蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

このビデオでは、化学ライブラリーの高スループットスクリーニングや環境汚染物質の検出を行い、特定のタンパク質活性に対する化学物質や環境因子の影響を評価するための、蛍光標識したC. elegans系統の培養および分注方法について解説します。C. elegansの飼育では、まず餌となる細菌培養液を調製し、GFP転写遺伝子を導入した同期化した線虫を培養します。

その後、0.5〜2 million匹の虫を回収して洗浄し、3枚の84ウェルマイクロタイタープレートに分注します。次に、化学ライブラリー由来の低分子化合物や、水、食品、土壌などの検体を虫に添加します。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて虫の蛍光を測定します。

蛍光強度のデータ解析により、誘導性転写経路を調節する低分子化合物や、環境汚染物質の検出を可能にする化合物が明らかになります。in vitroや細胞培養ベースのアッセイなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、in vivoで毒性がある、あるいは不活性な化合物に時間を費やすことがない点にあります。このハイスループット法は、多様な誘導性経路を調節する低分子化合物の同定に役立ちます。

本手法は低分子化合物ライブラリの高スループットスクリーニングのために開発されましたが、食品や環境試料中の汚染物質のバイオセンシングにも適用可能です。手順のデモンストレーションは、当研究室のテクニシャンであるAndrew Dineと、博士研究員のQ longが行います。細菌用ワームフードを事前に準備しておいてください。

50 µg/mLのストレプトマイシンを添加した500 mLのterrific brothに、5 mLの飽和したe coli OP 50を接種することから始めます。培養液をシェーカーに置き、37 °Cで一晩培養します。

翌日、培養液を10本の50 milliliterチューブに分注します。次に、チューブを冷蔵遠心機にかけ、2,500 RCFで20分間遠心分離します。遠心後、各細菌ペレットを10 millilitersの液体線虫成長培地（NGM）で再懸濁します。

懸濁液を水平方向に振盪させます。床置き型シェーカーを用い、15分間振盪して細菌を再懸濁させます。次に、細菌培養液を4 °C、2,500 RCFで20分間遠心分離します。

NGMをデカンテーションし、細菌ペレットの重量を測定します。次に、同量のNGMバッファーを加え、ボルテックスでペレットを再懸濁します。最後に、再懸濁した細菌培養液を3 mLずつ15 mLチューブに分注し、使用時まで-20 °Cで保存します。

このデモンストレーションでは、例として、ストレスを誘発する Xeno Duke loan が転写因子 Sskn one に及ぼす影響を測定します。Sskn one は、酸化ストレスおよび xenobi ストレス時に細胞保護遺伝子を活性化することが知られています。2つの蛍光コンストラクトを保持する Trenchgenic c gans ライン VP 5 96 の大規模培養を準備します。

VP 5 96 虫では、転写因子の活性をモニターするためにGFPを発現させるGST fourプロモーターと、虫の個体数標準化のための基準としてRFPを発現させるSskn oneおよびDOP threeプロモーターの両方が機能しています。

DOP threeはドーパミン受容体のプロモーターであり、全身のニューロンで恒常的に発現しています。この例では、ゼノバイオティクスがsskn oneを強力に活性化し、GS T fourプロモーターから発現するGFPの量を増加させることを示しています。培養の準備として、150 mLのNNGMバッファー、1.5 mLのLB、150 µLの1 Mコレステロール、および75 µLの100 mg/mLストレプトマイシンを混合します。LBを添加することで、線虫がガラス器具やプラスチック器具に付着するのを防ぐことができますが、この量では細菌の増殖を維持するには不十分です。

混合液をフィルターで滅菌し、滅菌済みの1Lフラスコに移して、GR成虫から卵を放出させるために放置します。遠心分離を行い、上清が透明になるまでNGM培地を交換して、虫体から細菌を洗浄します。さらに、滅菌水に再懸濁して遠心分離し、2回目の洗浄を行います。

