Name: 高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶ液体ベースのC. elegans病原性アッセイで、P. aeruginosaを用いた宿主・病原体相互作用と創薬研究を行う方法。小容量の液体フォーマットにより高スループットスクリーニングが可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、がんの予防およびテキサスの研究所 (CPRIT) 賞 RR150044、ウェルチ財団研究助成金 C-1930 年、国立機関の健康 K22 AI110552 NVK に授与、支えられました。資金提供者には、研究デザイン、データ収集と分析、意思決定を発行し、または原稿の準備の役割はなかった。

<ol><li>Falagas, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Klebsiella+pneumoniae%2C+Pseudomonas+aeruginosa+and+Acinetobacter+baumannii+infections%3A+Characteristics+and+outcome+in+a+series+of+28+patients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii infections: Characteristics and outcome in a series of 28 patients.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 32 (5), 450-454 (2008).</li>
<li>Hsueh, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Acinetobacter+baumannii+causing+nosocomial+infections+in+a+university+hospital%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Acinetobacter baumannii causing nosocomial infections in a university hospital, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (8), 827-832 (2002).</li>
<li>Wang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pandrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+among+hospitalised+patients%3A+clinical+features%2C+risk-factors+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Pandrug-resistant Pseudomonas aeruginosa among hospitalised patients: clinical features, risk-factors and outcomes.</a> Clinical Microbiology and Infection. 12 (1), 63-68 (2006).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Draft+genome+sequences+of+pandrug-resistant+Serratia+marcescens+clinical+isolates+harboring+blaNDM-1%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Announcements%22%5BJournal%5D)">Draft genome sequences of pandrug-resistant Serratia marcescens clinical isolates harboring blaNDM-1.</a> Genome Announcements. 5 (3), (2017).</li>
<li>Utari, P. D., Quax, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reveals+novel+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reveals novel Pseudomonas aeruginosa virulence mechanism.</a> Trends in Microbiology. 21 (7), 315-316 (2013).</li>
<li>Conery, A. L., Larkins-Ford, J., Ausubel, F. M., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+for+novel+anti-infectives+using+a+C.+elegans+pathogenesis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening for novel anti-infectives using a C. elegans pathogenesis model.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 6 (1), 25-37 (2014).</li>
<li>Kirienko, N. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+disrupts+Caenorhabditis+elegans+iron+homeostasis%2C+causing+a+hypoxic+response+and+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa disrupts Caenorhabditis elegans iron homeostasis, causing a hypoxic response and death.</a> Cell Host & Microbe. 13 (4), 406-416 (2013).</li>
<li>Kirienko, D. R., Revtovich, A. V., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content%2C+phenotypic+screen+identifies+fluorouridine+as+an+inhibitor+of+pyoverdine+biosynthesis+and+pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">A high-content, phenotypic screen identifies fluorouridine as an inhibitor of pyoverdine biosynthesis and pseudomonas aeruginosa virulence.</a> mSphere. 1 (4), (2016).</li>
<li>Manning, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+content+microscopy+assay+to+determine+drug+activity+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A high content microscopy assay to determine drug activity against intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> Methods. 127, 3-11 (2017).</li>
<li>Marwaha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-acylated+derivatives+of+sulfamethoxazole+and+sulfafurazole+inhibit+intracellular+growth+of+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">N-acylated derivatives of sulfamethoxazole and sulfafurazole inhibit intracellular growth of Chlamydia trachomatis.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (5), 2968-2971 (2014).</li>
<li>Kota, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+high-content+imaging+and+chemical+genetics+to+probe+host+cellular+pathways+critical+for+Yersinia+pestis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrating high-content imaging and chemical genetics to probe host cellular pathways critical for Yersinia pestis infection.</a> PLoS One. 8 (1), e55167(2013).</li>
<li>Arif, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+cell+infection+caused+by+Listeria+monocytogenes+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of cell infection caused by Listeria monocytogenes invasion.</a> Journal of Biotechnology. 154 (1), 76-83 (2011).</li>
<li>Jayamani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+Francisella+tularensis-Caenorhabditis+elegans+pathosystem+for+the+evaluation+of+therapeutic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of a Francisella tularensis-Caenorhabditis elegans pathosystem for the evaluation of therapeutic compounds.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (9), (2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screen+for+novel+antimicrobials+using+a+whole+animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput screen for novel antimicrobials using a whole animal infection model.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 527-533 (2009).</li>
