Name: 蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: 学ぶ蛍光C.elegans培養とハイスループットスクリーニング法。化学ライブラリーのスクリーニングや環境汚染物質の検出に適用でき、転写経路の調節因子を同定する強力なプラットフォームを提供します。

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C. elegansの導入遺伝子は線虫遺伝学センター（ミネソタ大学、ミネアポリス、ミネソタ州）から提供された。この作品は、NIHのR21グラントKSへNS0667678 - 01によってサポートされていました。すべての著者は、収集、分析、およびデータの解釈にも参加。 CKL、KS、およびKPCは、原稿を書いたり、改訂に参加した。

1。細菌ワームの食品の調製日1 <ol><li>飽和E. 5 mlを加え大腸菌 OP50細菌培養に500ミリリットルのTerrificブロス50μg/ mlのストレプトマイシンを補充し、37℃で振盪インキュベーター（225 rpm）で一晩で成長℃の</li></ol>日2 <ol start="2"><li> 20分2,500 rcfで冷却遠心機で10 50mlチューブと遠心分離機の細菌に一晩細菌培養を分割する。 </li><li> LBブロスからデカントし、液体の線虫の増殖培地（NGM）の10mlにそれぞれの細菌のペレットを再懸濁します。細菌を懸濁するために15分間床シェーカーに水平に振る。 NGMバッファを作成するには、1リットルの脱イオン水とオートクレーブに3グラムのNaClを加える。 55℃まで冷却し、ために、以下の滅菌溶液を追加する：1 M CaCl 2で 、1 M MgSO 4を 1 mlの、そして1 Mリン酸カリウム、pH6.0の25mlのを1ml。 </li><li> 20分2,500 rcfで冷却遠心機で細菌培養を遠心分離します。 </li><li> NGMのバッファoffデカントし、細菌ペレットの重量を量る。 </li><li> 、ペレットを再懸濁させるNGM等量のバッファーを追加して細菌のアリコートを3ミリリットル、15 mlチューブに集中し、-20℃で保存します。 </li></ol> 2。大規模C. elegansの液体培養我々はトランスジェニックラインを使用VP596（dvIs19 [pAF15（GST - 4：：GFP：：NLS）]; vsIs33 [DOP - 3：：RFP]）は、2つの蛍光構造運ん：SKN - 1を監視するためにGFP 14：Pgst -4：活動とPDOP - 3：：RFP 17ワームの数の正規化のための標準として機能する。 日1 <ol><li> 150ミリリットルNGMバッファー、1.5 mlのLBブロス、5 mg / mlのコレステロールを150μl（エタノール）、および100 mg / mlストレプトマイシンの75μlを混合します。混合物をろ過滅菌し、1リットル無菌フラスコに加える。 注記：NGMバッファに1％のLBブロスを追加すると、ガラス器具やプラスチック容器に付着するのワームを防ぐのに役立ちますが、この量はバクテリアの成長をサポートするのに十分ではない。 </li><li>標準的な次亜塩素酸の手順18でワームを同期させます。まで妊娠ワームの0.5mlには次亜塩素酸溶液5ml（3.75ミリリットル滅菌水、1mlの家庭用漂白剤、および250μlの10NのNaOH）でシングル15 mlチューブで処理することができます。滅菌水でリリースされた卵を洗うとNGMの緩衝液10mlに再懸濁します。 </li><li>卵NGMバッファーで100倍（例えば、10ml中の100μlの）のサンプルを希釈し、3つの独立した5μlのアリコートで卵の数を数えます。卵の総数を推定するために20万の平均数（100希釈率× 2,000）、複数の。 </li><li> NGMのバッファ付きフラスコに20万〜200万の卵を追加し、20℃100rpmで振とう培養℃に</li></ol>日2 <ol start="5"><li>フラスコに卵を追加した後、少なくとも16時間、中断されたワームの文化の約0.5 mlを削除するには、無菌の血清学的ピペットを使用してください。ペトリ皿の滅菌蓋の上にピペットで3つの5μlの滴。ワームを麻痺させる1〜2分間-20℃の冷凍庫にふたをする。孵化したワームの総数を推定するために30,000（150ミリリットル/ 5μl）を、5μlとし、複数の当たりのライブ孵化ワームの平均数を数える。 </li><li>冷凍OP50細菌培養（議定書1.6）のチューブを融解、500,000斜線ワームあたりワームの文化に50パーセントOP50の3 mlを加える。 20℃で100rpmで振とうフラスコ℃をワームは、約51時間でL4幼虫や若い成人に発展する。細菌のOD600は、先頭に2.200程度にする必要があります。吸光度による細菌の量を監視し、OD 600が0.900を下回る場合は、よりを追加。 </li></ol> 3。ワームの収集及び調剤日4 <ol><li>標準NGM寒天培地にサスペンドワームの文化の約0.5 mlを転送するために滅菌血清ピペットを使用してください。ほとんどがL4幼虫や若い成人であることを確認するために実体顕微鏡でワームを見る。 L4幼虫は、体の真ん中で腹明確なスポットを持つことになります。若年成人は、わずかに大きく、明確なスポットを持っていないこととなります。 </li><li>滅菌50 mlのチューブにワームの文化を注ぎ、ベンチ上で試験管ラックにチューブを置きます。ワームは、約10分間静することができます。吸引またはピペットで上清を取り除きます。 注：この手順は、彼らはL4幼虫や若い成人よりも遅い解決するため、開発していない卵からかえっていない卵やワームを除去することが重要になることができます。 </li><li>単一の50 mlチューブに、すべてのワームを収集し、細菌を除去するために1％のLBブロス（NGM + LB）で3〜4回NGMバッファーで洗浄する。 注記：これは最高の30秒間に500 rcfで、ワームを収集し、新鮮なNGM + LBバッファーで上清を置き換えることにより、スイングローター遠心機で行われます。 </li><li>洗浄後、50mlに+ NGMとLBのバッファーをチューブに充填し、カスタムワーム調剤フラスコに注ぐ。小さな攪拌棒を追加し、ワームが一時停止を維持するためにかき混ぜる。目を数える上に示した3つの5μlの滴のワームの電子の数。あなたが5μlの降下（約2.5〜3.0ワーム/μL）あたり12月15日ワームを得るまでNGM + LBで希釈する。 注記：約20ml（60,000ワーム）の最小値は、調剤フラスコとディスペンサーカセットのデッドスペースを埋めるために必要とされる。各384ウェルプレートは、約35,000ワームやサスペンドワームの11.5 mlを必要とします。 </li><li> 10μlの調剤カセットをロードし、70％エタノールでプライミングによって滅菌する。滅菌水でプライミングによってエタノールをすすいでください。 </li><li>それだけでその動きを中断することなく、攪拌棒の上になるようにフラスコに分注カセットの端を差し込みます。ワームが全体フラスコを通して中断されたままにいることを確認してください。 2プリパルスで低速度で分配するようにプログラムディスペンサー。素数とは、一時停止ワームの少なくとも10 mlを実行します。チューブにセトリングからワームを防ぐために迅速に、必要に応じてプレートを埋める。 </li><li>通気性のテープでプレートをシールします。 </li><li>あなたのアッセイのための適切な温度でインキュベーター内で振とう台にプレートを置きます。プレートを積み重ねないでください。 </li></ol> 4。蛍光分析<ol><li>適切な発光と励起波長（：; RFP 540/25ex 590/35em GFP 485/20ex 528/20em私たちのアッセイのためのフィルタ）で各ウェルの蛍光強度を測定するためにマイクロプレートリーダーにターゲットプレートを置きます。 </li><li> GFP / RFPの比を計算し、個々の治療に由来する蛍光強度の正確な倍の差を決定するために対照ウェル（活性化化合物なし）の測定値で正規化する。 </li></ol> 5。代表的な結果： 私たちのSKN - 1アッセイは、染色体に統合されたデュアルレポーター株（VP596）を使用しています。図1に示すように、ワームの数は、よく分注されたボリュームに相関している。図2Aおよび2Bに示すように、ウェルあたりの総GFPとRFPの蛍光は十分によく384ウェルプレート全体から高い再現性です。などの非誘導Pgst - 4、図2Cに示すように：：GFPの蛍光は、直線的にPDOP - 3と相関している：：384ウェル間のRFP。 ：ばらつきを低減するためのRFPレポーター：GFP / RFPの比として表現したとき、蛍光はPDOP - 3の能力を示す384ウェルプレート（図2Dから2Aへの係数の変化を比較する）を介してウェルからウェルに高い再現性となる。図3に示すように、SKN - 1生体異物活性化（38μMjuglone）とRFPに対する相対的なGFPの誘導は、堅牢で384ウェルプレートで高い再現性です。 <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ボリュームに対するワームの数は、分注した。ワームは、約2/μlに希釈し、実体顕微鏡とマニュアルカウントのための24ウェルプレートに分注していた。体積当たりN = 8井戸。 <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2は、384ウェルプレートに分注されたワームの総蛍光は再現可能です。ワームは、約2.5/μl、30μlに希釈し、384ウェルプレートの各ウェルに分注した。すべてのウェルのGFP（A）とRFP（B）蛍光は、9％以下の変動係数を持っていた。 （C）GFP蛍光は非常にRFP蛍光相関している。 （D）RFPにGFPの比率を計算するには、下記の6％に変動係数を減少させた（A、B、およびD）実線は、手段を示し、破線は平均値の上または下にある3つの標準偏差を示している。 <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 。Pgst - 4の図3の活性化：：GFPは、堅牢で一貫性です。約75 L4ワームは、384ウェルプレートの全ウェルに分配され、38μMのjugloneは、他のすべての列に追加されました。 GFPとRFPの蛍光はインキュベーションの21時間後に測定した。すべてのコントロール（1.0）とjuglone井戸（8.9）の平均相対蛍光比を実線でマークされます。コントロール上の3つの標準偏差は意味とjuglone平均より破線でマークされます。

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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

我々は、培養する方法を提示し、トランスジェニック線虫の多数を調剤。培養のワームに使用される機器は、分子のクローニングを行う検査室の標準であり、液体のハンドリングと蛍光装置は、マイクロプレートを大量に処理する研究室の標準です。ライブC.多数の調剤の他の方法虫は、機器19をソートする高価な粒子が必要です。 Pgst - 4：：GFPアッセイは、キャップ&#39;n&#39;をカラー転写因子の小分子モジュレーターをスクリーニングするために、環境や食品試料14,16の生体異物と酸化剤の汚染物質を検出するために使用することができます。堅牢な誘導性トランスジェニックGFPレポーターは、経路と環境刺激4の広い範囲で利用可能であるため、本手法は、多くの経路の開発変調器への適用可能でなければならず、汚染物質の広いスペクトルを検出する。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td> LBブロス</td><td>研究プロダクツインターナショナル株式会社</td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td>素晴らしいスープ</td><td>研究プロダクツインターナショナル株式会社</td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td>シナジー™HTマルチモードマイクロプレートリーダー</td><td> BioTekの</td><td></td><td>フィルター：GFP 485/20ex 528/20em、RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo選択ディスペンサー</td><td> BioTekの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ワーム調剤フラスコ</td><td>南サイエンティフィック社、Micanopy、フロリダ州</td><td></td><td>カスタムは（352）284から2531を組み立てました</td></tr><tr><td> 