Name: 調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立緑膿菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶc-di-GMPシグナリングを調節する小分子のハイスループットスクリーニング法。緑膿菌Pseudomonas aeruginosaを用いたバイオリポーターアッセイで、48時間で3,500化合物を検証可能な抗菌薬開発ツールです。

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私たちは、スクリーンの開発に使用されたレポーターコンストラクトの寛大な寄付に対して、Tolker-Nielsenラボに感謝します。また、ライアン研究室のメンバーには、有益なコメントや原稿の批判的な読み方に感謝します。著者らの研究は、ウェルカム・トラストが授与した助成金(R.P.R.へのシニアフェローシップ助成金WT100204AIA、K.N.R.への093714/Z/10/Z PhD奨学金)によって部分的に支えられています。

注：精製したc-ジ-GMPレポータープラスミドのクローニングおよび形質転換のための手順は、他の場所で12議論されています。 GFPタグ付きのc-ジ-GMPレポーターPの1世代緑膿菌のひずみ<ol><li> P.の単一コロニーをLB培地（LB）培地5mlに接種200 rpmで振盪しながら37℃で一晩を緑膿菌とインキュベートします。 </li><li>移送2 1 Lフラスコ中の新鮮なLB培地200mlに一晩培養物1ml及び200rpmで振盪しながら37℃でインキュベートします。 </li><li>フラスコから1ミリリットルのサンプルを取ることによって、30分ごとに（OD 600）600nmでの光学密度を監視し、（以前に12のように）分光光度計を用いて調べます。 </li><li> OD 600が 0.3の間に達すると- 0.5、50ミリリットルコニカル遠心チューブに培養液の40ミリリットルを配置します。 </li><li> 4℃で10分間、8,000rpmで遠心分離して細胞をペレット、上清およびRを捨てます氷のように冷たい、滅菌、300mMのスクロース溶液40ml中で細胞を電子サスペンド。 </li><li>ステップ1.5で説明し、氷冷滅菌、300mMのスクロース溶液20mlに再懸濁として遠心分離して細胞をもう一度ペレット。 </li><li>ステップ1.5で説明し、氷冷滅菌、300mMのスクロース溶液400μlの再懸濁として遠心分離して細胞を最終的な時間をペレット化。 注：この時点で細胞密度がミリリットル当たり約1×10 11コロニー形成単位（CFU / ml）であるべきです。 </li><li>彼らはエレクトロポレーションのために準備ができているた後、氷上で30分間細胞を冷やします。 </li><li> Pの40μlに0.2μgの/μlのpCdrA :: GFPの Cプラスミド 12溶液1μLを追加緑膿菌のエレクトロコンピテント細胞を氷上で予備冷却されている1.5ミリリットルマイクロチューブに上記で調製しました。サスペンションを混合し、予め冷却し、2mmの電極間隔、エレクトロポレーションキュベットに移します。 注：pCdrA :: GFP </em&gt; C：pUCP22Not-P CDRA -RBSII- GFP（MUT3）-T 0 -T 1に 、アンプはP.にc-ジ-GMPの細胞内レベルの蛍光読み出しを与えるのGm rを 、rは 緑膿菌の菌株は、Rybtke らによって開発され、検証された。12。 </li><li>ティッシュペーパーでキュベットの外側に水分を除去し、エレクトロポの試料室にキュベットを配置します。 2.5 kVで、25μFの容量と200Ωの抵抗の電圧にパルス。 </li><li>キュベットを削除し、LB培地1mlを加えます。その後、滅菌1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに細胞を移し、200rpmで振盪しながら37℃で2時間インキュベートします。 </li><li> 10μL、50μL及び（100μg/ mlの濃度で）、アンピシリンを補足した滅菌LB寒天プレート上に培養物100μlアリコートを広げ、37℃で一晩プレートをインキュベート。 </li><li> （excitatiをGFPの発現を確認485 nmで、520 nmでの発光）で、標準的なGFPチャネルで蛍光顕微鏡下でプレートを調べることによって、上と5ミリリットルのLBを接種するために、単一のコロニーを選びますステップ1.1で説明したように一晩インキュベートします。 -80℃でトップチューブとストアをネジ2ミリリットルで0.5ミリリットル50％グリセロールで一晩培養液0.5ミリリットルを混ぜます。 </li></ol>接種のためのスターター文化の調製<ol><li>二日画面の前に、Pをプレート緑膿菌株から（pCdrA :: GFP Cプラスミドを含む）-80 LB寒天プレート上にCの株式°優しく滅菌接種を用いてプレート上に細菌を広げることによって（100μg/ mlの濃度でアンピシリンを添加）ループ。 37℃で一晩プレートをインキュベートします。 </li><li>スクリーニングの前に夕方、Pの単一コロニーを接種TUで（100μg/ mlの濃度のアンピシリンを補充した）10 mlのLB培地中にプレートから緑膿菌であることと、200rpmで振盪しながら37℃で前培養一晩インキュベートします。 </li><li>画面の日に、OD 1.0の600に新鮮なLB培地で最初に希釈した後、さらに0.04のOD 600（午前1時25分比）に5％LBで希釈して一晩前培養から継代培養を準備。 注：接種培地の総体積は、試験されるプレートの数に依存します。 5％LBを必要な濃度にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いて100％LBを希釈することによって行われます。重要なのは、メディア（5％LB）はpCdrAの構成的活性化を可能にする:: P.におけるGFP のC 緑膿菌 。 </li><li>それらは、384ウェルプレートに分配する前に細菌を培地に順応できるように、室温で30分間マグネティックスターラーで最小の速度で培養物を容器内に無菌磁気撹拌棒を加え、撹拌します。 </li></ol>含む384ウェルプレートの3接種とインキュベーション小分子注：無菌性と良好な無菌技術は、次のステップに最も重要です。 <ol><li>陽性対照（100％阻害）を調製するには、ステップ2.3で調製したサブカルチャーの10ミリリットル（最大12枚のプレートに十分な）に20μlの硫酸トブラマイシン（25ミリグラム/ ml）を加え、穏やかに混合します。ピペットでウェルにポジティブコントロール培養物の40μlのA23 - P23（ 図2）。 </li><li>陰性対照（0％阻害）を調製するために、ステップ2.3で調製した継代培養10mlの（最大12プレートのために十分な）に30μlのジメチルスルホキシド（DMSO）を添加し、穏やかに混合します。ピペットでウェルに負の対照培養40μlのA24 - P24（ 図2）。 </li><li> P22（ 図2） -小分子を刻印プレートの各々について、ウェルA1に（ステップ2.3で説明）で希釈し、一晩培養液の40μlの量を接種します。 注：これは、液体ハンドラ奪うを用いて達成することができますオト。細菌培養物の不均一な特性には、分配しながら常に媒体に分散細菌を維持するために連続的で穏やかな攪拌を維持することが重要です。これを行うには、磁気分配中のステップ2.4​​からの馴化培地を攪拌し続けます。 </li><li>通気性カバーシールでプレートを密封し、37℃で6時間インキュベートします。 注意：通気性シールは384ウェル全て渡って不変条件を維持するために、プレート全体に酸素勾配の潜在的な開発を回避することが重要です。 </li></ol> 4.成長の測定（OD 600）および細胞内c-ジ-GMPレベル（GFP） <ol><li>分光光度測定の前に約30分、凝縮を避けるために37℃にプレートリーダーを予め温めます。 </li><li>ゆっくり読む前に空気透過性のカバーシールを取り外します。ウェル当たり10フラッシュの設定で波長600nmでの光学密度を測定し、0.2秒のセトリング時間。 </li><li>蛍光を測定する前に基づいて自動利得及び焦点調整を行うだけでなくA24（負の対照）および75％（ 図2）におけるゲイン目標値を設定します。 <ol><li>プレートリーダ制御ソフトウェアから、測定開始をクリックして、 &#39;&#39;フォーカスと利得調整/プレートのID &#39;&#39;タブをクリックします。 </li><li>ウィンドウの右側にある &#39;&#39;ピント調整 &#39;&#39;と &#39;&#39;チャネルA &#39;&#39;を選択します。 </li><li> &#39;&#39; &#39;ゲイン調整&#39; &#39;と&#39; &#39;よく選択&#39; &#39;を選択して、&#39; &#39;目標値」として&#39; &#39;75&#39; &#39;を入力します。最後に、 &#39;&#39;調整を開始します &#39;&#39;をクリックする前に、プレートレイアウトでよくA24を選択します。調整が行われると、 &#39;&#39; &#39;測定を開始」をクリックします。 </li><li>ウェル当たり10フラッシュの設定で520分の485 nmでの励起/発光極大とsettliでGFPレポーターからの蛍光を測定します0.2秒のngの時間。 </li></ol></li><li>調べた全てのプレートからのデータを収集します。注意：データの読み取りは、自動的にプレートリーダ制御ソフトウェアにより、デフォルトとして保存されます。 <ol><li>統計解析パッケージを開くには、制御ソフトウェア内の「火星」アイコンをクリックして表示朗読。 </li><li>分析用のデータにアクセスするには、関心のナンバープレートの「ダブルクリック」して、データを取得します。 </li></ol></li></ol> 5.データ解析<ol><li>ハイスループットスクリーニングのために報告された最も一般的な品質メトリクスである堅牢なZ &#39;分析を用いて、アッセイの均一性と再現性を評価します。堅牢なZ &#39;の式を使用して計算します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq1.jpg" /> MAD（中央絶対偏差）はOD 600とGFP V両方の標準偏差、pは正の対照（100％阻害）であり、nは、陰性対照（0％阻害）の推定値でありますalues​​。注：0.5以上（OD 600とGFP生データの両方について計算）堅牢なZ &#39;値を用いたアッセイは、優れた分析として考えられています。 </li><li>式を用いて増殖の阻害％を計算します。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq2.jpg" /> どこXiのOD600は、各サンプルウェルの反復OD 600の値です。 ％阻害OD600&gt; 0、成長阻害剤; ％阻害OD600 &lt;0、成長促進剤。 </li><li>式（任意の蛍光強度単位の変化は、細胞密度の変化を補正している）を用いてc-ジGMPの細胞内レベルの％阻害を評価します。 <img alt="式3" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq3.jpg" /><img alt="式4" src="/files/ftp_upload/54115/54115eq4.jpg" /> XiのGFPは、各サンプルウェルの反復GFP値です。 ％阻害GFP&gt; 0、c-ジGMP阻害剤; ％＆＃160;阻害GFP &lt;0、c-ジ-GMPプロモーター。 </li><li>データポイントの正規分布を仮定し、各プレートのサンプルよく読んでアウトから算出された中央（中央値±3 MAD）から3 MAD、でヒット検出のためのしきい値を設定します。