<li>Rajamuthiah, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+automated+platform+for+drug+discovery+against+multi-drug+resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Whole animal automated platform for drug discovery against multi-drug resistant Staphylococcus aureus.</a> PLoS One. 9 (2), e89189(2014).</li>
<li>Breger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+chemical+compounds+identified+using+a+C.+elegans+pathogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Antifungal chemical compounds identified using a C. elegans pathogenicity assay.</a> PLoS Pathogens. 3 (2), e18(2007).</li>
<li>Garvis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+semi-automated+liquid+screen+reveals+a+specialized+role+for+the+chemotaxis+gene+cheB2+in+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans semi-automated liquid screen reveals a specialized role for the chemotaxis gene cheB2 in Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), e1000540(2009).</li>
<li>Zhou, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+and+novel+screening+model+for+assessing+the+bioactivity+of+extracts+against+multidrug-resistant+Pseudomonas+aeruginosa+using+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient and novel screening model for assessing the bioactivity of extracts against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa using Caenorhabditis elegans.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 75 (9), 1746-1751 (2011).</li>
<li>Leung, C. K., Deonarine, A., Strange, K., Choe, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+and+biosensing+with+fluorescent+C.+elegans+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening and biosensing with fluorescent C. elegans strains.</a> Journal of Visual Experiments. (51), (2011).</li>
<li>Kirienko, N. V., Ausubel, F. M., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitophagy+confers+resistance+to+siderophore-mediated+killing+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mitophagy confers resistance to siderophore-mediated killing by Pseudomonas aeruginosa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1821-1826 (2015).</li>
<li>Kirienko, N. V., Cezairliyan, B. O., Ausubel, F. M., Powell, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+PA14+pathogenesis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa PA14 pathogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 1149, 653-669 (2014).</li>
<li>Kang, D., Kirienko, D. R., Webster, P., Fisher, A. L., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyoverdine%2C+a+siderophore+from+Pseudomonas+aeruginosa%2C+translocates+into+C.+elegans%2C+removes+iron%2C+and+activates+a+distinct+host+response%5BTitle%5D)+AND+%22Virulence%22%5BJournal%5D)">Pyoverdine, a siderophore from Pseudomonas aeruginosa, translocates into C. elegans, removes iron, and activates a distinct host response.</a> Virulence. , 1-41 (2018).</li>
<li>Garsin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+C.+elegans+daf-2+mutants+are+resistant+to+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-lived C. elegans daf-2 mutants are resistant to bacterial pathogens.</a> Science. 300 (5627), 1921(2003).</li>
<li>Estes, K. A., Dunbar, T. L., Powell, J. R., Ausubel, F. M., Troemel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bZIP+transcription+factor+zip-2+mediates+an+early+response+to+Pseudomonas+aeruginosa+infection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">bZIP transcription factor zip-2 mediates an early response to Pseudomonas aeruginosa infection in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (5), 2153-2158 (2010).</li>
<li>Tjahjono, E., Kirienko, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+mitochondrial+surveillance+pathway+is+required+for+defense+against+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A conserved mitochondrial surveillance pathway is required for defense against Pseudomonas aeruginosa.</a> PLoS Genetics. 13 (6), e1006876(2017).</li>
<li>Moy, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+antimicrobials+using+a+live-animal+infection+model%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of novel antimicrobials using a live-animal infection model.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (27), 10414-10419 (2006).</li>
<li>Henderson, S. T., Bonafe, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-16+protects+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+during+food+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology.+Series+A%2C+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">daf-16 protects the nematode Caenorhabditis elegans during food deprivation.</a> The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (5), 444-460 (2006).</li>
<li>Beanan, M. J., Strome, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+germ-line+proliferation+mutation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterization of a germ-line proliferation mutation in C. elegans.</a> Development. 116 (3), 755-766 (1992).</li>
</ol>