384マイクロプレート</td><td>グライナーバイオワン</td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td>通気性のシールテープ</td><td>ヌンク</td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> （5 - ヒドロキシ- P - naphthoqinone）Juglone </td><td>アクロス</td><td> 121640010 </td><td> JugloneはDMSOに溶解し、 </td></tr><tr><td> DMSO </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> D - 5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegansのトランスジェニック系統</td><td>著者の研究室</td><td> VP596 </td><td> Pgst - 4：：GFPとPDOP - 3：：RFP </td></tr></tbody></table>

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング c.エレガンス菌株

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

ハイスループットスクリーニング（HTS）は、生物学的プロセスの化学的モジュレーターを同定するための強力なアプローチです。しかし、細胞培養モデルを使用して画面で識別される多くの化合物はしばしば生体 1-2 の毒性または薬理学的に不活性であることがわかっている。全体の動物モデルでのスクリーニングは、これらの落とし穴を回避し、薬剤開発へのパスを効率化できます。 C. elegansはよくHTSに適した多細胞モデル生物です。それは小さい（&lt;1 mm）と経済的に培養し、液体中で省略することができる。C.は虫はまた、薬物モードのアクション3の迅速かつ詳細な識別を可能にする最も実験的に扱いやすい動物モデルの一つです。 我々は、培養のためのプロトコルを記述し、Cの蛍光菌株を分注する化合物ライブラリーまたは特定の遺伝子の発現を変化させる環境汚染物質の検出のハイスループットスクリーニングのためのエレガンス 。発達同期ワームの多数は、液体培養で増殖収穫、洗浄、および定義された密度で懸濁する。ワームはその後、蠕動液体ディスペンサーを使用して黒、平底の384ウェルプレートに追加されます。化学物質のライブラリまたは試験サンプル（例えば、水、食物、または土壌）からの小分子は、ワームとのウェルに添加することができます。 生体内では 、リアルタイムの蛍光強度を蛍光マイクロプレートリーダーで測定される。このメソッドは 、Cの任意の誘導性遺伝子に適合させることができます適切なレポーターが使用可能なエレガンス 。多くの誘導性ストレスと発達転写経路はよくCで定義されています。 虫とGFPトランスジェニックレポーター株は、すでにその4の多くのために存在する。適切なトランスジェニック記者と組み合わせることで、私たちの手法は、経路の調節因子をスクリーニングするか、環境汚染物質のための堅牢なバイオアッセイを開発するために使用することができます。 私たちは、Cを示しています虫の文化と我々はCを監視するために開発されたHTSアッセイと調剤プロトコル虫キャップ&#39;N&#39;カラー転写因子SKN - 1。 SKN - 1とその哺乳類ホモログのNRF2は5-10酸化や生体異物のストレス時の細胞保護遺伝子を活性化する。 NRF2は、がん、神経変性疾患、および慢性炎症のような多数の加齢に伴う障害から哺乳類を保護し、主要な化学療法の標的11から13になっています。私たちのアッセイを-4 SKN - 1の標的遺伝子GST 14のGFPトランスジェニックレポーターに基づいて、これは、グルタチオン- Sトランスフェラーゼ6をエンコードします。 GST -4記者はまた、SKN - 1を活性化し、そのようなアクリルアミドとメチル水銀15から16のような汚染物質の低レベルを検出するために使用できる生体異物と酸化的化学物質のバイオセンサーです。

液体ベースの培養および調剤のための手順<em&gt; C.エレガンス</em蛍光レポータータンパク質を発現する&gt;株は、高価な仕分け装置を必要としないことが記載されている。このアプローチは、多数の誘導に適用することができます<em&gt; C.エレガンス</em&gt;汚染物質の創薬やバイオセンシングのための遺伝子。