上清を除去し、チューブに3.75 mLの滅菌水を満たします。家庭用漂白剤1 mLと10 N 水酸化ナトリウム250 µLを加え、すぐに5〜6回反転させて混ぜ合わせます。線虫を漂白剤に4分間さらした後、チューブをローテーターに設置します。

チューブを実体顕微鏡下に置きます。成虫のほとんどが溶解しているはずです。チューブを15〜20回激しく振り、溶解しきれなかった成虫の溶解を促進させます。溶解完了まで合計5分間経過した後、チューブがいっぱいになるまで滅菌水を加えます。

卵を回収するため、5〜6回反転させて混ぜ合わせます。チューブを500 RCFで1分間遠心分離します。卵を10 mLの滅菌水で懸濁し、遠心分離して上清を除去する洗浄操作を3回繰り返します。

次に、卵のサンプル100 µLにNGMバッファーを10 mL加え、100倍に希釈します。その後、顕微鏡下でペトリ皿の蓋に5 µLずつ3回分を分注します。3つの独立した5 µLの分注量に含まれる卵の数をカウントします。

全卵数を推定するため、NGMバッファーを入れたフラスコに200,000個から200万個の卵を加え、20 °C、100 RPMで培養液を振とうさせる。卵をフラスコに添加してから少なくとも16時間後、滅菌済みのセロロジカルピペットを用いて、懸濁させた線虫培養液を約0.5 mL分取り出す。

滅菌済みのペトリ皿の蓋の上に、5 µLの滴を3滴分ピペットで分注します。線虫を麻痺させるため、蓋を-20 °Cのフリーザーに1〜2分間置きます。線虫が麻痺した後、実体顕微鏡を用いて5 µLあたりの生存孵化線虫の平均数を計測し、総数を推定します。

以前に調製した凍結保存済みのOP 50細菌培養液をベンチ上に数分間置いて融解させます。次に、孵化した虫500,000匹あたり3 mLの50% OP 50を添加します。フラスコを20 °C、100 RPMで振盪します。

線虫は約51時間でL4幼虫および若年成虫へと成長します。培養期間中は、目視によって細菌量をモニターしてください。培地が透明になった場合は、細菌を追加してください。

滅菌済みのセロロジカルピペットを使用して、懸濁した虫培養液約0.5 millilitersを標準的なNGMアガープレートに転写します。実体顕微鏡で虫を観察し、大部分がL4幼虫および若成虫であることを確認してください。明視野顕微鏡下では、L4幼虫は体の中心に腹側透明斑（ventral clear spot）が見られます。若成虫はそれよりもわずかに大きく、透明斑はありません。

次に、虫の培養液を滅菌済みの50 milliliterチューブに分注します。チューブをフード内の試験管ラックに設置し、未孵化の卵や発育していない虫を沈殿させます。これらは、発育した虫よりもゆっくりと沈殿します。

10分後、未孵化および未発達の虫体を含む上清を吸引して取り除き、各ペレットにNGMバッファーを約10 milliliters加え、チューブを静かに回して虫体を懸濁させます。すべての虫体を1本の50 milliliterチューブに集めます。スイングバケット遠心機を用い、500 RCFで30秒間遠心分離します。

次に、洗浄のため、1% lb含有NGM 50 millilitersに虫体を再懸濁します。これを3〜4回繰り返し、洗浄後に細菌を除去します。チューブにNGMおよびLBバッファーを加え、50 millilitersまで満たします。

これをスターバレット入りの専用線虫分注フラスコに注ぎ、スターラーの上に置きます。分注フラスコと分注カセットのデッドスペースを満たすには、最低でも約20 millilitersまたは60,000匹の線虫が必要です。既述の方法に従い、5 µLの液滴3回分に含まれる線虫数をカウントします。

NGMにLBを添加し、5 µLの液滴あたり12〜15匹の濃度になるまで計数した後、84ウェルプレート1枚につき約35,000匹、または11.5 mLの虫体懸濁液が必要となります。10 µL分注カセットをディスペンサーに装着し、70%エタノールでプライミングして滅菌します。その後、滅菌水でプライミングしてエタノールを洗い流します。

