高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

この方法は、さまざまな病原性因子の重要性や、低分子が起源を改善する能力など、宿主病原体の相互作用と創薬における疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、少量の液体形式で行われることです。まず、BSL 2バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、凍結ストックから緑膿菌をLB寒天プレートにストリークします。

プレートを37°Cで16〜24時間インキュベートし、その後、プレートを摂氏4度で最大1週間保存します。アッセイプレートをセットする2日前に、プレートから1つのコロニーを使用して、3〜5ミリリットルの滅菌LBブロスを接種します。培養物を摂氏37度で12〜16時間インキュベー

テキストプロトコルに従ってスローキルまたはSK培地を調製した後、新鮮な一晩のLB培養物から350ミリリットルの緑膿菌で、各10センチメートルのSKプレートに播種する。滅菌細菌スプレッダーを使用して細菌を均一に広げ、プレートをバイオセーフティキャビネットで乾燥させます。

その後、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。24ウェルディープウェルプレートの1つのウェルで複数のRNAi細菌株を並行して試験するには、以前に調製したRNAi含有細菌の各クローンから1つのコロニーを4ミリリットルのカルベニシリン添加LBに接種します。プレートをマルチウェルプレート用に最適化された振とうインキュベーターに摂氏37度、950rpmで16時間入れ、次いで2, 000gで5分間遠心分離して細菌を回収する。プレートを反転させ、激しく振ることにより、上清をデカントします。

100マイクロリットルのS基底を使用して、RNAi細菌を再懸濁します。再懸濁した細菌を、IPTGおよびカルベニシリンを添加したマルチウェルNGMプレートの適切な数のウェルにピペットで移し、プレートを乾燥させます。テキストプロトコルに従ってL1ワームを調製した後、RNAiまたはOP50スーパーフードを播種した10センチメートルプレートあたり約5, 000ワームをピペッティングして、基本実験用のプレートを準備します。

RNAiスクリーニング用にセットアップするには、RNAiを播種した24ウェルプレートでウェルあたり約300匹の線虫をピペットで泳ぎます。使用している系統が温度滅菌されている場合は、線虫を摂氏15度で約16時間インキュベートした後、摂氏25度に44時間移して発生を完了し、胚形成を防ぎます。液体殺傷アッセイを実施するには、セルスクレーパーを使用してSKプレートから緑膿菌を除去し、細菌を約5ミリリットルのS.Basalに再懸濁します。

分光光度計を使用して、細菌懸濁液のOD600を測定します。S.BasalにP.Aeruginosaの希釈ストック24ミリリットルをOD600で09に調製し、次に21ミリリットルの液体SK培地を追加し、マルチチャンネルピペットを使用して、45マイクロリットルの細菌と培地を384ウェルプレートの各ウェルに移します。ワームをその発生源から50ミリリットルの円錐形のチューブに洗い流し、重力の下で落ち着くのを待ちます。

上清を5ミリリットルに吸引し、次に合計50ミリリットルのS.Basalを使用してワームを再懸濁し、さらに2回洗浄を繰り返します。.ワームソーターを使用して、テキストプロトコルに従って約22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別し、ガス透過性フィルムを使用してプレートをシールし、摂氏25度で24〜48時間インキュベートします。必要な時間に、マイクロプレートウォッシャーとS.Basalを使用して、384ウェルプレートを合計5回洗浄します。

最も簡単な間違いの1つは、ワームが完全に落ち着く前に384ウェルプレートを吸引することです。ワームが完全に定着したかどうかを正確に確認するには、練習が必要です。最終洗浄後、上清を20マイクロリットルまで吸引します。

次に、ウェルあたり50マイクロリットルの98マイクロモル核酸染色剤を添加し、最終濃度を0.7マイクロモルにします。プレートを室温で12〜16時間インキュベートします。希望のインキュベーション期間が経過したら、マイクロプレートウォッシャーを使用してプレートを最低3回洗浄します。

データ取得には、分光光度計または自動顕微鏡を使用して、透過光と蛍光の両方を画像化します。ウェルあたり300匹のワームを含む24ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルのS基礎液を追加します。プレートを振ってワームを静かに攪拌し、次にワームを空の滅菌済み24ディープウェルプレートに移します。

ワームが重力で約5分間落ち着くのを待ちます。上清を吸引し、ウェルごとに約1ミリリットルを残し、次に各ウェルに7ミリリットルのS基礎を追加します。洗浄をさらに2回繰り返し、最終洗浄後に約400マイクロリットルの上清を除くすべてを吸引します。.

飢餓を避けるために細菌を384ウェルプレートにピペッティングした後、ワームソーターのリサンプラー機能を使用して、22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別します。最後に、選別に続いて、低分子または他の実験用材料を追加します。このグラフに示されているように、このビデオで概説されている手順に従うと、C.elegansの時間依存的な殺傷は、P.aeruginosaの存在下でのみ観察されます。

対照的に、主要な細菌性栄養補助食品がない場合、殺傷はほとんどまたはまったく観察されません。ここに示すように、緑膿菌の37°Cと25°Cの2段階のインキュベーションは、従来のスローキルアッセイに重要であり、もともと液体殺傷で実施されていましたが、このアッセイでは不要です。このプロトコルは、OD 600から0025までの低さから、幅広い初期細菌濃度を許容し、タイミングがずれるものの、時間と濃度に依存する殺傷を示します。

さらに、統計的に有意なデータを取得するには、多くの場合、わずか 4 つのウェルで十分です。この例のように、信号対雑音比が高い場合の処理の有用性の例を次に示します。これは、分析が簡単で、正の条件と負の条件の区別が簡単です。このような場合、弱いヒットでも簡単に識別できます。

習得すると、このテクニックは、ソーティングを含まない384ウェルプレートあたり約60〜75分のハンズオン時間で実行できます。この手順を試行する間は、メディアにすべてのコンポーネントを追加すると、毒性が損なわれることを覚えておくことが重要です。このアッセイは、全生物表現型に基づくスクリーニングを宿主病原体研究における創薬への適用を簡素化します。

このビデオを見れば、液体ベースのCエレガンス病因アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この手順は、P.AeruginosaをE.Faecalisなどの他の病原体に置き換えることで変更でき、他の細菌感染症の治療法の検索を容易にします。P.AeruginosaやE.Faecalisのような感染性細菌を扱うことは危険な場合があることを忘れないでください。

この手順を実行する際には、適切なトレーニング、適切な個人用保護具、適切な技術などの適切な予防措置を常に講じる必要があります。