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

ハイスループットスクリーニング（HTS）は、生物学的プロセスの化学的モジュレーターを同定するための強力なアプローチである。しかし、…で同定された多くの化合物は、

このビデオでは、化学ライブラリの高スループットスクリーニングや環境汚染物質の検出を行い、化学物質や環境因子が特定のタンパク質活性に及ぼす影響を評価するための、蛍光標識CL gans株の培養および分注方法を実演します。CL elganにおいて、まず線虫の餌となる細菌培養物を調製し、GFP転換された同期化した線虫を培養します。その後、0.5から2百万匹の虫を回収して洗浄し、3枚の84ウェルマイクロタイタープレートに分注します。次に、化学ライブラリーからの低分子化合物や、水、食品、土壌などの試験サンプルを虫に添加します。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて虫の蛍光を測定します。蛍光強度のデータ解析により、誘導性転写経路を調節する低分子化合物や、環境汚染物質の検出を可能にする化合物を明らかにすることができます。in vitro試験や細胞培養ベースのアッセイなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、in vivoで毒性があるか、あるいは不活性な化合物に時間を費やすことがない点にあります。このハイスループット手法は、多様な誘導経路を調節する低分子化合物の同定に役立ちます。本手法は低分子化合物ライブラリーの高スループットスクリーニングのために開発されましたが、食品や環境試料中の汚染物質のバイオセンシングにも適用可能です。手順のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるAndrew Dineと、博士研究員のQ longが行います。細菌用線虫餌を事前に準備しておいてください。50 µg/mLのストレプトマイシンを添加した500 mLのTerrific Brothに、5 mLの飽和したE. coli OP 50を接種することから始めてください。培養液をシェーカーに設置し、37 °Cで一晩培養します。翌日、培養液を10本の50 milliliterチューブに分注します。次に、チューブを冷却遠心機にかけ、2,500 RCFで20分間遠心分離します。遠心分離後、各細菌ペレットを10 millilitersの液体線虫増殖培地（NGM）に懸濁させます。懸濁液を水平方向に振盪させます。細菌を再懸濁させるため、フロアシーカーで15分間振盪します。次に、細菌培養液を4 °C、2,500 RCFで20分間遠心分離します。NGMをデカントし、細菌ペレットの重量を測定します。次に、同量のNGM緩衝液を加え、ボルテックスでペレットを再懸濁します。最後に、再懸濁した細菌培養液を3 mLずつ15 mLチューブに分注し、使用時まで−20 °Cで保存します。このデモンストレーションでは、例として、ストレスを誘導するXeno Duke loanが転写因子Sskn oneに及ぼす影響を測定します。Sskn oneは、酸化ストレスおよびxenobiストレス時に細胞保護遺伝子を活性化することが知られています。2つの蛍光コンストラクトを保持するTrenchgenic c gansラインVP 5 96の大規模培養を調製します。VP 5 96 系統のワームは、転写因子の活性をモニタリングするために用いる GFP を駆動する GST four プロモーターと、ワーム数の標準化に使用する RFP を駆動する Sskn one および DOP three プロモーターの両方を発現しています。DOP threeはドーパミン受容体のプロモーターであり、全身のニューロンで構成的に発現しています。本例では、ゼノバイロンがsskn oneを強力に活性化し、GST fourプロモーターから発現するGFPの量を増加させることを示します。培養の準備として、150 millilitersのNNGM緩衝液、1.5 millilitersのLB、150 microlitersの1 molarコレステロール、および75 microlitersの100 milligrams per milliliter Streptomycinを混合します。