調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立緑膿菌

この手順の全体的な目標は、日和見病原体である緑膿菌のセカンドメッセンジャーcyclic-di-GMPの細胞内レベルを調節する小分子を、ハイスループットバイオレポータースクリーニングによって特定することです。この手法は、Pseudomonas aeruginosaの生体情報やその他の粒子を妨害する小分子を、サイクリックジGMP変調によって明らかにするのに役立ちます。この技術の主な利点は、非常に堅牢で汎用性が高く、48時間以内に3, 500以上の化合物をスクリーニングできることです。

この技術の意味するところは、緑膿菌、免疫系、または既存の抗生物質に感作される可能性のある新しい治療法の開発にまで及び、細菌に対する選択的圧力を少なくします。5ミリリットルのリソジェニーブロス、またはLB培地に、P.aeruginosaの単一のコロニー、摂氏7度、200rpmで振とうします。次に、一晩培養した2ミリリットルを1リットルのフラスコで200ミリリットルの新鮮なLB培地に移し、200rpmで振とうしながら摂氏37度でインキュベートします。

フラスコから1ミリリットルのサンプルを採取し、分光光度計を使用して調べることにより、30分ごとに600ナノメートルまたはOD600の光学密度を監視します。OD 600が0.3から0.5の間に達したら、培養物の40ミリリットルを50ミリリットルの円錐形遠心分離管に入れます。細胞を8000rpmで4°Cで10分間遠心分離してペレット

上清を捨て、細胞を40ミリリットルの氷冷滅菌300ミリモルスクロース溶液に再懸濁します。細胞を2回目に遠心分離した後、氷冷した滅菌300ミリモルスクロース溶液20ミリリットルに再懸濁し、細胞を再度遠心分離し、300ミリモルスクロース溶液の400マイクロリットルに再懸濁する。細胞を氷上で30分間冷却した後、エレクトロポレーションの準備が整います。

次に、CdrAプロモーターをコードするプラスミドの溶液1マイクロリットルあたり0.2マイクログラムを緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に、調製したP.Aeruginosaエレクトロコンピテントセル40マイクロリットルを、氷上で予め冷却した1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに添加する。懸濁液を混合し、予め冷却した2mm電極ギャップエレクトロポレーションキュベットに移します。ティッシュペーパーでキュベットの外側の水分を取り除き、キュベットをエレクトロポレーターのサンプルチャンバーに入れます。

2.5キロボルトの電圧、25マイクロファラッドの静電容量、200オームの抵抗で溶液をパルスします。キュベットを取り外し、1ミリリットルのLBミディアムを追加します。次に、細胞を滅菌済みの1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移し、200rpmで振とうしながら摂氏37度で2時間インキュベー

インキュベーション後、アンピシリンを添加した滅菌LB寒天プレートに培養物の10マイクロリットル、50マイクロリットル、および100マイクロリットルのアリコートを広げ、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。GFPの発現を確認するには、標準的なGFPチャンネルを備えた蛍光顕微鏡でプレートを検査します。単一のコロニーを選び、5ミリリットルのLBを接種します。一晩インキュベートした後、0.5ミリリットルの一晩培養物と0.5ミリリットルの50%グリセロールを2ミリリットルのスクリュートップチューブに混合し、摂氏マイナス80度で保存します。

スクリーニングの2日前に、作製した緑膿菌株をマイナス80°CのストックからLB寒天培地にプレート化し、滅菌接種ループを使用してプレート上に細菌を穏やかに広げます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。スクリーニングの前夜、プレートから緑膿菌の単一のコロニーをチューブ内の10ミリリットルのLB培地に接種します。

プレカルチャーを37°Cで一晩インキュベートし、200rpmで振とうします。スクリーニングの日に、最初に新鮮なLB培地で1.0のOD600に希釈し、次にさらに5%LBで04のOD600に希釈することにより、一晩の予備培養から継代培養を準備します。滅菌マグネチックスターバーを容器に加え、マグネチックスターラーで培養物を室温で30分間最小速度で撹拌します。