分注カセットの先端を、スターバーの動きを妨げないように、スターバーの直上に位置するようにフラスコに挿入します。線虫がフラスコ全体で懸濁した状態を維持していることを確認してください。分注機を低速で分注するように設定し、2回のプリパルスでプライミングを行い、少なくとも10 millilitersの懸濁線虫を分注します。

線虫がチューブ内で沈殿するのを防ぐため、あらかじめ試験化合物を入れておいたマイクロタイタープレートに速やかに充填します。ここでは、事前にマイクロタイタープレートにロードした試験化合物を使用します。プレートを透気性テープで密封し、ウェル内に埃が混入するのを防ぎます。

プレートを、アッセイに適した温度に設定したインキュベーター内のシェイキングプラットフォームに設置します。空気の流れが妨げられる可能性があるため、プレートを重ねないでください。目的のプレートをマイクロプレートリーダーにセットし、適切な励起波長および蛍光波長を用いて各ウェルの蛍光強度を測定します。

GFPに使用するフィルターは、励起波長4 85、蛍光波長5 28です。RFPに使用するフィルターは、励起波長5 40、蛍光波長5 90です。プレートの読み取り後、GFPとRFPの比率を算出し、活性化化合物を含まないコントロールウェルの読み取り値で標準化することで、個々の処理から得られた蛍光強度の正確な倍率差を決定します。

ここで示すSSKN oneアッセイでは、染色体に統合されたデュアルレポーター株を使用し、ステレオ顕微鏡を用いて線虫を手動で計数しました。線虫の数は分注量と相関し、R二乗値は0.94、p値は0.0001未満でした。これは、分注量を調整することで、各ウェルに分注される線虫の数を制御できることを示しています。

これらの図において、左側に示されるウェルあたりの全GFP蛍光および右側に示されるウェルあたりのRFP蛍光は、384ウェルプレート全体でウェル間の再現性が非常に高い。XSは各ウェルで測定された相対蛍光強度を示す。実線は平均値を、破線は全ウェルの平均蛍光強度の上下3標準偏差を示しており、変動係数は9%以下であった。本図に示されるように、384ウェル全体で、GST 4プロモーター由来のGFP蛍光はDOP 3プロモーター由来のRFP蛍光と線形に相関しており、R squared値は0.62、p値は0.0001未満であった。

したがって、非誘導性のRFPレポーターを用いて、誘導性のGFPレポーターの標準化を行うことができます。これにより、384ウェルプレート全体のウェル間において、RFPに対するGFPの蛍光比が高く再現可能になります。

GFPとRFPの比率を算出することで、変動係数を6%以下に抑えることができ、ここに示すようにDOP threeプロモーターRFPレポーターがばらつきを低減できることが実証されました。SK N one活性化ゼノバイオティクスによるRFPに対するGFPの誘導は、384ウェルプレート全体で堅牢かつ高い再現性を示しており、すべてのコントロールウェルおよびdue GLOウェルの平均相対蛍光比は実線で示されています。コントロール平均の上限およびdlo平均の下限から3標準偏差分は破線で示されています。

一度習得すれば、線虫培養の開始は1日目に約1時間で完了し、回収と分注にかかる時間は、適切に行えば約2時間で完了します。本手順を実施する際は、少なくとも60,000匹の線虫から開始し、分注中は線虫を懸濁状態に保つことが重要です。本手順に従ってスクリーニングを行うことで、例えば他の誘導性経路のレポーター系統を用いて、開発後の他の経路に対するモジュレーターの開発を行うことが可能です。

この手法は、ハイスループットスクリーニングやバイオセンシングの分野の研究者が、低分子経路モジュレーターを迅速に特定したり、環境汚染物質を検出したりするための道を開くものです。このビデオを視聴することで、誘導性転写経路のハイスループットスクリーニングや、環境汚染物質の複数サンプル試験のために、蛍光標識されたC. elegans株をどのように培養し、分注し、測定するかについて十分に理解できるはずです。