調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立

本手順の全体的な目的は、ハイスループット・バイオリポーター・スクリーニングを用いて、日和見感染 pathogens である Pseudomonas aeruginosa におけるセカンドメッセンジャー cyclic-di-GMP の細胞内レベルを調節する低分子化合物を同定することです。この手法は、cyclic-di-GMP の調節を介して Pseudomonas aeruginosa のバイオインフォメーションやその他の粒子に干渉する低分子化合物の解明に役立ちます。本技術の主な利点は、非常に堅牢で汎用性が高く、48時間以内に3,500件以上の化合物のスクリーニングが可能である点にあります。

この手法の意義は、細菌への選択圧を低く抑えつつ、Pseudomonas aeruginosaを免疫系や既存の抗菌薬に対して潜在的に感受性にする新しい治療法の開発へと広がります。5 mLのリソジェニーブロス（LB培地）にP.aeruginosaのシングルコロニーを接種し、37 °C、200 rpmの振盪条件下で培養します。その後、 overnight培養液の2 mLを、1 Lフラスコに入れた200 mLの新鮮なLB培地に移し、37 °C、200 rpmの振盪条件下でインキュベートします。

フラスコから1 milliliterのサンプルを採取し、分光光度計を用いて30分ごとに600 nanometersにおける光学的密度（OD 600）を測定します。OD 600が0.3から0.5に達したら、培養液40 milliletersを50 mililiterコニカル遠心チューブに移します。4 degrees Celsiusで10分間、8000 rpmで遠心分離し、細胞をペレット化します。

上清を捨て、氷冷した滅菌済みの300 millimolar ショ糖溶液 40 milliliters で細胞を再懸濁します。細胞を2回目に遠心分離した後、氷冷した滅菌済みの300 millimolar ショ糖溶液 20 milliliters で再懸濁します。再度細胞を遠心分離し、300 millimolar ショ糖溶液 400 microliters で再懸濁します。細胞を氷上で30分間冷却すると、エレクトロポレーションが可能な状態になります。

次に、氷上であらかじめ冷却した1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに入った、調製済みのP.Aeruginosa電気穿孔能細胞40 microlitersに、CdrAプロモーターから緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子までのプラスミド溶液（0.2 microgram per microliter）を1 microliter添加します。懸濁液を混合し、あらかじめ冷却した2 millimeter電極間隔のエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットの外側の水分をティッシュペーパーで拭き取り、キュベットをエレクトロポレーターのサンプルチャンバーにセットします。

電圧2.5 kilovolts、静電容量25 microfarad、抵抗200 ohmsで溶液にパルスを印加します。キュベットを取り出し、LB培地を1 milliliter加えます。その後、細胞を滅菌済みの1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、37 degrees Celsiusで200 rpmの振盪を加えながら2時間インキュベートします。

インキュベーション後、培養液の10 µL、50 µL、および100 µL分注液を、アンピシリンを添加した滅菌済みのLB寒天プレートに塗抹し、プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。標準的なGFPチャネルを備えた蛍光顕微鏡でプレートを観察し、GFPの発現を確認します。単一のコロニーをピックアップし、5 mLのLBに接種します。一晩のインキュベーション後、一晩培養した培養液0.5 mLと50%グリセロール0.5 mLを2 mLスクリューキャップチューブで混合し、-80 °Cで保存します。

スクリーニングの2日前、-80 °C保存ストックから準備したP.aeruginosa株を、滅菌済みの白金耳を用いてプレート全体に緩やかに塗抹し、LB寒天培地に播種します。プレートを37 °Cで一晩培養します。スクリーニング前日の夜、プレート上のP.aeruginosaのシングルコロニーを、チューブに入れた10 mLのLB培地に接種します。

前培養液を37°Cで200 rpmで振盪しながら一晩インキュベートします。スクリーニング当日、一晩インキュベートした前培養液を新鮮なLB培地でOD 600が1.0になるまで希釈し、さらに5% LBでOD 600が0.4になるまで希釈して、サブカルチャーを調製します。容器に滅菌済みのマグネチックスターバーを加え、マグネティックスターラーを用いて室温で30分間、最低速度で撹拌します。

