多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。

この分析法の全体的な目標は、マルチスペクトルイメージングを使用してタンパク質の発現と共局在を客観的に定量することです。この方法は、治療後や疾患の進行においてタンパク質がどのように発現や局在を変化させるかなど、基礎研究や病理診断分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、従来の定量化方法に固有のオペレーターの主観性を取り除くことです。

定量プロセスを開始するには、マルチスペクトルイメージングソフトウェアを開き、個々の発色剤で染色した以前に調製したコントロールスライドとヘマトキシリン染色スライドからスペクトルライブラリを構築します。次に、コントロールスライドから取得した画像キューブを開き、陽性に染色された4〜5つの領域を選択して、発色原を光学的に定義します。他のコントロールスライドのイメージキューブを使用して、すべての発色体を表す完全なスペクトルライブラリが作成されるまでこの手順を繰り返し、スペクトルライブラリを保存します。

マルチスペクトルイメージングソフトウェア内で新しいプロジェクトを開始するには、画像フォーマットオプションとしてMultispectrumまたはim3を選択し、サンプルフォーマットとしてBrightfieldを選択します。セグメント組織、特徴の検索、表現型、スコアリング、およびエクスポートを選択して、プロジェクトを構成します。必要に応じて、画像の解像度を変更して分析時間を短縮します。

以前に作成したスペクトルライブラリをインポートし、解析に含めるすべての発色源を選択します。トレーニング データ セットに含めるイメージ キューブを開くには、[イメージ キューブを開く] オプションを選択します。トレーニングの精度を確保するために、分析する画像の総数の少なくとも 18% を選択します。

次に、画像のトレーニング セットを選択します。セグメンテーションの精度を高めるために、すべての病状を表す画像。このステップでのバイアスを避けるために、トレーニングセットに豊富なネガティブ染色画像を含めます。

トレーニング セット内の画像のバランスを取って、スポイト ツールを選択し、1 つの画像内の白い領域を選択します。進むボタンを選択して、組織のセグメンテーションを移動します。次に、組織カテゴリーパネルを使用して、より正確なタンパク質組織局在化のために分析する組織タイプを選択し、選択した組織カテゴリーを使用できます。

ペンツールを使用してアルゴリズムを作成し、組織カテゴリを定義するには、トレーニング画像内の細胞グループを描画します。1つの組織カテゴリが終了したら、他の組織カテゴリについてもこの手順を繰り返します。画像内の細胞のグループは、組織カテゴリータイプに特徴的なものを選択してください。

組織セグメンターのトレーニングに含めるコンポーネントを選択します。組織セグメンターを学習させるための適切なパターンスケールを選択します。次に、トレーニング済みの組織セグメンター ボタンを選択します。

適切に分類されたトレーニング領域内のピクセルの割合の精度を示すポップアップボックスを観察します。[画像のセグメント化] をクリックして、画像のトレーニング セット全体をセグメント化します。終了したら、トレーニング セットを見直して、現在のトレーニング アルゴリズムで誤って分類された組織を見つけます。

組織セグメンテーションアルゴリズムの結果に自信がある場合は、Advanceボタンを選択します。細胞質および/または膜を選択するために、核がすでに選択されていることを確認してください。[nuclei] タブを選択し、核セグメンテーションの適切な設定を選択します。

次に、個々の組織カテゴリまたはすべての組織カテゴリをセグメンテーションに含めるかどうかを選択します。サンプル染色オブジェクトベースのしきい値アプローチを選択すると、良好な結果が得られる簡易な方法になります。次に、信頼性の高い核対比染色に対するオブジェクトベースの閾値アプローチを選択します。

細胞質の形をしたパラメータを選択するには、cytoplasm tabを選択します。次に、原子核までの外距離を選択します。次に、最小サイズを選択します。

次のオプション component(primary, secondary)を選択し、セカンダリ オプションとして tertiary を選択します。メンブレンタブに移動します。使用するメンブレン特異的マーカーを最初に選択します。

フルスケールの光学濃度またはODを調整して、細胞膜上の各マーカーの最小閾値または正の値を見つけます。メンブレンタブで続けて、最大セルサイズを選択します。すべてのオプションを選択したら、[すべてセグメント化]を選択します。

画像に設定を適用し、観察します。アドバンスを選択してスコアIHCステップに移動し、スコアリングする組織カテゴリを選択します。目的のスコアリングタイプを選択し、スコアリング分析で使用するセルコンパートメントを選択します。

次に、View Component Dataを選択し、学習画像の上にカーソルを移動して、目的の成分の陽性細胞の染色の適切な光学密度最小閾値を見つけます。トレーニングセットのデータをエクスポートして、組織セグメンテーション、細胞セグメンテーション、スコアリング値によって作成されたアルゴリズムをテストします。プロンプトに従って、エクスポートディレクトリ用の新しいフォルダを作成します。作成して分析に含める画像とテーブルを選択します。

次に、すべてのエクスポートを選択して分析を実行します。解析が完了したら、染色度の高い画像と低い画像の両方の細胞セグメンテーションとスコアリングデータを表示し、設定の精度を評価します。設定に問題がなければ、バッチ分析タブをクリックして、アルゴリズムをアクティブなプロジェクトにコピーします。

次に、新しいエクスポートディレクトリを選択し、分析に含める画像とテーブルを選択します。入力ファイルオプションの下で、バッチ分析に含めるすべての画像を選択します。分析を実行する実行オプションを選択します。

完了したら、[Review Merge] タブに進みます。[Include all] を選択し、[merge] を選択して、分析用のサマリー データを含むデータ シートを作成します。前立腺組織に対してトレーニングを行い、画像を上皮部分と間質部分に分割しました。

非ティッシュコンパートメントと一緒に。一連のトレーニング画像をマルチスペクトルイメージングソフトウェアにインポートし、画像セット全体の組織タイプと疾患状態を表現しました。間質、上皮、非組織などの組織カテゴリが作成され、トレーニング画像の上に手動で描画することでカテゴリが定義されました。

組織セグメンテーションのアルゴリズムが作成され、画像のトレーニングセットに適用されました。組織を正確にセグメント化します。マルチプレックス免疫組織化学技術を使用して、赤で見えるER-αの核発現に陽性の細胞と茶色で見えるARが、重複する色とメトリックシグナルにもかかわらず同定されましたCD-147の細胞膜特異的発現は、マーカータンパク質として黒で見えるE-キャサリンを使用して定量されました。

このビデオを見れば、タンパク質の発現と共局在の定量化、パラフィン包埋組織への情報提供、固定の方法について十分に理解できるはずです。