著者は、明らかに利益相反があるないことを宣言します。

この試金 (または他の病原体が膿や腸球菌の代わりに使用と同様の試金)、様々 な創の目的に役立ちます。また、特定病原因子、ホストの防衛の経路の解明と宿主-病原体相互作用に関わる規制機械を決定するなどの基本的な生物学的問題に対処するため便利です。
膿液殺害アッセイは、堅牢な失敗の可能性を最小限に抑えるための細心の注意の支払われる、いくつかのポイントがあります。まず、前述のように、細菌は LB で一晩成長にもかかわらず、病原性を失うしないように膿予防接種のため細菌ソース プレートは、新鮮ななりません。第二に、カルシウムとマグネシウムが膿の試金を殺すに追加されていることを確認するキーであります。それがなければ、病原性が著しく低下します。最後に、それは HT115 (RNAi に基づく試金) の飼育ワームはワーム飼育 OP50 以降大幅死んでしまうことは注目に値する (N. キリエンコ、パーソナル通信)。このため、RNAi ベースの研究に切り替える場合は、経験的に試金のための最高の時間ポイントを判断する...

身分証明書と有効な広域スペクトル抗生物質の開発今ほぼ世紀前に、公衆衛生における重要な分岐点につながった病気は過去の惨劇になる感染が広まった信念があった。いくつかの短い十年以内この楽天主義は病原体病原体がこれらの一度奇跡的な治療法が限られて抵抗機構を開発した後として、衰え始めた。いくつかの時間のため、薬剤の発見の努力と病原体の間の軍拡はバランスの取れたように見えた。しかし、抗菌薬の誤用は最近肺炎桿菌、アシネトバクター属 baumanii、セラチア、および膿1、パン薬剤耐性菌の出現に結実して 2,3,4。
膿は、人免疫不全状態、または嚢胞性線維症のある重症の熱傷患者へ深刻な脅威である日和見のグラム陰性、マルチホスト菌です。それはまたますます特に抗菌薬耐性の継続的な買収のための深刻な院内感染の原因となるエージェントとして識別されます。この脅威に対処するには、我々 は、定評のc. の elegans-膿感染システム5を使用しています。私たちの研究室6ホストを殺すために病原体の能力を制限する新規化合物を識別するために液体ベース、高スループット、高コンテンツ スクリーニング プラットフォームを開発するこのシステムが活用されています。興味深いことに, これらの化合物は抗菌剤7および病原性阻害剤8を含む少なくとも 3 つの一般的なカテゴリに属しているようです。線虫c.エレガンス他高コンテンツ薬物検出アッセイ結核菌 tuberculosum、クラミジア ・ トラコマチス、仮性結核菌、リステリア菌、野兎病菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ ・ アルビカンス、報告されていると腸球菌、他の中で9,10、11,12,13,14,,1516。これらの種類のアッセイのホストと病原体、化学画面とを超えてヒットを識別する能力に比べてバイオアベイラビリティの可能性の増大に有毒かもしれない誤検出の制限など、いくつかのよく知られている利点があります。単に反 virulents、免疫促進分子、またはそれ以外の場合前者を支持して宿主-病原体相互作用のバランスを傾ける化合物など、微生物の増殖を制限すること。さらに、これらの画面で発見された化合物は、哺乳類のホストで効果的。
それは、少なくとも 2 つ他の試金17,18が液体にc. の elegansの高スループット画面を実行する使用できることは注目に値するです。しかし、これらのアッセイのそれぞれは液体で実行する遅い殺害として知られている、典型的な腸の植民地化アッセイができる変更のスループットが向上しより容易に選別する化合物。慎重に評価は決定的な細菌の病原性のメカニズムがこれらの試金および液体ベースのスクリーン7間で異なっていることを示しています。病原性の両方のタイプは、哺乳類システムで観察される、ので、アッセイの選択前に実験者の利益に最も関連するどの病原性を規定を検討することが重要です。
液体ベースの最適化されたバージョンを示すC. elegans P. 緑膿菌の試金。グラム陽性の細菌の病原体に対応する液体を用いた測定手法の適応を述べる腸球菌。膿のようなe. フェカリスますます深刻な院内の脅威として抗菌薬耐性経路1の成長している兵器で識別されます。腸球菌の高速スクリーニング法の前に14が存在する病原体は、手順が複雑になりますし、COPAS FlowSort のような機器に汚染の可能性が高くなると preinfection が必要です。提案プロトコルの安全性プロファイルを改善、感染前の必要があります。最後に、これらのアッセイのいずれかは、確立の役割を果たすホストの要因を検索するユーザーを許可する RNAi や感染に対する抵抗性を餌と併用できる手段を報告します。