これにより、細菌を384ウェルプレートに分注する前に、培地に順化させることができます。陽性対照を調製するには、調製した継代培養液10 millilitersにTobramycin Sulfateを20 microliters加え、穏やかに混合します。陽性対照培養液を40 microlitersずつ、ウェルA23からP23までピペットで分注します。

陰性対照を調製するには、調製済みの継代培養液 10 milliliters に Dimethyl Sulfoxide 30 microliters を加え、穏やかに混ぜ合わせます。陰性対照培養液 40 microliters をウェル A24 から P24 までピペットで分注します。低分子化合物で処理した各プレートのウェル A1 から P22 までに、希釈した overnight 培養液を 40 microliters ずつ接種します。

プレートを空気透過性カバーシールで密閉し、37 °Cで6時間インキュベートします。結露を防ぐため、分光光度計による測定の約30分前に、プレートリーダーを37 °Cに予熱しておきます。測定前に、プレートから空気透過性カバーシールを慎重に取り除きます。

次に、1ウェルあたり10回のフラッシュ、セトリングタイム0.2秒の設定で、波長600ナノメートルにおける吸光度を測定します。蛍光測定の前に、陰性対照であるウェルA24に基づいて自動ゲインおよびフォーカス調整を行い、ゲイン目標値を75%に設定します。ウィンドウの右側でフォーカス調整とチャンネルAを選択します。励起極大波長485ナノメートル、蛍光極大波長520ナノメートルで、1ウェルあたり10回のフラッシュ、セトリングタイム0.2秒の設定にてGFPレポーターの蛍光を測定します。

解析したすべてのプレートからデータを収集します。データ読み取り値は、プレートリーダーの制御ソフトウェアによってデフォルトで自動的に保存されます。データを解析するには、制御ソフトウェア内のMarsアイコンをクリックして統計解析パッケージを開き、読み取り値を確認してください。

解析したいプレート番号をダブルクリックしてデータを取得します。堅牢なZ-prime解析を用いて、アッセイの均一性と再現性を評価します。その後、テキストプロトコルに詳述されている通り、増殖抑制率を算出し、細胞内c-di-GMPレベルの抑制率を評価します。

この図は、ハイスループットスクリーニングにおけるOD 600およびGFPの代表的な生データを示しています。ウェルの値には、低値から高値に向けて暖色から寒色へと変化するカラーグラジエントヒートマップが適用されています。生成されたデータから阻害率が解析され、ここではOD 600とGFPの両方の読み取り値について示しています。

増殖および細胞内c-di-GMPを抑制する可能性のある低分子化合物は概ね緑色で、増殖および細胞内c-di-GMPレベルを促進する可能性のある低分子化合物は概ね赤色で表示されます。各テスト済み低分子化合物から得られた抑制率を比較するために、散布図が用いられています。各低分子化合物は小さな点で表され、OD 600およびGFPのそれぞれの読み取り値に対する抑制率の分布が示されています。

ヒットの特定には、±50%のカットオフ値を選択します。潜在的なヒットは赤色でハイライトされます。関心のある各化合物に対して、用量反応アッセイを実施します。

ここでは、特定された2つの化合物を、最高濃度2 mMおよび2倍希釈系列による10点用量反応アッセイで試験します。データに4パラメータロジスティック関数を適合させた結果、各化合物の半最大阻害濃度（IC₅₀）は158 µMおよび193 µMとなりました。この手法を習得すれば、48時間以内に3,500以上の化合物をスクリーニングすることが可能です。

このビデオを視聴することで、cyclic-di-GMPシグナリングを妨害する化合物を検出すべく、Pseudomonas aeruginosaをロバストにスクリーニングする方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、数日間にわたってスクリーニングを行う場合に、スクリーニング条件を同等に保つことが重要である点に注意してください。シングルポイントスクリーニングに続き、同じプロトコルを用いて用量反応スクリーニングを行うことで、ヒット化合物を検証することができます。

この手法は、Pseudomonas aeruginosaのバイオフィルム形成および抗生物質耐性を阻害する潜在的な低分子化合物を研究者が特定するための道を切り開くものです。重要な点として、この手法は任意の標的細菌に適応させることができ、細菌の生存能への影響など、他の出力や入力項目を調べるために修正することも可能です。最後に、Pseudomonas aeruginosaを取り扱う際は危険が伴う可能性があることに留意してください。

また、本手順を実施する際は、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じてください。