多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

本手法の全体的な目的は、マルチスペクトルイメージングを用いて、タンパク質の発現および共局在を客観的に定量化することです。この手法は、治療後や疾患の進行に伴いタンパク質の発現や局在がどのように変化するかなど、基礎研究や診断病理学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の最大の利点は、従来の定量手法に内在していた操作者の主観性を排除できることです。

定量化プロセスを開始するには、個別の発色剤で染色した調製済みのコントロールスライドおよびヘマトキシリン染色スライドを用いてスペクトルライブラリを構築するため、マルチスペクトルイメージングソフトウェアを開きます。次に、コントロールスライドから取得したイメージキューブを開き、陽性に染色された領域を4〜5か所選択して、光学的に発色剤を定義します。すべての発色剤を表す完全なスペクトルライブラリが作成されるまで、他のコントロールスライドのイメージキューブで同様の手順を繰り返し、最後にスペクトルライブラリを保存します。

マルチスペクトルイメージングソフトウェア内で新しいプロジェクトを開始し、画像フォーマットのオプションでMultispectralまたはim3を選択し、サンプルフォーマットでBrightfieldを選択します。次に、segment tissue、find features、phenotyping、score、およびexportを選択してプロジェクトを構成します。必要に応じて、解析時間を短縮するために画像解像度を変更してください。

previously作成したスペクトルライブラリをインポートし、解析に含めるすべての発色剤を選択します。「Open Image Cube」オプションを選択して、トレーニングデータセットに含めるイメージキューブを開きます。トレーニングの精度を確保するため、解析対象の全画像数の少なくとも18%を選択してください。

次に、学習用の画像セットを選択します。セグメンテーションの精度を高めるため、すべての病態を代表する画像を選んでください。このステップにおけるバイアスを避けるため、学習セットには十分な数のネガティブ染色画像を含めてください。

スポイトツールを選択し、画像内の白い領域を指定して、トレーニングセットの画像のホワイトバランスを調整します。[advance]ボタンを選択して、組織セグメンテーションに進みます。次に、組織カテゴリーパネルを使用して、分析する組織タイプを選択します。より正確なタンパク質の組織局在を特定するには、組織カテゴリーの選択機能を利用してください。

ペンツールを使用して、トレーニング画像内の細胞群を囲むように描画し、アルゴリズムの作成と組織カテゴリーの定義を開始します。1つの組織カテゴリーが完了したら、他の組織カテゴリーに対してもこの手順を繰り返します。その組織カテゴリータイプを特徴づける細胞群を画像内で選択するようにしてください。

組織セグメンターのトレーニングに含めるコンポーネントを選択します。組織セグメンターをトレーニングするための適切なパターンスケールを選択してください。次に、トレーニング済み組織セグメンターボタンを選択します。

適切に分類されたトレーニング領域内のピクセル割合の精度を表示するポップアップボックスを確認してください。「segment images」をクリックして、トレーニング画像のセット全体をセグメント化します。完了後、トレーニングセットを確認し、現在のトレーニングアルゴリズムで誤分類された組織がないかを確認してください。

組織セグメンテーションアルゴリズムの結果に十分な確信が持てたら、「advance」ボタンを選択してください。細胞質および/または細胞膜を選択するには、あらかじめ核が選択されている必要があります。「nuclei」タブを選択し、核セグメンテーションに適した設定を選択してください。

次に、個別の組織カテゴリーまたはすべての組織カテゴリーをセグメンテーションに含めるかを選択します。良好な結果を簡単に得るための方法として、対比染色オブジェクトベースの閾値アプローチを選択してください。続いて、信頼性の高い核対比染色に基づいたオブジェクトベースの閾値アプローチを選択します。

細胞質タブを選択して、細胞質の形状パラメータを選択します。次に、「核への外部距離」を選択します。その後、「最小サイズ」を選択します。

プライマリ、セカンダリ、およびサードレベルのオプションをそれぞれプライマリ、セカンダリ、セカンダリとして次オプションコンポーネントを選択します。メンブレンタブに移動します。使用するメンブレン特異的マーカーとして「first」を選択します。

フルスケールの光学的密度（OD）を調整し、細胞膜上の各マーカーについて最小しきい値または陽性値を設定します。続いて、「membrane」タブで最大細胞サイズを選択します。すべてのオプションを選択した後、「segment all」を選択します。

設定を画像に適用し、観察します。[advance]を選択してIHCスコアリングのステップへ進み、スコアリングを行う組織カテゴリーを選択します。希望するスコアリングタイプを選択し、スコアリング解析に使用する細胞コンパートメントを選択します。

次に、「view component data」を選択し、トレーニング画像上でカーソルを移動させて、目的のコンポーネントにおける陽性細胞の染色の適切な光学密度最小しきい値を決定します。組織セグメンテーション、細胞セグメンテーション、およびスコアリング値を通じて作成されたアルゴリズムをテストするため、トレーニングセットのデータをエクスポートします。プロンプトに従い、エクスポート先として新しいフォルダを作成してください。解析に作成および含める画像とテーブルを選択します。

次に、「すべてエクスポート」を選択して解析を実行します。解析完了後、染色の強弱がある両方の画像の細胞セグメンテーションおよびスコアリングデータを確認し、設定の正確性を評価します。設定に問題がないことが確認できたら、「バッチ解析」タブをクリックして、アルゴリズムをアクティブなプロジェクトにコピーします。

次に、新しいエクスポートディレクトリを選択し、解析に含める画像とテーブルを選択します。「input files」オプションで、バッチ解析に含めるすべての画像を選択してください。「run」オプションを選択して解析を実行します。

完了したら、「review merge」タブに進みます。「include all」を選択し、「merge」を選択して、解析用のサマリーデータを含むデータシートを作成します。本トレーニングは前立腺組織を用いて行われ、画像を上皮部分と間質部分にセグメント化しました。

非組織領域とともに、全画像セットの組織型および疾患状態を表す一連のトレーニング画像をマルチスペクトルイメージングソフトウェアにインポートした。間質、上皮、および非組織を含む組織カテゴリーを作成し、トレーニング画像上に手動で描画することでカテゴリーを定義した。

組織セグメンテーション用のアルゴリズムを作成し、画像トレーニングセットに適用して、組織の正確なセグメンテーションを行った。マルチプレックス免疫組織化学染色法を用い、色の重なりやメトリック信号があるにもかかわらず、赤色で示されるER-alphaの核発現陽性細胞と、茶色で示されるAR陽性細胞を同定した。また、黒色で示されるE-cadherinをマーカータンパク質として使用し、CD-147の細胞膜特異的な発現量を定量化した。

このビデオを視聴することで、パラフィン包埋組織におけるタンパク質発現の定量化および共局在化の解析方法について、十分に理解することができます。