蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

液体ベースの培養および調剤のための手順

このビデオでは、化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングや環境汚染物質の検出のために、特定のタンパク質活性に対する化学剤または環境剤の影響を評価するために、CL gansの蛍光株を培養および分注する方法を示しています。CL elganでは、まず細菌培養物が線虫の餌として調製され、GFPトランスジェニックが調製されます。同期したワームを培養します。

その後、50万から200万匹のワームが収集され、洗浄され、3 84に分配されます。マイクロタイタープレートをウェルにすると、化学ライブラリーや水、食物、土壌などの試験サンプルからの小分子が線虫に加えられます。最後に、線虫の蛍光をマイクロプレートリーダーで測定します。

蛍光強度のデータ解析により、誘導性転写経路を調節する小分子や、環境汚染物質の検出を可能にする小分子が明らかになります。この手法は、in vitroや細胞培養ベースのアッセイなどの既存の方法と比較した場合の主な利点として、in vivoで毒性のある化合物や不活性な化合物に時間を浪費しないことです。このハイスループット法は、多様な誘導性経路を調節する低分子を同定するのに役立ちます。

この方法は、低分子ライブラリーのハイスループットスクリーニング用に開発されましたが、食品や環境サンプル中の汚染物質のバイオセンシングにも適用できます。手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるAndrew Dineと、私の研究室のポスドクであるQロングです。バクテリアワームフードを事前に準備してください。

まず、500ミリリットルの素晴らしいブロスを接種し、ストレプトマイシン1ミリリットルあたり50マイクログラムに5ミリリットルの飽和大腸菌を補給します。OP50。培養物をシェーカーに置き、摂氏37度で一晩成長させます。

翌日、培養物を10本の50ミリリットルチューブに分割します。次に、チューブを冷蔵遠心分離機に入れ、2, 500 RCFで20分間回転させます。Resusをスピンした後、各細菌ペレットを10ミリリットルの液体線虫増殖培地またはNGMに懸濁します。

サスペンションを水平に振ってください。バクテリアを再懸濁するために15分間床シェーカー。次に、細菌培養物を摂氏4度で2,500RCFで20分間遠心分離します。

NGMをデカントし、バクテリアペレットを秤量します。次に、等量のNGMバッファーを添加し、ボルテックスによりペレットを再懸濁します。最後に、再懸濁した細菌培養物の3ミリリットルを15ミリリットルのチューブに分注し、必要になるまで摂氏マイナス20度で保存します。

本実証では、一例としてXeno Dukeの借用金を誘導するストレスが転写因子Sskn oneに及ぼす影響を測定する。Sskn oneは、酸化ストレスおよび異種ストレス時に細胞保護遺伝子を活性化することが知られています。2つの蛍光コンストラクトを運ぶTrenchgenic c gansラインVP 5 96の大規模培養物が調製されます。

VP 5 96線虫は、GFPを駆動するGST 4プロモーターの両方を発現し、これは転写因子の活性を監視するために使用されます。Sskn 1とDOP 3プロモーターの運転。RFPは、ワーム番号の正規化の標準として使用されます。

DOP 3はドーパミン受容体のプロモーターであり、全身のニューロンで構成的に発現しています。実施例において、ゼノビロンがsskn 1を強く活性化し、GS Tから発現するGFPの量を増加させる4つのプロモーターを調製し、150ミリリットルのN NGM緩衝液、1.5ミリリットルのLB150、1マイクロリットルの1モルコレステロールおよび75マイクロリットルの100ミリグラム/ミリリットルを組み合わせることによって培養を開始する。ストレプトマイシン。LBを追加すると、ワームがガラス製品やプラスチック製品に付着するのを防ぐのに役立ちますが、この量では細菌の増殖をサポートするのに十分ではありません。

混合物を滅菌するためにろ過し、次にそれを滅菌された1リットルのフラスコに移し、フラスコを脇に置いてGR成虫から卵を放出します。ワームを遠心分離し、むし酸が透明になるまでNGM培地を交換して、ワームから細菌を洗い流します。Resusがスピン後に再び滅菌水遠心分離機にワームを懸濁することにより、ワームを2回目に洗浄します。