<table><tbody><tr><td>COPAS FP BioSorter</td><td>Union Biometrica</td><td></td><td>ラージオブジェクトフローサイトメーター/ワームソーター</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EL406 ウォッシャーディスペンサー</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 ディープウェル RB ブロック</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>CS15124</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルプレート</td><td>GreinerBio-One</td><td>MPG-781091</td><td></td></tr><tr><td>線虫増殖培地(NGM)</td><td></td><td></td><td>1リットルあたりの量:18グラムの寒天、3グラムのNaCl、2.5グラムのペプトン、1 mLのCaCl<サブ>2</サブ>(1 M)、1 mLのMgSO<サブ>4</サブ>(1 M)、25 mLのホスペイトバッファー、および973 mLのMilli-Qウォーター</td></tr><tr><td>スローキリング(SK)プレート</td><td></td><td></td><td>1リットルあたりの量:18グラムの寒天、3グラムのNaCl、3.5グラムのペプトン、1 mLのCaCl<サブ>2</サブ>(1 M)、1 mLのMgSO<サブ>4</サブ>(1 M)、25 mLのホスペイト緩衝液、および973 mLのミリQ水</td></tr><tr><td>スローキリング(SK)メディア</td><td></td><td></td><td>リットルあたりの量:&nbsp; 3グラムのNaCl、 3.5グラムのペプトン、1 mL CaCl2 (1 M)、1 mL MgSO4 (1 M)、25 mL リン酸緩衝液、および 973 mL の milli-Q 水</td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>L1520</td><td></td></tr><tr><td>Brian Heart Infusion Broth (BHI)</td><td>Research Products International Corp</td><td>50-488-526</td><td></td></tr><tr><td>Worm Bleach Solution</td><td></td><td></td><td>100 mLあたりの量:10 mLの5 M NaOH溶液、20 mLの5%次亜塩素酸ナトリウム溶液、および70 mLの滅菌水</td></tr><tr><td>Sリットルあたりの基礎</td><td></td><td></td><td>量:5.85グラムNaCl、6グラムKH2 PO4、1グラムK2HPO4、 1リットルのミリQ水</td></tr><tr><td>寒天</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>S5000</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P3300</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>USBiological Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td></td></tr><tr>1リットルあたりの<td>リン酸塩緩衝</td><td></td><td></td><td>液量:132 mLのK2HPO4(1M)および868 mLのKH2PO4(1M)</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>USBiological Life Sciences</td><td>P5100</td><td></td></tr><tr><td>5%次亜塩素酸ナトリウム溶液</td><td>BICCA7495.5-32</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>呼吸が楽</td><td>な多様化バイオテクノロジー</td><td>BEM-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOXオレンジ核酸染色</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P. aeruginosa (PA14)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. faecalis(OG1RF)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>大腸菌スーパーフード (OP50)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli RNAi 発現細菌 (HT115)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Worm Strains </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glp-4(bn2) (Beanan and Strome, 1992, PMID: 1289064)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PINK-1::GFP reporter (Kang et al., 2018, PMID: 29532717)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

