細胞の起源、タイプ、および相互作用の可視化のための蛍光組織移植に続いて定量的マルチスペクトル解析

次の手順の目標は、マルチプレックス細胞組成物のマルチスペクトル調査を使用するか、または模倣して、腫瘍間質の発達に対するさまざまな骨髄常在集団の寄与を決定することです。これは、まずトランスジェニックGFP標識レシピエントマウスに骨髄幹細胞を発現するRFPを移植することによって達成されます。第2ステップでは、目的の腫瘍細胞を同じレシピエントに注入し、生着後、切除腫瘍を切片化し、パラフィンに包埋し、免疫蛍光抗体で標識します。

次に、スペクトルライブラリが完成したら、腫瘍切片の画像を取得するために使用されるすべての波長のスペクトルライブラリが作成されます。スライドは最終ステップで画像化され、データ解析が行われ、目的の細胞マーカーの染色パターンの同定と関連付けが可能になります。最終的には、細胞外マーカーと細胞マーカーのマルチプレックス標識に基づいて、新しい細胞実体または表現型を同定し、腫瘍微小環境などの複雑な組織の組成をよりよく理解することができます。

この技術が標準的な免疫蛍光法と比較した場合の主な利点は、マルチスペクトル解析により、同じスライド上に7つ以上のフルオロフォーをマルチプレックス化できるため、腫瘍微小環境または再生組織の細胞組成をより正確かつ詳細に調べることができることです。この方法は、腫瘍微小環境の起源と組成に関する洞察を提供しますが、再生医療、発生生物学、免疫生物学などの他のシステムにも適用できます。Dr.Spaと一緒にこの手順を実演するのは、私の研究室の研究助手であるChris Boothです この機関でのIU Cookの制限により、マウスでの直接のマウス操作については説明しますが、表示しません。

これらの骨髄の処置と私たちの腫瘍生着技術は、私たちの以前の研究で見つけることができます、例えば、子供や他の幹細胞のような幹細胞。 ミラーリング後肢から骨髄細胞を分離した後に開始する2009年、マウスあたりPBSの100マイクロリットルあたり200万細胞で細胞を懸濁します。ヒートランプを使用して、照射を受けたレシピエントGFPマウスの血管を拡張し、マウスを尾静脈注射拘束具に入れます。

29ゲージの針ベベルサイドを上にして、細胞懸濁液を尾部または眼窩後静脈に全身的に注入します。滅菌ガーゼを使用して、注入後にテールに軽い圧力を加えます。注射当日に生着制御としてのみ、1匹のマウスに100マイクロリットルのPBSを注入します。

PBS中の目的の腫瘍細胞を100マイクロリットルあたり100万細胞で懸濁します。腹部を70%エタノールで滅菌した後。片方の手でマウスを首筋と尾で拘束し、もう一方の手で針の斜角側を上にして、レシピエントマウスの腹腔内に腫瘍細胞を注入します。

15〜30日後、マウスを安楽死させ、腹部から腫瘍を切除します。次に、腫瘍を10%ホルミンで24時間固定します。次に、固定組織を5〜10マイクロメートルのスライスに切片にして、その後の染色手順に備えます。

組織切片をパラフィンで固定した後、サンプルを摂氏56度で1時間焼きます。次に、次の順序でスライドを洗浄します最後のエタノール洗浄後、スライドを水で2分間すすぎます。染色ラックをゆっくりと水に沈め、10回水に出し入れします。

次に、クエン酸ナトリウムバッファーを電子レンジに入れて加熱します。スライドをクエン酸ナトリウムバッファーで20分間煮沸した後、サンプルをバッファー内で30分間冷まします。次に、イオン水でさらに5分間洗います。

次に、スライドを軽くたたいて大きな水滴を転がし、ティッシュ部分を乾かさないように注意してください。疎水性バリアペンを使用して腫瘍切片の周囲の切片に印を付け、すぐにサンプルにブロッキングバッファーを塗布して、組織切片の乾燥を防ぎます。1時間後、スライドを目的の一次抗体と含み、4°Cでゆっくりと回転するシェーカーのモイスチャーチャンバーボックスで一晩インキュベートします。

翌朝、スライドをPBSTで2回、毎回10分間、切片を洗浄しながら穏やかに振って洗浄します。二次抗体をブロッキングバッファー比に対して1:1000抗体に希釈します。次に、室温でゆっくりと回転するシェーカーでアルミホイルで覆われたモイスチャーチャンバーボックス内の適切な二次抗体の切片をインキュベー

