細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

本手順の目的は、多色スペクトル解析を用いて、マルチプレックス細胞組成またはその模倣体を評価し、骨髄resident集団が腫瘍ストロマの形成にどのように寄与しているかを決定することである。具体的には、まず、トランスジェニックGFP標識レシピエントマウスにRFP発現骨髄幹細胞を移植する。次に、目的の腫瘍細胞を同一のレシピエントに注入し、生着後に摘出した腫瘍を切片化してパラフィン包埋し、免疫蛍光抗体で標識する。

次に、スペクトルライブラリが完成すると、腫瘍切片の画像取得に使用されるすべての波長のスペクトルライブラリが作成されます。最終ステップでスライドの撮像を行い、データ解析を行うことで、目的の細胞マーカーの染色パターンの同定および関連付けが可能になります。最終的に、細胞外および細胞マーカーのマルチプレックス標識に基づいて、新規の細胞実体や表現型を同定でき、腫瘍微小環境のような複雑な組織の構成をより詳細に理解することができます。

この手法の標準的な免疫蛍光染色法に対する主な利点は、マルチスペクトル解析によって同一スライド上で7種類以上の蛍光色素を多重化できることであり、これにより腫瘍微小環境や再生組織の細胞組成をより精密かつ詳細に解析することが可能になります。本手法は腫瘍微小環境の起源や組成に関する知見を提供できますが、再生医療、発生生物学、免疫生物学などの他の系にも応用可能です。Spa博士と共にこの手順を実演するのは、私の研究室のリサーチアシスタントであるChris Boothです。本施設におけるIACUCの制限により、マウスに対する直接的な操作については説明のみを行い、映像では示しません。

これらの骨髄処置および腫瘍生着技術については、Kid et al. (2009) などの過去の報告をご参照ください。対側の後肢から骨髄細胞を単離した後、マウス1匹あたりPBS 100 µLにつき2 million cellsの濃度で細胞を再懸濁します。ヒートランプを用いて、放射線照射したレシピエントGFPマウスの血管を拡張させ、マウスを尾静脈注射用拘束具に固定します。

29ゲージの針の刃先を上にして、細胞懸濁液を尾静脈または後眼静脈に全身投与します。注射後、滅菌ガーゼを用いて尾部に軽く圧迫止血を行います。注射当日に、生着コントロールとして、マウス1匹に100 µLのPBSのみを投与します。

目的の腫瘍細胞をPBSで再懸濁し、100 µLあたり100万個の濃度にします。70% ethanolで腹部を滅菌した後、片手でマウスの項皮と尾を固定し、もう一方の手で針の斜面を上に向け、レシピエントマウスの腹腔内に腫瘍細胞を注入します。

15〜30日後、マウスを安楽死させ、腹部から腫瘍を摘出します。次に、腫瘍を10% formalinで24時間固定します。その後、固定した組織を5〜10 µmの厚さに切片し、以降の染色工程に使用します。

組織切片をパラフィンで固定した後、サンプルを56 °Cで1時間加熱します。その後、以下の順序でスライドを洗浄します。最後の ethanol 洗浄後、スライドを水で2分間すすぎます。染色ラックを水の中にゆっくりと10回浸し、引き上げます。

次に、クエン酸ナトリウム緩衝液を電子レンジに入れ、加熱します。スライドをクエン酸ナトリウム緩衝液中で20分間煮沸した後、サンプルを緩衝液中で30分間冷却させます。その後、イオン水でさらに5分間洗浄します。

その後、スライドを軽く叩いて大きな水滴を落としますが、組織切片を乾燥させないよう注意してください。疎水性バリアペンを使用して腫瘍切片の周囲を囲み、組織切片の乾燥を防ぐため、直ちにサンプルにブロッキングバッファーを滴下します。1時間後、目的の一次抗体とともにスライドを湿潤箱に入れ、低速回転シェーカーを用いて4°Cで一晩インキュベートします。

翌朝、切片を洗浄しながら、PBSTで10分間ずつ2回スライドを洗浄します。二次抗体をブロッキングバッファーで1:1000の比率で希釈します。その後、アルミホイルで覆った湿室内のスロー回転シェーカーを用い、室温で適切な二次抗体とともに切片を2時間インキュベートします。