LBを添加することで、線虫がガラス器具やプラスチック器具に付着するのを防ぐことができますが、この量では細菌の増殖を維持するには不十分です。混合液をフィルター滅菌し、滅菌済みの1リットルフラスコに移して、GR成虫から卵を放出させるために静置します。遠心分離を行い、上清が透明になるまでNGM培地を交換して、虫から細菌を洗浄します。さらに、滅菌水に再懸濁して再度遠心分離を行い、2回目の洗浄を行います。上清を除去し、チューブに3.75 millilitersの滅菌水を満たします。1 milliliterの家庭用漂白剤と250 microlitersの10 normal 水酸化ナトリウムを加え、直ちに5〜6回転倒混和します。線虫を漂白剤に4分間さらした後、チューブをローテーターに設置します。チューブを実体顕微鏡下に置きます。成虫のほとんどが溶解しているはずです。チューブを15～20回激しく振って、残っている成虫の溶解を促進します。溶解が合計5分間完了した後、チューブがいっぱいになるまで滅菌水を加えます。卵を回収するため、5〜6回転倒混和します。チューブを500 RCFで1分間遠心分離します。滅菌水10 mLで懸濁して遠心分離し、上清を除去する操作を3回繰り返し、卵を洗浄します。次に、卵のサンプル100 µLに10 mLのNGM緩衝液を加えて100倍に希釈します。その後、顕微鏡下で5 µLのアリコート3回分をシャーレの蓋にピペッティングします。3つの独立した5 µLのアリコートに含まれる卵の数を数えます。総卵数を推定するため、NGMバッファーを入れたフラスコに200,000個から200万個の卵を加え、20 °C、100 RPMで培養液を振とうさせる。卵をフラスコに加えてから少なくとも16時間後、滅菌済みセロロジーピペットを用いて、懸濁させた線虫培養液を約0.5 mL分取り出す。滅菌済みのペトリ皿の蓋に、5 µLの液滴を3滴分ピペットで滴下します。この蓋を-20 °Cのフリーザーに1～2分間置き、ワームを麻痺させます。ワームが麻痺した後、実体顕微鏡を用いて5 µLあたりの生存した孵化ワームの平均数をカウントし、総数を推定します。あらかじめ調製した凍結保存済みのOP 50細菌培養物を、ベンチ上に数分間置いて解凍します。次に、孵化した線虫500,000匹あたり3mLの50% OP 50を加えます。フラスコを20°Cで100 RPMで振盪させます。線虫は約51時間でL4幼虫および若成体へと成長します。培養期間中は、視覚的な確認により細菌量などの状態を監視してください。培地が透明になった場合は、細菌を追加してください。滅菌済みセロロジカルピペットを使用して、懸濁した線虫培養液を約0.5 milliliters標準NGMアガープレートに転移させます。実体顕微鏡で線虫を観察し、大部分がL4幼虫および若齢成虫であることを確認してください。明視野顕微鏡下では、L4幼虫は体の中心に腹側の透明なスポットが見られます。若齢成虫はそれよりもわずかに大きく、透明なスポットは見られません。次に、線虫の培養液を滅菌済みの50 milliliterチューブに移します。チューブをフード内のテストチューブラックに設置し、未孵化の卵や発育不全の線虫を沈殿させます。これらは、発育した線虫よりもゆっくりと沈殿します。10分後、孵化していない個体および未発達の個体を含む上清を吸引して除き、各ペレットに約10 millilitersのNGM緩衝液を加え、チューブを軽く回して虫体を懸濁させます。すべての虫体を1本の50 milliliterチューブに集めます。スイングバケット centrifugeを用いて500 RCFで30秒間遠心分離します。次に、線虫を1% LB含有NGM 50 millilitersに再懸濁して洗浄します。これを3〜4回繰り返し、洗浄後に細菌を除去します。チューブにNGMおよびLBバッファーを満たし、50 millilitersにします。これをスターバーを入れたカスタム線虫分注フラスコに注ぎ、スターラープレートの上に置きます。分注フラスコと分注カセットのデッドスペースを満たすには、最低でも約 20 milliliters または 60,000 worms が必要です。前述の方法で、5 microliter の滴を3回分取り、線虫の数を数えます。NGMおよびLBを用いて、5 µLの液滴あたり12〜15匹の濃度に調整した後、3枚の84ウェルプレートにつき約35,000匹、または11.5 mLの虫体懸濁液が必要となります。