注：必要な場合は、±50％阻害のカットオフは、より再現性及び正確な用量反応アッセイのために選択することができます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細菌感染症の治療を向上させるためには、分子の調節レベルでの細菌の挙動のより良い理解が必要であることは明らかです。ここで説明する手順は、操作したり、細菌におけるc-ジ-GMPの細胞濃度を妨害する可能性を持つ小分子を明らかにしたい微生物学者、生化学者および臨床医のために有益になります。この方法は、Pにおけるc-ジ-GMPの細胞レベルをモニターするために最近開発されたGFPのbioreporterを利用します緑膿菌 12。このbioreporterは、PBS中5％LBで培養用いられる株の増殖に影響を及ぼさないように検証され、重要なことが示されています。 インビボでの c-ジGMPレベルを変化させる小分子を同定するための全細胞スクリーンの使用は、特にグラム陰性菌のものを介して、細菌の膜を介して分子の浸透の観点から標的創薬の主要な困難を克服します。重要なのは、トン一貫して0.5以上の堅牢なZ &#39;値を日付にすべての画面で観察されたように、彼アッセイは、非常に堅牢表示されます。阻害および/ ​​またはP.細胞内c-ジGMPレベルを促進する小分子の数を明らかにし、このプロトコルを使用してスクリーニング緑膿菌 。さらに、このアッセイはまた、殺菌またはOD 600読み出しが低下静菌性化合物を同定する可能性を有します。 プロトコルのセクションで説明されていないが、実験の準備のためのいくつかの重要な考慮事項があります。 GFP bioreporterがプラスミドに基づいていることを念頭に置くことが不可欠です。レポータープラスミドをP.で非常に安定であることが知られているが緑膿菌は 、それを-80℃のグリセロールストックから新鮮にメッキ菌株を使用するには、したがって必要性、連続再メッキ後に失われ、蛍光発現を確認することが重要であることができます。画面全体に均一に成長条件を維持するためにも非常に有用ですこれらの条件のいずれかの変動は、画面上のノックに影響を与える可能性があるため。これは、メディアや抗生物質がバッチであらかじめ作られ、画面の過程で使用されていることを特定すること含むことになります。細菌培養物は、均一なやり方で（OD 600読み取りアウトに基づいて）成長していないこの自然の中で最も高スループットスクリーニングのための共通の問題です。これは、エフェクトやプレートに不均質な細菌培養物を分配し、エッジに起因することができます。前者については、インキュベーションの間に使用されるガス透過性シールが不可欠であることを確認すること。後者のために、培養物の容量を持つ液体ハンドラーチューブをプライミングしながら少なくとも3回は、チューブ自体のデッドボリュームが推奨されます。分配中、最小の速度で磁気撹拌機を保つことが重要です。実験の過程にわたって一貫した成長のために監視し、384ウェルプレートのストレージが最も重要ですが、それは国連の原因となりますので、回避する状況がインキュベーション中、プレートの積み重ねであり、成長パターンにおけるスキューにつながる酸素勾配を望んでいました。陰性対照として使用したDMSOビヒクルは、負に関心の株の成長に影響を与えていないことを保証することも重要です。成長に関連したこれらの問題の多くは、スクリーニング前に関心の細菌株でモックスクリーニングを行うことによって回避することができます。 c-ジGMP阻害結果は、細胞密度の変化について補正されなければならない任意の蛍光強度単位で変更することによって計算されることを考えると、データ解釈メリットを考慮。これを念頭に置いて、これらの実験から出力されたデータを評価するための別の数式も考慮すべきです。例えば、化合物は、c-ジ-GMPの阻害剤として現れる可能性がありますが、実際に同定されたヒットの慎重な解釈を必要とする、成長阻害剤またはその逆です。 このの開発と性能の間に考慮しなければならないいくつかの欠点と制限があります。ハイスループット細胞ベースの画面。例えば、検出特性を潜在的に画面に使用される小分子の影響を受ける可能性がある蛍光プローブを用いた携帯c-ジ-GMPレベルの間接的な測定にバイオレポーター機能。接線方向の問題は、細胞ベースのアッセイは、細胞内のc-ジ-GMPのレベルの変化の背後にあるメカニズムについて何の情報も与えないという事実です。したがって、実験の重要な観察は、細菌細胞内のc-ジGMPの変動を測定するための「ゴールドスタンダード」法と考えられている高速液体クロマトグラフィー - 質量分析法を用いて確認されなければなりません。細菌細胞は、（ インビボ ）宿主との関連で成長させたようにまた、我々の手順は、 インビトロで増殖した細菌の挙動に関する情報を提供することができます すぐにこのような環境のために彼らの活動を変更します。さらに、GFPのbioreporterを使用するプロセスは、画面がかからないことを意味しますアカウントへの細菌細胞の生理学的状態。しかし、プロトコルは、画面の過程で個々のウェルの顕微鏡モニタリングに適合させることができます。 でも、これらの考慮事項および制限付きで、このハイスループットアッセイは、まだ細胞内のc-ジ-GMPレベルを妨害することができる小分子のための堅牢な画面です。多くの細菌性病原体を含む多くの微生物種が細胞内c-ジGMPレベルの調節を特徴づけるために研究されているので、我々のプロトコルは、多様な細菌種に適用され、より複雑な複数種の細菌モデルの研究に拡張することができます。アッセイは、容易に使用される成長条件を変えることにより、他の細菌種のために最適化することができ、または異なるbioreportersを使用して、他の出力を読み取るように適合させることができます。種々のインキュベーション時間は、対象の成長段階に応じて適用することができます。スケールアップまたはスループットが増加したときしかし、それはimportanです<html>細菌はまだプレート調製物および読み出し測定中に成長されることを心に留めておくべきトン。そのためには、このプロトコルを使用して、一度に15のプレートの最大値を選別することをお勧めします。