識別される新薬の数によって、伝統的な体外画面は暮れゆき、多剤耐性を戦闘に新たな武器を求めてこのアプローチの成功を減らすこと。これは、研究者はのみ新しい薬を見つける必要はありませんが、またそれらを見つける新しい方法を開発する必要があります結論につながっています。最も有望な候補の中でメソッドは、全体の生物、生体内でその使用の高スループット、表現型のリードアウトを試金して動脈分布を線虫からその範囲をホストします。これらのホストには、ホストまたは biounavailable に有毒な化合物は、通常を高価なフォローする前に、最初の画面にドロップした時に誤検出での劇的な削減を含むいくつかの強力な利点があります。
ここで我々 の分析が定評のc. の elegansのホスト変化を調査する使用されている方法を紹介-緑膿菌液殺害病態システム。よく働いたこの技術のいくつかの拡張機能を紹介します。たとえば、我々 は 24 または 96 ウェルで RNAi を用いた高スループット遺伝スクリーンをこのホスト病原体の相互作用でクエリ ホスト要因にプレート フォーマットを運ぶことができます。この試金を使用して、可能性のある骨の折れるの生化学的な浄化方法を必要とせず、創薬のターゲットを識別するタスクを大幅に効率化できる、少数の月だけで全ゲノム スクリーンを完了できます。
我々 もここでグラム陰性病原菌膿のグラム陽性菌腸球菌を代替となる手法の変化を報告します。ずっと膿の場合に、腸球菌による殺害は時間依存です。以前c. の elegansのとは異なり、腸球菌の試金、我々 の分析腸球菌は、preinfection を必要としない、その安全性の向上、液体処理機器の汚染の可能性を減らすこと。試金は非常に堅牢な 〜 95% 死亡率 96 h ポスト感染を示します。

分析パフォーマンスのための重要なパラメーター
トラブルシューティングと分析を最適化するために必要なこの試金の基礎となる生物学の正しい理解が。そのために、私たちを参照してください最初いくつか主要なペーパー,緑膿菌の発症のメカニズムを解明-リキッド7,20で殺害を介する。上記で説明した手順に従っている (試金のプロトコルの概略は図 1を参照)、線虫の時間依存の殺害は (図 2 a) 病原体の存在下でのみ観察します。対照的に、キーの栄養補助食品 (例えばペプトン、メディアから外されますのみ S 基底が追加された場合) がない場合は、ほとんどない殺害が観察...