10 µL用分注カセットをディスペンサーに装着し、70% ethanolでプライミングして滅菌します。その後、滅菌水でプライミングしてethanolを洗い流します。分注カセットの先端をフラスコに挿入し、攪拌子の動きを妨げないよう、攪拌子の直上に位置させます。線虫がフラスコ全体で懸濁したままであることを確認してください。分注器を低速で設定し、2回のプリパルスでプライミングを行い、少なくとも10 millilitersの懸濁線虫を分注するようにプログラムします。線虫がチューブ内で沈降するのを防ぐため、あらかじめ試験化合物を入れたマイクロタイタープレートに速やかに充填してください。ここでは、事前にマイクロタイタープレートにロードしておいた試験化合物を用います。Glow。ウェルに埃が溜まるのを防ぐため、プレートを透湿性テープで密閉します。プレートを、アッセイに適した温度に設定したインキュベーター内のシェイキングプラットフォームに設置します。空気の流れが妨げられる可能性があるため、プレートを積み重ねないでください。ターゲットプレートをマイクロプレートリーダーにセットし、適切な励起および蛍光波長を用いて、各ウェルの蛍光強度を測定します。GFPに使用するフィルターは励起波長 485 nm、蛍光波長 528 nmです。RFPに使用するフィルターは励起波長 540 nm、蛍光波長 590 nmです。プレートの読み取り後、GFPとRFPの比率を算出し、活性化化合物を含まないコントロールウェルの読み取り値で標準化することで、各処理から得られた蛍光強度の正確な倍率差を決定します。ここで示すSSKN oneアッセイでは、染色体統合型デュアルレポーター株を使用し、ステレオ顕微鏡を用いて線虫を数え上げました。線虫の数は、分注量とR2値0.94、p値0.0001未満で相関しました。これは、分注量を調整することで、各ウェルに分注される線虫の数を制御できることを示しています。これらの図において、左側に示されている1ウェルあたりの合計GFP蛍光および右側に示されている1ウェルあたりのRFP蛍光は、384ウェルプレート全体でウェル間再現性が非常に高い。XSは各ウェルで測定された相対蛍光強度を示す。実線は平均値を、破線は全ウェルの平均蛍光強度の上下3標準偏差を示しており、変動係数は9%未満であった。本図に示すように、384ウェルにおけるGST 4プロモーター由来のGFP蛍光は、DOP 3プロモーター由来のRFP蛍光と線形相関しており、R²値は0.62、p値は0.0001未満であった。したがって、非誘導性のRFPレポーターを用いて、誘導性のGFPレポーターの標準化を行うことができます。GFPとRFPの蛍光強度の比率を算出することで、384ウェルプレート内の各ウェル間において高い再現性を得ることができます。GFPとRFPの比率を算出することで、変動係数を6%以下に抑えることができ、ここで示されているように、DOP three promoter RFPレポーターがばらつきを低減できることが実証されました。SK N one活性化ゼノバイオティクスによるRFPに対するGFPの誘導は、384ウェルプレート全体で強固かつ高い再現性を示しており、すべてのコントロールウェルおよびdue GLOウェルの平均相対蛍光比を実線で示しています。コントロール平均の3標準偏差上およびdlo平均の3標準偏差下を破線で示しています。一度習得すれば、線虫培養の開始は初日に約1時間で完了し、回収と分注にかかる時間は、適切に行えば約2時間で完了します。この手順を試みる際は、少なくとも60,000匹の線虫から開始し、分注中はそれらを懸濁状態に保つことが重要である点に注意してください。この手順に従ってスクリーニングを行うことで、例えば、他の誘導性経路のレポーター系統を用いたスクリーニングを実施し、開発後に他の経路のモジュレーターを構築することが可能です。この手法は、ハイスループットスクリーニングやバイオセンシングの分野の研究者が、低分子のパスウェイモジュレーターを迅速に特定したり、環境汚染物質を検出したりするための道を開く可能性があります。このビデオを視聴することで、誘導性転写パスウェイのハイスループットスクリーニングや、環境汚染物質の複数サンプルの試験において、蛍光標識されたC. elegans株をどのように培養・分注し、測定するかを十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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