また、以上の384ウェルを有するプレートを使用すると、更なる最適化を必要とする、均一な成長を許可しない場合があります。プレートの数を縮小する場合は、手動で、電子ピペットの代わりに液体処​​理ロボットを用いて接種することがより適切であり得ます。このプロトコルは、抗バイオフィルム化合物は、c-ジGMPシグナル伝達を妨害することを考えると、バイオフィルムを分散させる小分子を調査するために使用され得ることは明らかです。プロトコルはまた、細菌の生理機能の様々な側面を理解するために再開発することができます。 c-ジ-GMPシグナリングは、ほとんどの細菌において優勢であることを考えると、このプロトコルを使用して、これらの生物の生理機能を研究することによって、我々は彼らの作業機構がc-ジ-GMPシグナリングを必要とするかどうかを判断するために、異なる化学的刺激を識別することができます。 _contentは &quot;&gt;要約すると、このプロトコルで提示されたアプローチの堅牢性と汎用性は、多くの生物学的システムにおけるシグナリングc-ジ-GMPの化学的モジュレーターの同定を支援します。

臨床的に重要な抗生物質に対する耐性菌の急速な発展は、現在、世界的な健康の専門家が直面している主要な関心事の一つです。伝統的な抗生物質のこの失敗は、毒性および疾患の進行1に関与する細菌のプロセスを妨害することができ、化学的問題のための新しい検索を牽引してきました。細胞内のセカンドメッセンジャーサイクリックジGMP（c-ジ-GMP）は最近、妥当性2-4を有望との標的となっている利用したものなど規制システム。この世界的なセカンドメッセンジャーシグナル分子は、抗生物質耐性、密着性、バイオフィルム形成や疾病2-4など、多くの機能を調節することが確立されています。 現在では、細菌細胞におけるc-ジGMPの細胞レベルは、GTPの2つの分子がGGDEFドメイン含有ジグアニルシクラーゼ（DGCs）WHによってc-ジGMPを合成するために使用される合成と分解することによって制御されていることがわかりますereas c-ジ-GMPの分解は、EALまたは（（3、5）で検討）HD-GYPドメインのいずれかを持っているホスホジエステラーゼ（PDE類）によって触媒されます。これらのドメインを含むタンパク質は、多くの場合、c-ジ-GMPの売上高の彼らの活動は、環境や携帯手がかり3,5によって直接的または間接的に調節されていることを示唆し、他のシグナル伝達ドメインを含みます。その結果、c-ジ-GMPは細菌の表現型の修正に多様​​な環境手がかりのセンシングをリンクする機能をシグナリング。 c-ジ-GMPは、様々な機構4による転写、転写後および翻訳後のレベルで細菌にその調節効果を発揮します。 多くの細菌細胞中のc-ジ-GMPの主な影響はバイオフィルムの多細胞構造で表面に付着または組織化運動性浮遊細胞と固着性細胞との間の遷移の制御で、特に細菌の「ライフスタイル」との決意であります3,5。一般に、高い細胞低細胞レベルでは、多くの細菌性病原体3,5での運動性および毒性因子の合成を促進しながら、c-ジ-GMPのレベルは、バイオフィルム形成と無柄に関連付けられています。したがって、c-ジ-GMPシグナル伝達の仕組みのより詳細な知識は、細菌性病原体でのバイオフィルム形成と病原性を阻害するための戦略を買う余裕ができました。これは、ほとんどの細菌ゲノムがGGDEF、EALおよび/ ​​またはHD-GYPドメイン（例えば緑膿菌が 40を超えるタンパク質を持っている）と、複数のエフェクタ6,7を有する多数のタンパク質をコードすることを考えると大変な作業です。 しかし、この複雑で、最近の証拠は、戦略はc-ジ-GMPシグナル伝達を操作することを示唆している開発抗生物質耐性感染症を予防または古典的な抗生物質2の同時投与により免疫システムや効率的な治療にそれらを受けやすくいずれかに開発することができます。これに伴い、それは実験その人工的な減少を実証されていますインビトロ -grown P.細胞内c-ジ-GMPのP.ながら緑膿菌は 、バイオフィルム形成を減少し、抗菌剤に対する感受性の増加につながりますマウスの腹腔内に配置シリコーンインプラントの緑膿菌 -developedバイオフィルムは、同様8-11に分散させることができます。 ここでは、潜在的にP.セルラc-ジGMPレベルを調節することができる小分子をスクリーニングするためのハイスループット蛍光に基づくレポーターアッセイを記載します緑膿菌 （ 図1）。アッセイは、その発現が転写c-ジGMP応答性CDRAプロモーター 12に連結されている以前に開発されたGFPレポーターを使用して、c-ジ-GMPの細胞レベルを測定することに基づいています。このプロトコルは、Pにおけるレポーター構築物の発現のための方法論を説明し関心の緑膿菌の菌株は、我々のような化合物プレート調製、384ウェルプレートに培養物の接種、増殖条件、データの収集、管理、および分析に関する詳細などLL（ 図1）。全体的に、このプロトコルは、細菌におけるシグナル伝達c-ジ-GMPをターゲットに新規化合物を同定する潜在的に研究者を支援し、研究に使用するためにPの生物学を理解することを目指します緑膿菌 。

<table><tbody><tr><td>リソジェニーブロス(レノックス)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S0389-1KG</td><td></td></tr><tr><td>寒天(レノックス)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A0166-25G</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水、pH 7.4</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10010-056</td><td></td></tr><tr><td>硫酸トブラマイシン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T1783-100MG</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>276855-250ML</td><td></td></tr><tr><td>ジェネシス 