ここでは適応可能、全体のホスト、ホスト病原体の相互作用を研究し、創薬に使用することが出来、高コンテンツ スクリーニング ツール プロトコルについて述べる。

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

この方法は、さまざまな病原性因子の重要性や、低分子が起源を改善する能力など、宿主病原体の相互作用と創薬における疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、少量の液体形式で行われることです。まず、BSL 2バイオセーフティキャビネット内で作業しながら、凍結ストックから緑膿菌をLB寒天プレートにストリークします。プレートを37°Cで16〜24時間インキュベートし、その後、プレートを摂氏4度で最大1週間保存します。アッセイプレートをセットする2日前に、プレートから1つのコロニーを使用して、3〜5ミリリットルの滅菌LBブロスを接種します。培養物を摂氏37度で12〜16時間インキュベートします。テキストプロトコルに従ってスローキルまたはSK培地を調製した後、新鮮な一晩のLB培養物から350ミリリットルの緑膿菌で、各10センチメートルのSKプレートに播種する。滅菌細菌スプレッダーを使用して細菌を均一に広げ、プレートをバイオセーフティキャビネットで乾燥させます。その後、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。24ウェルディープウェルプレートの1つのウェルで複数のRNAi細菌株を並行して試験するには、以前に調製したRNAi含有細菌の各クローンから1つのコロニーを4ミリリットルのカルベニシリン添加LBに接種します。プレートをマルチウェルプレート用に最適化された振とうインキュベーターに摂氏37度、950rpmで16時間入れ、次いで2, 000gで5分間遠心分離して細菌を回収する。プレートを反転させ、激しく振ることにより、上清をデカントします。100マイクロリットルのS基底を使用して、RNAi細菌を再懸濁します。再懸濁した細菌を、IPTGおよびカルベニシリンを添加したマルチウェルNGMプレートの適切な数のウェルにピペットで移し、プレートを乾燥させます。テキストプロトコルに従ってL1ワームを調製した後、RNAiまたはOP50スーパーフードを播種した10センチメートルプレートあたり約5, 000ワームをピペッティングして、基本実験用のプレートを準備します。RNAiスクリーニング用にセットアップするには、RNAiを播種した24ウェルプレートでウェルあたり約300匹の線虫をピペットで泳ぎます。使用している系統が温度滅菌されている場合は、線虫を摂氏15度で約16時間インキュベートした後、摂氏25度に44時間移して発生を完了し、胚形成を防ぎます。液体殺傷アッセイを実施するには、セルスクレーパーを使用してSKプレートから緑膿菌を除去し、細菌を約5ミリリットルのS.Basalに再懸濁します。分光光度計を使用して、細菌懸濁液のOD600を測定します。S.BasalにP.Aeruginosaの希釈ストック24ミリリットルをOD600で09に調製し、次に21ミリリットルの液体SK培地を追加し、マルチチャンネルピペットを使用して、45マイクロリットルの細菌と培地を384ウェルプレートの各ウェルに移します。ワームをその発生源から50ミリリットルの円錐形のチューブに洗い流し、重力の下で落ち着くのを待ちます。上清を5ミリリットルに吸引し、次に合計50ミリリットルのS.Basalを使用してワームを再懸濁し、さらに2回洗浄を繰り返します。.ワームソーターを使用して、テキストプロトコルに従って約22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別し、ガス透過性フィルムを使用してプレートをシールし、摂氏25度で24〜48時間インキュベートします。必要な時間に、マイクロプレートウォッシャーとS.Basalを使用して、384ウェルプレートを合計5回洗浄します。最も簡単な間違いの1つは、ワームが完全に落ち着く前に384ウェルプレートを吸引することです。ワームが完全に定着したかどうかを正確に確認するには、練習が必要です。最終洗浄後、上清を20マイクロリットルまで吸引します。次に、ウェルあたり50マイクロリットルの98マイクロモル核酸染色剤を添加し、最終濃度を0.7マイクロモルにします。プレートを室温で12〜16時間インキュベートします。希望のインキュベーション期間が経過したら、マイクロプレートウォッシャーを使用してプレートを最低3回洗浄します。データ取得には、分光光度計または自動顕微鏡を使用して、透過光と蛍光の両方を画像化します。ウェルあたり300匹のワームを含む24ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルのS基礎液を追加します。プレートを振ってワームを静かに攪拌し、次にワームを空の滅菌済み24ディープウェルプレートに移します。ワームが重力で約5分間落ち着くのを待ちます。上清を吸引し、ウェルごとに約1ミリリットルを残し、次に各ウェルに7ミリリットルのS基礎を追加します。洗浄をさらに2回繰り返し、最終洗浄後に約400マイクロリットルの上清を除くすべてを吸引します。.飢餓を避けるために細菌を384ウェルプレートにピペッティングした後、ワームソーターのリサンプラー機能を使用して、22匹のワームを384ウェルプレートの各ウェルに選別します。最後に、選別に続いて、低分子または他の実験用材料を追加します。このグラフに示されているように、このビデオで概説されている手順に従うと、C.elegansの時間依存的な殺傷は、P.aeruginosaの存在下でのみ観察されます。対照的に、主要な細菌性栄養補助食品がない場合、殺傷はほとんどまたはまったく観察されません。ここに示すように、緑膿菌の37°Cと25°Cの2段階のインキュベーションは、従来のスローキルアッセイに重要であり、もともと液体殺傷で実施されていましたが、このアッセイでは不要です。このプロトコルは、OD 600から0025までの低さから、幅広い初期細菌濃度を許容し、タイミングがずれるものの、時間と濃度に依存する殺傷を示します。さらに、統計的に有意なデータを取得するには、多くの場合、わずか 4 つのウェルで十分です。この例のように、信号対雑音比が高い場合の処理の有用性の例を次に示します。これは、分析が簡単で、正の条件と負の条件の区別が簡単です。このような場合、弱いヒットでも簡単に識別できます。習得すると、このテクニックは、ソーティングを含まない384ウェルプレートあたり約60〜75分のハンズオン時間で実行できます。この手順を試行する間は、メディアにすべてのコンポーネントを追加すると、毒性が損なわれることを覚えておくことが重要です。このアッセイは、全生物表現型に基づくスクリーニングを宿主病原体研究における創薬への適用を簡素化します。このビデオを見れば、液体ベースのCエレガンス病因アッセイの実施方法について十分に理解できるはずです。この手順は、P.AeruginosaをE.Faecalisなどの他の病原体に置き換えることで変更でき、他の細菌感染症の治療法の検索を容易にします。P.AeruginosaやE.Faecalisのような感染性細菌を扱うことは危険な場合があることを忘れないでください。この手順を実行する際には、適切なトレーニング、適切な個人用保護具、適切な技術などの適切な予防措置を常に講じる必要があります。