スライドをPBSTで5分間、穏やかに振盪しながら2回洗浄し、遮光して保護します。次に、dappyのみのスライドおよび解析用スライドをDPIで1分間染色し、インキュベーション中はスライドをカバーしたままにします。各サンプルにカバーガラスを載せ、カバーガラスの縁をネイルハードナーで密封します。

次にマルチスペクトルイメージングを行うために、オイル浸漬対物レンズを用いて解析スライドの初期画像を取得し、スペクトルライブラリ内の各スペクトル範囲における適切な露光時間を決定します。例えば、この表は、実験で使用される蛍光染料の数に基づいた推奨スペクトルライブラリプロトコルの概要を示しています。その後、本実験のスペクトルライブラリにおける背景スライドとして、未染色のスライドをイメージングしてください。

次の画像として、スペクトルライブラリ用の背景画像を得るために、未染色のスライドを撮影します。次に、4枚の染色済みコントロール・シングルフロアースライドをそれぞれ撮影し、各スライドに使用した二次抗体の名前で画像を保存します。スペクトルライブラリが完成したら、腫瘍組織の画像を解析するために、解析用スライド上の関心領域の画像を収集します。

まず、informソフトウェアを使用して、取得したニュアンス画像の代表的なアソートメントをインポートします。次に、プログラムの指示に従って、セーフスペクトルライブラリを開きます。続いて、解析対象となる組織の関心領域を特定します。

DAPI染色に基づき個々の細胞を特定します。細胞質は核の形状に基づいて自動的に特定されます。次に、各蛍光パラメータについて任意の蛍光強度リードアウトを選択し、取得した画像を照合させて、提案されたアルゴリズムを用いてソフトウェアにデータを処理させます。

画像処理が完了したら、得られたファイルを統合します。次に、このマルチスペクトルイメージング技術を用いて、このトランスジェニック骨髄移植マウスモデルにおける腫瘍の解析およびグラフ化を行い、骨髄移植から3週間後にフローサイトメトリーによって骨髄由来の基質腫瘍成分を識別しました。その後、初回注射から6週間後、単色コントロールスライドを用いてスペクトルライブラリを作成し、GFP、DPI、および他2つのマーカーで染色した卵巣腫瘍切片の画像を解析することで、ラベルなしで注射した卵巣腫瘍の切片を解析しました。

さらに多くのマーカーを追加することが可能です。例えばここでは、専用ソフトウェアを使用して、6つのマーカーと核染色を加えた腫瘍切片のスペクトルライブラリおよび付随する画像を示しています。腫瘍切片内の関心のある組織領域は、ここに示す代表的な画像のように分類可能です。

例えば、この画像は組織セグメントの分類と、それに続く細胞のセグメンテーションを示しています。これは核染色dpiに基づいています。その後、各細胞の核および細胞質における蛍光ラベルの定量測定を行い、さらなる解析のためにエクスポートすることが可能です。

組織セグメンテーションアルゴリズムは、蛍光色素の同定だけでなく、組織構造に基づいてさらに組織サブタイプを特定することが可能であり、染色の結果を明確な組織領域に分類するためのより堅牢な分析ツールを提供します。この画像では、組織内の構造パターンに基づいて5つのサブ領域を特定するようにコンピュータをトレーニングしました。背景は空白領域として定義されています。

溶血性腫瘍は、組織内の赤血球の豊富さによって定義されます。腫瘍は、細胞が密集していることで定義されます。脂肪は、対称的な大きな空の細胞区画によって定義され、筋肉は、横紋パターンによって定義されます。

この方法を用いることで、決定された蛍光強度閾値に基づいてダブルポジティブの細胞集団を解析できます。例えば、ここで4色以上の分光検出として示しているGFP陽性かつα-smooth muscle actin陽性の細胞について、5種類以上のプローブをマルチプレックス化する方法については、リンク先のTips and Tricksドキュメントを参照してください。この手順を行う際は、画像の品質が使用するシングルカラーコントロールスライドの適切さに大きく依存することを忘れないでください。

この手順に従った後、細胞内コンパートメントや腫瘍微小環境組織などの追加的な疑問を解消するために、蛍光in situハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、当社のmimic技術および多細胞成分のマルチスペクトル解析について十分に理解でき、完了後には、1枚のスライド上で複数の細胞標的を特定する方法を完全に習得しているはずです。また、それらの細胞標的をどのように計数するか、そして腫瘍ストロマや再生組織、あるいは目的の組織の進展について十分に理解することができます。