仰臥位を取り外し、チューブに3.75ミリリットルの滅菌水を入れます。家庭用漂白剤1ミリリットルと250マイクロリットルの10個の正常水酸化ナトリウムを5〜6回反転してすぐに混合します。ワームを漂白剤に4分間さらした後、チューブをローテーターに入れます。

チューブを実体顕微鏡の下に置きます。大半の大人は嘘であるべきです。溶解が起こった後に残っている成虫を助けるためにチューブを15〜20回激しく振って、合計5分間、チューブがいっぱいになるまで滅菌水を追加します。

5〜6回反転させて混ぜて卵を集めます。チューブを500 RCFで1分間遠心分離します。Resusで卵を3回洗い、10ミリリットルの滅菌水で卵を曲げ、回転させて仰臥位を取り除きます。

次に、卵の100マイクロリットルのサンプルを100ミリリットルのNGMバッファーを加えて100倍に希釈します。次に、5マイクロリットルのアリコート3つを顕微鏡下のシャーレの蓋にピペットで移します。3つの別々の5マイクロリットルのアリコートで卵の数を数えます。

卵の総数を推定します。NGMバッファーを含むフラスコに200,000〜200万個の卵を加え、20°Cで100RPMで培養物を振とうします。卵がフラスコに追加されてから少なくとも16時間後に、滅菌血清学的ピペットを使用して、懸濁したワーム培養物の約0.5ミリリットルを除去します。

5マイクロリットルの滴を3滴、ペトリ皿の滅菌蓋にピペットで移します。蓋をマイナス20度の冷凍庫に1〜2分間入れて、ワームが麻痺したらワームを麻痺させます。実体顕微鏡で5マイクロリットルあたりの生きた孵化したワームの平均数を数え、総数を推定します。

以前に調製した冷凍OP50細菌培養物をベンチに数分間置いて解凍します。次に、500, 000匹の孵化したワームあたり50%OP 50の3ミリリットルを追加します。フラスコを摂氏20度で100RPM振ってください。

ワームは約51時間でL型の幼虫と若い成虫の段階に成長します。目視検査により、インキュベーション中の細菌の量を監視します。培地が透明になったら、バクテリアを追加します。

滅菌血清ピペットを使用して、懸濁した線虫培養物の約0.5ミリリットルを標準的なNGM寒天プレートに移します。実体顕微鏡でワームを見て、ほとんどがL4幼虫であり、明視野顕微鏡下で若年成人であることを確認すると、L4幼虫は体の中央に腹側に明確なスポットがあります。若年成人は少し大きくなり、明確なスポットがありません。

次に、ワーム培養物を滅菌済みの50ミリリットルチューブに引き込みます。チューブをフードの試験管ラックに入れ、孵化していない卵や発生しないワームを定着させます。発達したワームよりもゆっくりと落ち着きます。

10分後、孵化していない未発達の線虫を含むsupinateを、各ペレットに約10ミリリットルのNGM緩衝液で吸引して取り出し、チューブを静かに渦巻かせて線虫を懸濁します。すべてのワームを1本の50ミリリットルのチューブに集めます。スイングバケット遠心分離機で500 RCFで30秒間回転します。

次に、ワームを50ミリリットルのNGMに1%lbで再懸濁して洗浄します。これを繰り返し、洗った後に3〜4回洗ってバクテリアを取り除きます。NGMとLBバッファーをチューブに50ミリリットル充填します。

これを攪拌器でカスタムワームディスペンシングフラスコに注ぎ、攪拌プレートに置きます。分注フラスコとディスペンサーカセットのデッドスペースを埋めるには、最低約20ミリリットルまたは60,000ワームが必要です。前に示したように、3つの5マイクロリットルの滴でワームの数を数えます。

NGMとLBで5マイクロリットルのドロップあたり12〜15ワームの濃度にカウントした後、各3 84ウェルプレートには約35,000匹のワームまたは11.5ミリリットルの懸濁ワームが必要です。10マイクロリットルのディスペンシングカセットをディスペンサーにロードし、70%エタノールでプライミングして滅菌します。滅菌水でプライミングしてエタノールを洗い流します。