a-high-throughput-high-content-liquid-based-c-elegans-pathosystem

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

液体ベースの培養および調剤のための手順...

蛍光とハイスループットスクリーニングとバイオセンシング C.エレガンス菌株

我々は、使用してプロトコルを記述する...

の定量と自動ハイスループットゲノムワイドRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

研究者は、線虫が感知して応答する電場を適用することにより、C.

Electrotaxis Assay:C. elegansの移動を観察する方法

出典: アンダーソン、Q.L. 他。 ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオでは、 Caenorhabditis elegans...

C.エレガンスノックダウンをスクリーニングするためのマルチウェル液体ベースのアッセイ

出典: アンダーソン、Q.L.、 他。ハイスループット,高含有量,液体ベースの C.エレガンス 病態系 J. Vis. 経験。 (2018年)このビデオは、遺伝子組み換えされた C.エレガンスの...

C.エレガンス幼虫における病原菌誘発性死亡率の評価

私たちは、ワームでamylopathiesの側面を研究するための方法を説明...

A<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</emAmylopathyの研究のための&gt;モデルシステム

生殖細胞毒性を評価するために使用された線虫Caenorhabditis...

線虫を用いて生殖化学毒性を総合的に評価<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

ここでは、ポリグルタミン凝集、神経細胞死、および化学回避行動を含む Caenorhabditis...

ポリグルタミン媒介性神経毒性に対する生理活性化合物を発見するためのモデルシステムとしてのCaenorhabditis elegans

このプロトコルは、マイクロ流体ベースの C.エレガンス...

すべての幼虫期にわたる高解像度 のC.エレガンス イメージング

ここでは、広視野顕微鏡画像内の個々のワームを自動セグメンテーションするために開発した深層学習システムであるSegElegansを、その後ImageJなどの画像解析ソフトウェアで使用するために効果的に活用する方法を説明します。オンラインとオフラインの両方でシステムの利用方法を提供します。...

SegElegansを用いたC .エレガンス 蛍光画像の自動解析

学ぶ液体ベースのC. elegans病原性アッセイで、P. aeruginosaを用いた宿主・病原体相互作用と創薬研究を行う方法。小容量の液体フォーマットにより高スループットスクリーニングが可能です。

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

さらに動画を探す