10S UV-Vis 分光光度計</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>840-208100</td><td></td></tr><tr><td>2 mm ギャップ エレクトロポレーター キュベット</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1652092</td><td></td></tr><tr><td>BioRad GenePulser XCell エレクトロポレーター</td><td>Bio-Rad</td><td>1652662</td><td></td></tr><tr><td>Leica Fluorescent Stereomicroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>BRAND 磁気攪拌バー、PTFE、円筒形、ピボットリング付き (使用前にオートクレーブ滅菌)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>Z328952-10EA</td><td></td></tr><tr><td>384-well, white-walled, clear-bottom plates</td><td>Greiner</td><td>781098</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi試薬ディスペンサー</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combiチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073290</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO II 16チャンネル電動ピペット</td><td>Integra Biosciences</td><td>4642</td><td></td></tr><tr><td>100 ml 滅菌使い捨て試薬リザーバー</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>12399175</td><td></td></tr><tr><td>AeraSeal 通気性メンブレン</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>MKBQ1886</tr><tr><td>Pherastarプレートリーダー(ソフトウェアバージョン:4.00 R4、ファームウェアバージョン:1.13)</td><td>BMG Labtech</td><td>Pherastar FS</td><td></td></tr></tbody></table>

調節するc-ジ-gmpシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

従来の抗生物質に対する耐性菌は、最近発見さ調節経路に新たな薬物標的を同定するための研究の試みを推進してきました。セカンドメッセンジャーとして細胞内サイクリックジGMP（c-ジGMP）を利用規制システムは、ターゲットの1ようなクラスです。 c-ジ-GMPは、抗生物質耐性、バイオフィルム形成と病原性を含む、プロセスの広範な範囲を規制するように作用するほぼすべての細菌で見つかったシグナル伝達分子です。 c-ジ-GMPが抗生物質耐性バイオフィルムの開発のコントロールの側面をシグナリングする方法を理解することは、ヌクレオチドまたはこれらのシグナル伝達経路の破壊の細胞濃度の変化が減少し、バイオフィルム形成や抗生物質に対するバイオフィルムの感受性の増大につながるおそれがアプローチを示唆しています。我々は、その発現がc-ジGMP応答性プロモーターCDRAの制御下にある緑色蛍光タンパク質（GFP）、に基づいて、単純なハイスループットbioreporterプロトコルを記述する、急速に緑膿菌 （ 緑膿菌 ）におけるc-ジ-GMPの細胞レベルを調節する可能性を有する小分子をスクリーニングします。この単純なプロトコルは、48時間以内に上方3,500化合物のスクリーニング及び複数の微生物に適応する能力を有することができます。

ここで説明するアプローチは、効率的かつ成功裏に48時間以内に3,500化合物の平均をスクリーニングするために、単一の研究を可能にします。ハイスループットスクリーニングプロトコルの概要を図1のフローチャートとして示されている。現在の記事のために、我々は600μMの最終濃度での潜在的なc-ジGMP調節化合物のためのルールの-5準拠の化合物ライブラリーをスクリーニング。しかし、このアッセイで使用することができる化合物のセットのような、多くの市販の薬物のような非薬物があります。これらのセットは、細菌に焦点を当てた化合物またはランダムプールされた化合物であることができるが、各ライブラリは、このような極性官能基と複数の立体中心を持っていたここでスクリーニングセットとして割り当てられた物理化学的性質や特性を前提としているだろう。このプロトコルでは、細菌は、化合物とともにプレート、抗生物質陽性コントロールおよびDMSOビヒクル中に接種されていますコントロール、 図2に示すレイアウトによれば、 図3は、単一のライブラリープレートによって例示次スクリーニングの結果を示します。代表的なOD 600およびGFP生データを、それぞれ、 図3A及び図3Bに示されています。色のグラデーションのヒートマップは、高いOD 600 / GFP値低示す（緑）の色を冷却するためのホット（赤）と、ウェルの値に適用されています。ヒートマップは、最低のODから及ぶ3色スケール条件付き書式を適用することにより、表計算ソフトで生成された600 / GFP読み出し最も高いOD 600 / GFP読み出しまで。 