スライドをPBSTで5分間2回、軽く振って洗い、光から保護します。次に、ダッピーのみのスライドと分析スライドをDPIで1分間染色し、インキュベーション中にスライドを覆ったままにします。各サンプルにカバースリップを置き、各カバースリップの端をネイル硬化剤で密封します。

次に、マルチスペクトルイメージングを実行するには、オイル対物レンズを使用して分析スライドの初期画像を撮影し、スペクトルライブラリ内の各スペクトル範囲の適切な露光時間を取得します。例えば、この表は、実験で使用したフロア4の数に基づいて提案されたスペクトルライブラリプロトコルの概要を示しています。次に、この実験のスペクトルライブラリの背景スライドに染色されていないスライドを画像化します。

次の画像は、スペクトルライブラリの背景画像を実現するための染色されていないスライドです。次に、各コントロールの1階4つの染色スライドを画像化し、各スライドに使用した二次抗体の名前で画像を保存します。Suspectableライブラリが完成したら、解析スライド上の関心領域の画像を収集し、腫瘍組織の画像を解析します。

まず、取得したニュアンス画像の代表的な品揃えをInformソフトウェアを使用してインポートします。次に、プログラムの指示に従って安全なスペクトルライブラリを開きます。次に、解析対象の組織領域を同定します。

DAPI染色に基づいて個々の細胞を同定します。細胞質は、核の形状に基づいて自動的に識別されます。次に、各蛍光パラメータに対して選択した蛍光強度の読み出しを選択し、取得した画像を一致させて、ソフトウェアに提案されたアルゴリズムを使用してデータを処理させます。

画像処理が終了したら、結果のファイルをマージします。次に、このトランスジェニック骨髄移植マウスモデルにおいて、このマルチスペクトルイメージング技術を用いて腫瘍を解析し、グラフ化することで、骨髄移植の3週間後にフローサイトメトリーにより骨髄由来の間質腫瘍成分を同定しました。次に、最初の注射から6週間後、非標識注射された卵巣腫瘍の切片を、単色対照スライドでスペクトルライブラリを作成した後に分析し、GFP DPIおよび他の2つのマーカーで染色した卵巣腫瘍切片の画像を解析した。

マーカーの追加も可能です。例えば、ここでは、6つのマーカーと核染色を有する腫瘍切片のスペクトルライブラリと付随する画像を、情報に基づいたソフトウェアを使用して示しています。腫瘍切片内の関心組織領域は、ここに示す代表的な画像に示すように分類可能です。

たとえば、この画像は、組織セグメントの分類とそれに続く細胞のセグメンテーションを示しています。核染色dpiに基づく。蛍光標識の定量化は、各細胞の核と細胞質で測定し、さらなる分析のためにエクスポートすることができます。

組織セグメンテーションアルゴリズムは、蛍光色素の同定だけでなく、組織構造に基づいて組織のサブタイプをさらに同定することができるため、染色を異なる組織領域に分類するためのより堅牢な分析ツールを提供します。この画像では、組織内の構造パターンに基づいて 5 つのサブ領域を識別するようにコンピューターがトレーニングされています。背景は空白で定義されます。

溶血性腫瘍は、組織内の赤血球の存在量によって定義されます。腫瘍は、人口密度の高い細胞によって定義されます。脂肪は、大きく対称的な空の細胞コンパートメントと、横紋パターンによって定義される筋肉によって定義されます。

この方法を使用すると、決定された蛍光強度閾値に基づいてダブルポジティブ細胞集団を分析できます。例えば、GFP陽性細胞およびα平滑筋アクチン陽性細胞の場合、4色を超える追加のスペクトル検出については、5つ以上のプローブをマルチプレックス化するためのリンク先のヒントとコツのドキュメントを参照してください。この手順を試行する際は、画像の品質が使用される適切な単一カラーコントロールスライドに大きく依存することを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、細胞コンパートメントや腫瘍微小環境組織などの追加の質問に答えるために、蛍光in situハイブリダイゼーションなどの他の方法を実行できます。このビデオを見れば、当社の模倣技術、多細胞成分のマルチスペクトル調査について十分に理解し、これを完了する際には、1枚のスライドで複数の細胞ターゲットを同定する方法を完全に理解できるはずです。これらの細胞ターゲットをUnixで集計し、腫瘍間質や再生組織、または関心のある組織の進化をよく理解する方法。