マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

この方法論の全体的な目標は、単一のハイスループットスクリーニングシステムを使用して複数の酵素を評価することです。この方法は、メタゲノムスクリーニングと酵素工学に関する微生物および生物工学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。私たちは、フェニレン化合物に応答するMPL変異体と、その下流のGFPレポーターからなる遺伝子酵素スクリーニングシステムを開発しました。

任意のメタゲノム遺伝子が、提供された基質と反応することにより、我々の目的の酵素活性を示すと、反応生成物のフェニレン化合物がDmp変異体を活性化し、蛍光計で容易に捕捉できるGFPレポーターの発現を誘発する。この手法の主な利点は、従来のスクリーニング技術とは異なり、この単一の方法が適切な基質を使用して複数の種類の異なる酵素をスクリーニングするために適用できることです。この手順を実演するのは、私たちの研究室の大学院生であるKil Koang Kwonです。

ホスミドライブラリー作製キットを用いて、ホスミドベクターを用いて大腸菌にメタゲノムライブラリーを構築した後、pGESS(E135K)DNAをメタゲノムライブラリー細胞に輸送します。次に、形質転換されたライブラリ細胞を摂氏マイナス70度、20マイクロリットルのアリコートで保存します。偽陽性を除去するには、まずメタゲノムライブラリー細胞分注を氷上で解凍します。

次に、解凍した細胞の10マイクロリットルを、アンピシリンとクロラムフェニコールを含む2ミリリットルのリソゲン酸ブロスに、摂氏37度、200RPMの14ミリリットルの丸底チューブに4時間接種します。その間、デフォルトのFACSソフトウェアでメタゲノムライブラリ細胞を読み取るためのFACSマシン上で適切なパラメータを設定します。インキュベーションの終わりに、5マイクロリットルの細胞を5ミリリットルの丸底チューブで1ミリリットルのPBSに移します。

次に、希釈したライブラリサンプルをロードし、イベントレートを毎秒1000〜1500イベントに調整します。グローバルワークシートで対数スケーリングの前方散布図と対数スケーリングの辺散乱面積散布図を生成するには、ドットプロットを作成し、細菌集団を含むシングレットイベントの周囲にポリゴンゲートを描画します。セル数と対数スケーリングの FITC エリア ヒストグラムをプロットするには、ヒストグラムを開き、釣鐘型分布のピークが FITC エリアの 2 に対して 10 未満になるように FITC 電圧を調整します。

次に、別のドットプロットを開いて、対数スケールの前方散布図と対数FITC面積のプロットを作成し、分布の中心からセルのプラス5パーセントからマイナス5パーセントの間にR2ソーティングゲートを設定します。すべてのゲートを設定したら、1.2ミリリットルの抗生物質添加リゾゲン酸ブロスを含むコレクションチューブをFACS装置出口に置き、ゲート付き細胞の10倍から6倍をブロスに選別します。ソートの最後に、コレクションチューブにキャップをし、細胞を穏やかにボルテックスします。

目的のメタゲノム酵素をスクリーニングするには、選別した細胞を摂氏37度、200RPMでOD600が0.5に達するまでインキュベートし、その後、1マイクロリットルのコピー誘導溶液を添加して細胞内フォスミドコピー数を増幅します。摂氏37度と250RPMで3時間後、0.5ミリリットルの細胞と適切な基質を14ミリリットルの丸底チューブに組み合わせて、最終濃度を100マイクロモルにします。次に、コントロールサンプルと実験サンプルを摂氏37度、200RPMでさらに3時間インキュベー

サンプルが振とれている間に、先ほど示したようにFACSマシンパラメータを設定します。次に、各サンプルから5マイクロリットルの細胞を、1ミリリットルのPBSを含む個々の5ミリリットルの丸底チューブに加えます。次に、サンプルセルをロードし、イベントレートを毎秒1000〜3000イベントに設定します。

対数スケールの前方散乱領域と対数スケールの側散乱領域の散布図を作成し、一重項イベントの細菌細胞を包含するようにR1散布ゲートを調整します。次に、対数スケールの前方散布図と対数スケールのFITCエリア散布図を作成し、ネガティブセルの0.1%未満が検出されるようにR2ソートゲートを設定します。次に、サンプルチューブをロードし、必要に応じてイベントレートを毎秒1000〜3000イベントに再調整します。

次に、0.5ミリリットルのリゾゲン酸ブロスを含む収集チューブをFACS装置出口に配置し、R1およびR2ゲート内の細胞の1倍10〜4倍を収集します。すべての細胞が単離されたら、収集チューブにキャップをし、細胞を穏やかにボルテックスします。次に、採取したサンプルの0.5ミリリットルを、抗生物質を添加したリソゲン酸ブロスが入った90mmの寒天プレート2枚に広げ、プレートを37°Cで一晩インキュベー

この図では、ネガティブソーティングによる偽陽性の除去と、R1およびR2ソーティングゲートを使用したポジティブヒット選択を含む、実証されたスクリーニングプロトコルが示されています。その後、基質がある場合とない場合のサンプル蛍光を比較することにより、ヒットを評価できます。この代表的なp-ニトロフリーアセテートを介したスクリーニングでは、基質処理細胞の蛍光は対照細胞の蛍光よりも高く、この実験で5つのリパーゼ候補が確認されました。

これら3つのセルロース候補は広く分布しているにもかかわらず、集団の平均FITC強度には明らかな違いが観察されます。これらの4つのホスファターゼ候補は、対照細胞と比較して高い蛍光レベルも示しています。さらに、ORF挿入ベクターのアルカリホスファターゼ活性は、フローサイトメトリーによって確認でき、空のプラスミドを運ぶ細胞よりもヒットした酵素に対して観察される蛍光シグナルが強い

この手法は、適切な基質と配給濃度を選択することで、幅広い酵素のスクリーニングに適用できることを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、次世代シーケンシングなどの他の方法を実行して、酵素候補の同定と特性評価に関する追加の質問にハイスループットで答えることができます。開発後、このハイスループット酵素スクリーニング技術は、酵素工学の分野の研究者が酵素特異性を必要とせずにさまざまなメタゲノム酵素を探索する道を開きました。

このビデオを見れば、幅広い酵素ターゲットを用いたメトジェニック回路ベースのハイスループットスクリーニングシステムの使用方法を十分に理解できるはずです。