DMSO、陰性対照に比べて高い値がそれぞれ成長し、c-ジ-GMPレベルのプロモーションに対応しながら、DMSO、陰性対照と比較し低いOD 600とGFPの値は、それぞれの成長およびc-ジ-GMPレベルの阻害に対応します。 OD 600およびGFP ARのための堅牢なZ &#39;値Eプロトコル（5.1）に設けられた式に従って計算されます。彼らは0.5（それぞれ0.694及び0.761）上の両方であるように、アッセイの品質は堅牢と判断されたデータをさらに分析しました。増殖（OD 600）および細胞内c-ジGMPレベル（GFP）の％阻害は、プロトコル（5.2、5.3）に設けられた式によって計算されます。代表的なデータは、それぞれ図4Aおよび4Bに示されています。色のグラデーションのヒートマップは、高い％阻害低示す（緑）の色を冷却するためのホット（赤）と、ウェルの値に適用されています。一次スクリーニングに基づいて、個々のウェルから％阻害（OD600 / GFP）の散布図を図5（a）とそれぞれOD 600およびGFPデータのため5Bにプロットされています。 ±50％のカットオフは、（点線で示す）ヒット検出のために選択されます。このカットオフに基づいて、潜在的なヒットは赤い点で示されています。関心のある化合物の二つのタイプは、Dできますアッセイからiscerned。 図5Bにおいて同定ヒットが潜在的にc-ジGMPの細胞内レベルを調節する能力を有する化合物であるが、図5（a）で同定されたヒットは、細菌増殖を阻害する化合物です。二つの化合物は、このアッセイのための代表的なヒットとして同定されています。これらは、化合物A、潜在的な成長阻害剤と化合物B、潜在的なc-ジGMP阻害剤です。化合物Aは、 図3及び図4によくF8に対応し、成長中の72.5％の阻害を有しました。サイクリックジGMPレベルの期待に対応する阻害がありました。化合物Bは、 図3と図 4でよくK3に対応し、成長に変化がないとサイクリックジGMPレベルの61％阻害を示しました。選択ヒット化合物は、さらに、2 mMの二倍希釈系列の最高濃度で10点用量応答アッセイによって試験しました。 IC 50値は、用量反応に基づいて計算されます曲線（ 図6A及びB）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig1.jpg" /> 図1. 概要：P.におけるc-ジ-GMPの細胞レベルを調節するそれらの能力について小分子をスクリーニングするためのハイスループットのセットアップ 緑膿菌 。この概要では、このアッセイで使用されるプロトコルのステップバイステップの表現を示します。 P.の細菌コロニー緑膿菌を LBスターター培養物中で一晩成長させます。試薬ディスペンサーを使用して、セルが選択された化合物を含有する384ウェルプレートに接種します。プレートをOD 600とGFPの値を測定した後6時間、インキュベートします。これらの読み出し値を使用して、c-ジ-GMPの細胞レベルに影響を与える化合物を同定することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig1large.jpg" target="_blank">表示するには、こちらをクリックしてください。</a>この図の拡大版。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig2.jpg" /> 図2. 小分子は、スクリーニングアッセイに使用し、384ウェルプレートマップライブラリ（水色）からの化合物をウェルA1に等分されている- 。P22。 / mlのトブラマイシン硫酸をウェルA23に添加する50の最終濃度からなる「陽性対照」（赤） - 1％DMSOの最終濃度を含むP23および「陰性対照」（緑）をウェルA24に添加します - P24。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig3.jpg" /> One 384ウェルスクリーニングプレート図 3. 代表的な結果。Representative生データは、OD 600（A）およびGFP（B）のためのものです。熱いと色のグラデーションのヒートマップ（赤：OD 600 = 0.65またはGFP = 250,000）を冷却するために（緑：600 = 0.10またはGFP = 40,000 OD）高い値にローを示す色は、ウェルの値に適用されています。 DMSO対照と比較し、より高いOD 600 / GFPの測定値を持っているウェルが緑色になる傾向がある一方で、DMSO、陰性対照に比べて低いOD 600 / GFPの読みを持つウェルズは赤でとなる傾向にある。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig3large.jpg" target="_blank">大きいを表示するには、こちらをクリックしてください。この図のバージョン。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig4.jpg" /> 384ウェルプレートのために計算された阻害率図 4. 代表的な結果。分析％阻害データは、OD 60の両方のために表されています0（A）およびGFP（B）リードアウト。冷却するために：（OD 600 = -150％またはGFP = -20％赤）（緑：OD 600 = 100％またはGFP = 100％）ホットで色のグラデーションのヒートマップ、色が高い阻害値を低く示すが、されていますウェルの値に適用されます。潜在的成長と細胞内のc-ジ-GMPレベルを促進する小分子が赤になる傾向がある一方で、潜在的な成長と細胞内のc-ジ-GMPを阻害する小分子は、緑色になる傾向がある。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig4large.jpg" target="_blank">拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig5.jpg" /> 試験した各小分子。各小分子から得られた 阻害％（OD600 / GFP）図5.