて電界強度を記録します。次に、刺激装置を用いて電流を印加します。2本の塩化銀電極間の距離を約1.5～2 cmに調整し、刺激装置の電流強度を調整して、DCSを0.5～2 mAの間に設定します。この手順では、タングステン電極をMTに配置し、切片の視床領域に刺激装置からパルスを印加します。次に、さまざまな電流強度を用いて、ACC反応を誘発する閾値を決定します。タングステン電極を視床帯状路に沿って移動させ、最適な反応プロファイルを得てください。1〜20回のACC反応を記録し、ソフトウェアを使用して、MT刺激によって誘発されたすべてのACC反応を自動的に平均化します。発作様活動を誘導するため、灌流液に250 µMの48Pおよび5 µMのbicucullineを添加し、スライスへの灌流を2〜3時間継続させます。pH勾配の形成を防ぐため、ポンプを比較的速い灌流速度で維持してください。次に、タングステン電極をMTに配置し、電気刺激を与えてACC応答プロファイルを取得します。10〜20回のスイープを記録し、応答の平均値を算出します。その後、プレフュージョン溶液を新鮮なACSFに交換し、薬剤を洗い流します。この手順では、MEAチャンバー内に配置した2本の平行な塩化銀コーティング銀線間に電流を流すことで、均一な電場が形成されるようにしてください。問題がなければ、DCSは0.5から2ミリアンペアの間に維持されるはずです。次に、DCSをオフにし、タングステン電極で視床を刺激します。ACCにおいて最大のシナプス応答を得るために、10〜20回の応答を記録し、それらを平均化します。次に、DCSをオンにし、同時に視床を刺激します。DCS中の視床刺激誘発ACC反応の振幅変化を評価します。ここでDCSをオフにし、灌流液に250 µMの48Pおよび5 µMのbicucullineを添加し、2〜3時間待ちます。薬物が脳スライスに影響を与えた場合、スライスは皮質てんかん発作反応を示すはずです。続いて、前帯状皮質反応を10～20回収集し、電気刺激によって誘発された皮質てんかん発作反応の振幅と持続時間を測定します。次に、DCSをオンにし、同時に視床を刺激します。DCS適用中の誘発皮質てんかん反応の振幅および持続時間の変化を評価します。その後、灌流液を新鮮なACSFに交換して薬剤を洗浄します。この図は、ACCにおける視床刺激誘発反応、薬剤誘発性のてんかん様活動、および視床刺激と薬剤誘発性の両方によるてんかん様活動を含む、異なる誘発反応を示しています。この図は、電場内での向きの違い、DCSによる視床刺激誘発反応、およびカソードDCSが発作様活動に及ぼす影響など、DCSにおける異なる方向性の影響を示しています。また、この図では、15分間のカソードDCSが長期抑圧を効果的に誘導し、誘発反応を抑制したことが示されています。DCSを適用しなかった場合と比較して、15分間のカソードDCS適用後には、発作持続時間が有意に短縮しました。適切に実施すれば、技術的には4時間で完了させることも可能です。本手順に続き、耐性てんかん発作を制御するための非侵襲的アプローチの提供など、さらなる疑問を解消するために、経頭蓋磁気刺激などの他の手法を実施することができます。この展開を経て、本手法は非侵襲的療法の分野の研究者が動物モデルにおける発作治療を探索するための道を開きました。このビデオを視聴することで、電流刺激を用いて脳スライスにおけるてんかん様活動を評価する方法について、十分に理解することができます。

direct-current-stimulation-multi-electrode-array-recording-seizure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このビデオでは、マルチシャンク線形シリコンプローブをマウスの脳に埋め込んで局所電界電位を測定するためのプロトコルの概要を示しています。この手順では、プローブを定位固定装置に固定し、標的の脳領域に正確に配置し、脳に挿入し、歯科用セメントで固定します。移植後、アセンブリはケーシングで保護されます。回復後、このセットアップにより、局所的な電界電位を記録することができ、ニューロンの活動に関する洞察が得られます。...

マルチシャンク線形シリコンプローブを用いた行動マウスの脳電気的活動の記録

このプロトコルは、発作誘発薬にさらされた脳スライスの電気的活動を記録するために微小電極アレイ(MEA)を使用することを含みます。この手順には、脳スライスをMEA記録チャンバーに配置すること、電気刺激を加えて人工発作を誘発すること、および結果として生じる信号を分析することが含まれます。...

微小電極アレイを用いた脳切片における発作誘発性神経電気活動のモニタリング

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発作誘発剤に応答した多電極アレイによる脳皮質のモニタリング

このビデオは、マウスの脳切片のてんかん発作に対する直流刺激(DCS)の影響を評価するための研究を示しています。接続された内側視床 (MT) と前帯状皮質 (ACC) 領域を含む脳スライスは、多電極アレイ (MEA)...

マウス脳切片における誘発性てんかん発作に対する直流刺激の影響

このビデオは、皮質興奮性錐体ニューロンの光活性化陽イオンチャネルを発現するトランスジェニックマウスの冠状皮質スライスにおける発作イベントの誘導を示しています。スライスを記録室に入れ、記録電極を表在皮質層に挿入します。カリウムチャネルを遮断する発作誘発薬を投与すると、ニューロンは過興奮性になり、自発的な発作イベントを引き起こします。オンデマンドの発作イベントを生成するには、短い光パルスを使用して錐体ニューロンの陽イオンチャネルを活性化し、興奮性神経伝達物質の放出を誘発し、シナプス後ニューロンが短時間発作イベントを生成するように誘導します。...

マウス脳皮質スライスにおける自発的およびオンデマンドの発作イベントの生成

ここでは、人間のてんかん皮質組織のマルチ電極アレイの録音を実行する方法について説明します。発作と発作事象の癲癇組織切除、スライス標本と多電極アレイ記録は詳細に実証される。...

人間のてんかん術後皮質組織の多電極アレイ録音

微小電極アレイを用いたげっ歯類脳スライス 4 アミノピリジン誘発てんかん活動の記録と電気変調を実行する方法を示します。カスタム記録室は、長期の実験的セッションを通して組織実行可能性を維持します。電極マッピングをライブ、刺激的なペアの選択は、カスタム グラフィカル ユーザー...

記録と電極アレイに結合された齧歯動物の脳スライスにおけるてんかん活動の変調

急性発作モデル、てんかんイベントの基になるメカニズムを研究するために重要です。さらに、てんかんイベント オンデマンドを生成する能力は彼らの開始の基になるイベントの正確なシーケンスを調査する非常に効率的な手法を提供します。ここでは、マウスやヒトの組織に設立された急性...

齧歯動物および人間のティッシュの急性発作活動の生成とオン ・ デマンド開始

提示されたプロトコルは、潜在的な抗てんかん物質の前臨床評価ツールとして重要な脳スライスを使用するという究極の目標を持つ切除されたヒト海馬組織の輸送および調製について説明する。...

電気生理学的記録のための急性ヒト海馬スライスの調製

ここでは、相補型金属酸化膜半導体高密度微小電極アレイシステム(CMOS-HD-MEA)を使用して、 ex vivo...

相補型金属酸化物半導体高密度微小電極アレイシステムによる急性脳切片からの高品質発作様活性

学ぶマウス脳スライスにおける直流刺激とマルチ電極アレイを用いた発作様活動の記録法。この手法は神経回路における刺激効果を評価し、薬剤抵抗性てんかん治療への応用可能性を示唆する。

マウス脳スライスの準備中に発作のような活動の直流刺激とマルチ電極アレイ録音

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