分注カセットの端をフラスコに挿入し、攪拌バーの動きを妨げないように、フラスコのすぐ上にくるようにします。ワームがフラスコ全体に浮遊していることを確認してください。ディスペンサーをプログラムして、2つのプレパルスで低速でワームを分配し、少なくとも10ミリリットルの懸濁ワームを実行します。

線虫がチューブに沈殿するのを防ぐために、すでに試験化合物が急速に含まれているはずのマイクロタイタープレートを充填します。ここでは、以前にマイクロタイタープレートにロードされた試験化合物が期限となります。匂う。プレートを通気性のあるテープで密封して、ほこりがウェルに溜まるのを防ぎます。

プレートをインキュベーター内の振とうプラットフォームに置き、アッセイに適した温度にします。プレートを積み重ねると、空気の流れが制限される可能性があります。ターゲットプレートをマイクロプレートリーダーにセットし、ここで適切な発光波長と励起波長で各ウェルの蛍光強度を測定します。

GFPに使用されるフィルターは、励起が4 85、蛍光が5 28です。RFPのフィルターは、5 40で励起され、5 90で発光されます。プレートを読み取りた後、GFPとRFPの比率を計算し、活性化化合物を含まないコントロールウェルの読み取り値と正規化して、個々の処理から得られる蛍光強度の正確な倍率差を決定します。

ここに示すSSKN oneアッセイは、染色体統合デュアルレポート、つまり実体顕微鏡で線虫を手動でカウントしたときの株を使用しています。線虫の数は、R 二乗値が 0.94、p 値が 0.0001 未満の場合、分配された量と相関していました。これは、各ウェルに分注されるワームの数が、分注される量を調整することによって制御できることを示しています。

これらの図では、左のウェルあたりの総GFP蛍光と右のウェルあたりのRFP蛍光は、3 84ウェルプレート全体でウェル間で非常に再現性が高くなっています。XSは、各ウェルで測定された相対蛍光を示します。実線は平均を示し、破線はすべてのウェルの平均蛍光より上または下の3つの標準偏差を示し、変動係数が9%未満であったこの図に示すように、GST 4プロモーターからのGFP蛍光は、R二乗値が0.62、p値が0.0001未満の3 84ウェルにわたってDOP 3プロモーターからのRFP蛍光と線形に相関しています。

したがって、非誘導性RFPレポーターを使用して、誘導性を正規化することができる。GFPレポーター。GFPとRFPの比率を発現すると、蛍光は3 84ウェルプレート全体でウェル間で高い再現性が得られます。

GFPとRFPの比率を計算すると、変動係数が6%未満に減少し、ここに示すように、DOP 3つのプロモーターRFPレポーターが変動性を低減する能力を示しています。SK N one activating xeno biotic による RFP に対する GFP の誘導は、3 84 ウェルプレート全体で堅牢で再現性が高く、すべてのコントロールウェルとdue GLO ウェルの平均相対蛍光比は実線でマークされています。制御平均より上とdlo平均より下の3つの標準偏差は、破線でマークされています。

一度習得すれば、ワーム培養の開始は初日から約1時間で完了し、収集と分注を行うことができます。ワームは、適切に行えば約2時間で行うことができます。この手順を試みることは、少なくとも60, 000ワームから開始し、分配中にそれらを懸濁させておくことを覚えておくことが重要ですが、この手順の画面に従って、他の誘導性経路のレポート文字列を他の誘導性経路のレポート文字列は、その開発後に他の経路のモジュレーターを開発するために実行できます。

この技術は、ハイスループットスクリーニングやバイオセンシングの分野の研究者が、低分子経路モジュレーターを迅速に特定したり、環境汚染物質を検出したりするための道を開く可能性があります。このビデオを見れば、誘導性転写経路のハイスループットスクリーニングや、複数のサンプルの環境汚染物質の試験のための蛍光エレガン株の培養、分注、測定の方法について十分に理解できるはずです。