代表散布図は、ドットと阻害％の分布で表されますOD 600（A）およびGFP（B）のそれぞれについてリードアウトを示しています。 ±50％のカットオフは、ヒットの同定のために選択されます。潜在的なヒットは赤で強調表示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54115/54115fig6.jpg" /> 線量から 図6. 代表的な結果- 。前の画面から確認応答アッセイ 2つの化合物（潜在成長阻害剤Aおよび潜在的なc-ジ-GMP阻害剤B）は、さらに2の最高濃度で10ポイント用量反応アッセイで試験されていますmMの二倍希釈系列。 158μMおよび193μMのIC 50値は、それぞれのデータに4パラメーターロジスティック関数が得られたフィッティング。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54115/54115fig6large.jpg" target="_blank">PLE</a>ASEこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

この記事では、正常に抗菌薬の発見と化合物試験のための新しい強力なツールを提供し、 緑膿菌におけるサイクリックジGMPの細胞レベルを操作するその潜在的能力について小分子の大きなライブラリーをスクリーニングするために設立されたハイスループットアッセイを説明します。

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立<em&gt;緑膿菌</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

本手順の全体的な目的は、ハイスループット・バイオリポーター・スクリーニングを用いて、日和見感染 pathogens である Pseudomonas aeruginosa におけるセカンドメッセンジャー cyclic-di-GMP の細胞内レベルを調節する低分子化合物を同定することです。この手法は、cyclic-di-GMP の調節を介して Pseudomonas aeruginosa のバイオインフォメーションやその他の粒子に干渉する低分子化合物の解明に役立ちます。本技術の主な利点は、非常に堅牢で汎用性が高く、48時間以内に3,500件以上の化合物のスクリーニングが可能である点にあります。この手法の意義は、細菌への選択圧を低く抑えつつ、Pseudomonas aeruginosaを免疫系や既存の抗菌薬に対して潜在的に感受性にする新しい治療法の開発へと広がります。5 mLのリソジェニーブロス（LB培地）にP.aeruginosaのシングルコロニーを接種し、37 °C、200 rpmの振盪条件下で培養します。その後、 overnight培養液の2 mLを、1 Lフラスコに入れた200 mLの新鮮なLB培地に移し、37 °C、200 rpmの振盪条件下でインキュベートします。フラスコから1 milliliterのサンプルを採取し、分光光度計を用いて30分ごとに600 nanometersにおける光学的密度（OD 600）を測定します。OD 600が0.3から0.5に達したら、培養液40 milliletersを50 mililiterコニカル遠心チューブに移します。4 degrees Celsiusで10分間、8000 rpmで遠心分離し、細胞をペレット化します。上清を捨て、氷冷した滅菌済みの300 millimolar ショ糖溶液 40 milliliters で細胞を再懸濁します。細胞を2回目に遠心分離した後、氷冷した滅菌済みの300 millimolar ショ糖溶液 20 milliliters で再懸濁します。再度細胞を遠心分離し、300 millimolar ショ糖溶液 400 microliters で再懸濁します。細胞を氷上で30分間冷却すると、エレクトロポレーションが可能な状態になります。次に、氷上であらかじめ冷却した1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに入った、調製済みのP.Aeruginosa電気穿孔能細胞40 microlitersに、CdrAプロモーターから緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子までのプラスミド溶液（0.2 microgram per microliter）を1 microliter添加します。懸濁液を混合し、あらかじめ冷却した2 millimeter電極間隔のエレクトロポレーションキュベットに移します。キュベットの外側の水分をティッシュペーパーで拭き取り、キュベットをエレクトロポレーターのサンプルチャンバーにセットします。電圧2.5 kilovolts、静電容量25 microfarad、抵抗200 ohmsで溶液にパルスを印加します。キュベットを取り出し、LB培地を1 milliliter加えます。その後、細胞を滅菌済みの1.5 milliliterマイクロ遠心チューブに移し、37 degrees Celsiusで200 rpmの振盪を加えながら2時間インキュベートします。インキュベーション後、培養液の10 µL、50 µL、および100 µL分注液を、アンピシリンを添加した滅菌済みのLB寒天プレートに塗抹し、プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。標準的なGFPチャネルを備えた蛍光顕微鏡でプレートを観察し、GFPの発現を確認します。単一のコロニーをピックアップし、5 mLのLBに接種します。一晩のインキュベーション後、一晩培養した培養液0.5 mLと50%グリセロール0.5 mLを2 mLスクリューキャップチューブで混合し、-80 °Cで保存します。スクリーニングの2日前、-80 °C保存ストックから準備したP.aeruginosa株を、滅菌済みの白金耳を用いてプレート全体に緩やかに塗抹し、LB寒天培地に播種します。プレートを37 °Cで一晩培養します。