これにより、細菌は384ウェルプレートに分注される前に培地に順応することができます。ポジティブコントロールを調製するには、調製した継代培養物10ミリリットルに20マイクロリットルの硫酸トブラマイシンを加え、穏やかに混合します。ポジティブコントロール培養物の40マイクロリットルを井戸A23からP23にピペットで移します。

ネガティブコントロールを調製するには、調製した継代培養物10ミリリットルに30マイクロリットルのジメチルスルホキシドを加え、穏やかに混合します。ネガティブコントロール培養物の40マイクロリットルを井戸A24からP24にピペットで移します。低分子で湿らせた各プレートについて、希釈した一晩培養物の40マイクロリットルの量をウェルA1〜P22に接種します。

プレートを通気性のあるカバーシールで密封し、摂氏37度で6時間インキュベートします。分光光度測定の約30分前に、プレートリーダーを摂氏37度に予熱して、結露を防ぎます。読む前に、プレートから通気性のあるカバーシールをそっと取り外してください。

次に、ウェルあたり10回のフラッシュと0.2秒のセトリング時間を設定して、600ナノメートルの波長で光学密度を測定します。蛍光を測定する前に、ネガティブコントロールウェルA24に基づいてゲインとフォーカルの自動調整を行い、ゲイン目標値を75%に設定します。GFPレポーターからの蛍光を、最大励起485ナノメートル、最大520ナノメートルで、ウェルあたり10回のフラッシュと0.2秒のセトリング時間で測定します。

調査したすべてのプレートからデータを収集します。データの読み取り値は、プレートリーダー制御ソフトウェアによってデフォルトとして自動的に保存されます。データを分析するには、制御ソフトウェア内の火星アイコンをクリックして統計分析パッケージを開き、読み取り値を表示します。

データを取得するには、対象のプレート番号をダブルクリックして分析用のデータにアクセスします。頑健なZプライム分析を使用して、アッセイの均一性と再現性を評価します。次に、成長の阻害率を計算し、テキストプロトコルに詳述されているように、c-di-GMPの細胞内レベルの阻害率を評価します。

この図は、ハイスループットスクリーニングからのOD 600およびGFPの代表的な生データを示しています。ホット カラーからクール カラーへのカラー グラデーション ヒート マップが、低い値から高い値への値を示しています。生成されたデータは、阻害率について分析され、ここではOD 600とGFPの両方の読み出しについて示されています。

成長と細胞内c-di-GMPを阻害する可能性のある小分子は緑色になる傾向があり、成長と細胞内c-di-GMPレベルを促進する可能性のある低分子は赤色になる傾向があります。散布図は、試験した各小分子から得られる阻害率を比較するために使用されます。各小分子は小さなドットで表され、OD 600およびGFPの各読み出しの阻害率分布が示されています。

プラスまたはマイナスの 50% カットオフがヒットの識別に選択されます。ヒットする可能性のあるものは赤で強調表示されます。用量反応アッセイは、各興味深い化合物に対して実施されます。

ここでは、同定された2つの化合物を、最高濃度2ミリモルと2倍希釈シリーズの10ポイント用量反応アッセイで試験します。データに4パラメータのロジスティック関数を当てはめると、158マイクロモルと193マイクロモルの各化合物の半値阻害濃度が得られました。習得すると、この手法を使用して、48時間以内に3, 500以上の化合物をスクリーニングできます。

このビデオを見れば、Pseudomonas aeruginosaのCyclic-di-GMPシグナル伝達を阻害する化合物を堅牢にスクリーニングする方法を十分に理解できるはずです。この手順を試行する際は、数日間にわたってスクリーニングを行う際に、スクリーニング条件を同等に保つことを覚えておくことが重要です。同じプロトコルを使用して dirsk 応答画面を実行するシングルポイント画面をたどると、ヒットを検証できます。

この技術は、研究者が緑膿菌の二重情報と抗生物質耐性を妨害する可能性のある小分子を特定する道を開きます。重要なことに、この手法は、関心のある任意の細菌に使用できるように適応でき、細菌の生存率への影響などの他の出力や入力を調べるために変更できるということです。最後に、緑膿菌との作業は危険な場合があることを忘れないでください。

また、この手順を実行するときは、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じる必要があります。