スクリーニング前日の夜、プレート上のP.aeruginosaのシングルコロニーを、チューブに入れた10 mLのLB培地に接種します。前培養液を37°Cで200 rpmで振盪しながら一晩インキュベートします。スクリーニング当日、一晩インキュベートした前培養液を新鮮なLB培地でOD 600が1.0になるまで希釈し、さらに5% LBでOD 600が0.4になるまで希釈して、サブカルチャーを調製します。容器に滅菌済みのマグネチックスターバーを加え、マグネティックスターラーを用いて室温で30分間、最低速度で撹拌します。これにより、細菌を384ウェルプレートに分注する前に、培地に順化させることができます。陽性対照を調製するには、調製した継代培養液10 millilitersにTobramycin Sulfateを20 microliters加え、穏やかに混合します。陽性対照培養液を40 microlitersずつ、ウェルA23からP23までピペットで分注します。陰性対照を調製するには、調製済みの継代培養液 10 milliliters に Dimethyl Sulfoxide 30 microliters を加え、穏やかに混ぜ合わせます。陰性対照培養液 40 microliters をウェル A24 から P24 までピペットで分注します。低分子化合物で処理した各プレートのウェル A1 から P22 までに、希釈した overnight 培養液を 40 microliters ずつ接種します。プレートを空気透過性カバーシールで密閉し、37 °Cで6時間インキュベートします。結露を防ぐため、分光光度計による測定の約30分前に、プレートリーダーを37 °Cに予熱しておきます。測定前に、プレートから空気透過性カバーシールを慎重に取り除きます。次に、1ウェルあたり10回のフラッシュ、セトリングタイム0.2秒の設定で、波長600ナノメートルにおける吸光度を測定します。蛍光測定の前に、陰性対照であるウェルA24に基づいて自動ゲインおよびフォーカス調整を行い、ゲイン目標値を75%に設定します。ウィンドウの右側でフォーカス調整とチャンネルAを選択します。励起極大波長485ナノメートル、蛍光極大波長520ナノメートルで、1ウェルあたり10回のフラッシュ、セトリングタイム0.2秒の設定にてGFPレポーターの蛍光を測定します。解析したすべてのプレートからデータを収集します。データ読み取り値は、プレートリーダーの制御ソフトウェアによってデフォルトで自動的に保存されます。データを解析するには、制御ソフトウェア内のMarsアイコンをクリックして統計解析パッケージを開き、読み取り値を確認してください。解析したいプレート番号をダブルクリックしてデータを取得します。堅牢なZ-prime解析を用いて、アッセイの均一性と再現性を評価します。その後、テキストプロトコルに詳述されている通り、増殖抑制率を算出し、細胞内c-di-GMPレベルの抑制率を評価します。この図は、ハイスループットスクリーニングにおけるOD 600およびGFPの代表的な生データを示しています。ウェルの値には、低値から高値に向けて暖色から寒色へと変化するカラーグラジエントヒートマップが適用されています。生成されたデータから阻害率が解析され、ここではOD 600とGFPの両方の読み取り値について示しています。増殖および細胞内c-di-GMPを抑制する可能性のある低分子化合物は概ね緑色で、増殖および細胞内c-di-GMPレベルを促進する可能性のある低分子化合物は概ね赤色で表示されます。各テスト済み低分子化合物から得られた抑制率を比較するために、散布図が用いられています。各低分子化合物は小さな点で表され、OD 600およびGFPのそれぞれの読み取り値に対する抑制率の分布が示されています。ヒットの特定には、±50%のカットオフ値を選択します。潜在的なヒットは赤色でハイライトされます。関心のある各化合物に対して、用量反応アッセイを実施します。ここでは、特定された2つの化合物を、最高濃度2 mMおよび2倍希釈系列による10点用量反応アッセイで試験します。データに4パラメータロジスティック関数を適合させた結果、各化合物の半最大阻害濃度（IC₅₀）は158 µMおよび193 µMとなりました。この手法を習得すれば、48時間以内に3,500以上の化合物をスクリーニングすることが可能です。このビデオを視聴することで、cyclic-di-GMPシグナリングを妨害する化合物を検出すべく、Pseudomonas aeruginosaをロバストにスクリーニングする方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、数日間にわたってスクリーニングを行う場合に、スクリーニング条件を同等に保つことが重要である点に注意してください。シングルポイントスクリーニングに続き、同じプロトコルを用いて用量反応スクリーニングを行うことで、ヒット化合物を検証することができます。この手法は、Pseudomonas aeruginosaのバイオフィルム形成および抗生物質耐性を阻害する潜在的な低分子化合物を研究者が特定するための道を切り開くものです。重要な点として、この手法は任意の標的細菌に適応させることができ、細菌の生存能への影響など、他の出力や入力項目を調べるために修正することも可能です。最後に、Pseudomonas aeruginosaを取り扱う際は危険が伴う可能性があることに留意してください。また、本手順を実施する際は、個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じてください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶc-di-GMPシグナリングを調節する小分子のハイスループットスクリーニング法。緑膿菌Pseudomonas aeruginosaを用いたバイオリポーターアッセイで、48時間で3,500化合物を検証可能な抗菌薬開発ツールです。

調節するc-ジ-GMPシグナリングで、小さな分子をスクリーニングするためのハイスループットセットアップの確立

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