の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法ショウジョウバエ光刺激に感光体と介在ニューロンインビボ

この手順の全体的な目標は、制御された光刺激に対するショウジョウバエの光受容体と視覚介在ニューロンの細胞内電気応答を記録することです。この方法は、光刺激がそれを応答の1つにどのようにエンコードするか、または視覚情報と光受容体および介在ニューロンが光刺激からどのように抽出するかなど、ニューロコーディング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞内環境や情報サンプリングへのダメージをほとんど受けずに、研究からの長期にわたる高品質の録音を提供できることです。

これが影響を与える可能性のあるデモンストレーションの特徴は、そのさまざまなステップを見ずに正しく実行することを学ぶのが難しいため、重要です。フィラメント状のホウケイ酸から、または標準的なピペットプーラーを使用して石英ガラス管から参照微小電極を引き出します。短く、緩やかなテーパーを実現してみてください。

正確な設定は機器によって異なります。先端の細孔サイズは、実験のために壊れるため、重要ではありません。次に、同じガラス管から記録電極を引き出し、長さ10〜15ミリメートルの細い緩やかなテーパーを実現してみてください。

光学顕微鏡では、電極をガラス面に複数の接着剤で取り付け、40倍の空気対物レンズを使用してその先端を検査します。優れた電極は、目に見えないほど小さな先端まで滑らかに先細りになり、その周りに連続した平行な暗い干渉パターンと明るい干渉パターンが見られます。実験の直前に、粒子フィルターに接続された5ミリリットルのシリンジを使用して、参照電極をフライリンガーで埋め戻し、細かいプラスチックチップを付けます。

光受容体実験の場合は、記録電極に3モルの塩化カリウムを負荷し、その大きい方の端に液滴が形成されるまで待ちます。これにより、録音中の液体接合部からのノイズが最小限に抑えられます。ヒスタミン作動性LMCを使用するには、記録電極に3モルの酢酸カリウム、0.5ミリモルの塩化カリウムを充填して、セルの塩化物バッテリーへの影響を最小限に抑えます。

5〜10日齢のハエを新鮮なハエの小瓶に入れることから始めます。若いハエはより壊れやすいですが、から記録することができます。電気生理学の最初のフライを選択します。

大きな女性は一緒に働くのが最も簡単です。キャッチングチューブに入るときは、ピペットチップに上向きに登り、小さい方のチップをキャップする固有の傾向を利用します。次に、100ミリリットルの注射器と柔軟なプラスチックホースをピペットチップに接続し、ショウジョウバエを通すためだけに拡大し、もう一方の端をフライホルダーに取り付けられた大きなピペットチップに接続します。

次に、シリンジから少量の空気を絞り、フライをフライホルダーに排出します。実体顕微鏡を覗き、フライホルダーの円錐形の端からハエの頭が突き出るまで、さらに空気を静かに投与します。ハエが胸部にしっかりと引っかかっていることを確認してください。

次に、ハエを蜜蝋で固定します。ワックスヒーターの最低温度を使用して、透明に見えるワックスをきれいに溶かします。熱すぎるとワックスが燃え尽きてしまいます。

角膜を避けて、吻と右目の角に少量の蜜蝋を塗って、ハエの頭を固定します。これらの2つのポイントをフライホルダーに固定します。ハエが焦げないように、この手順をすばやく完了してください。

次に、ゴーグルを装着してマイクロナイフを製作します。非ステンレス製のカミソリの刃を2つのフラットグリップブレードホルダーで固定し、その鋭い刃の小さなストリップを割ります。理想的には、尖塔に似たかみそりの鋭いエッジを生成します。

次に、慎重に、細部に細心の注意を払いながら、マイクロナイフを使用して、ハエの左目のいくつかのオンマチディアを開きます。たとえば、目の赤道のすぐ上の背側のキューティクルから4〜5オンマチディアを開きます。これにより、記録用微小電極の通路が得られます。これは非常に難しく、よくできたナイフが必要であり、練習して学ぶ必要があります。

次に、角膜の小片を開口部からそっと取り出し、その下の網膜を露出させます。次に、ワセリンアプリケーターの細い毛を使用して、ワセリンの小さな塊で穴をすばやく覆います。このゼリーには、ピペットの壁内容量を減少させるという利点もあります。

目を汚すと光学系がぼやけてしまうので避けてください。微小電極を操作するときは amplifier静電気を防ぐために、常にファラデーケージまたは防振テーブルの金属面に触れて接地してください。取り付けられたフライをフライ準備プラットフォームのポールに固定します。

フライホルダーを回転させて、フライの左目が直接研究者に向くようにします。次に、小さなコースマイクロマニピュレーターを使用して、鈍い参照電極をハエのオセリを通してヘッドカプセルにそっと挿入します。ハエがまだ健康に見え、アンテナを動か

収録に値するほどの出来栄えでなければならない。次に、ゼリーコーティングされた開口部から鋭い記録微小電極を左目に打ち込みます。それが組織に入ると、電極の先端の位置はその反射率パターンによって明らかになるはずです。

壊れやすい電極の先端は完璧にガイドしなければ壊れてしまいますが、これは非常に困難です。記録元の細胞の種類に応じて、ハエの頭の向きはわずかに異なるはずです。電極を所定の位置に配置した状態で、微小電極増幅器をオンにします。

次に、冷光源の電源を切り、主電源からプラグを抜き、中央のアースに接続して、グランドループによる電気ノイズを最小限に抑えます。次に、グースネックライトガイドを調整して、カーデンアームシステムがフライで自由に動かせるようにします。次に、部屋の照明を消して、フライの準備を比較的暗い場所に置きます。

次に、目の中の記録電極の抵抗を測定します。100〜260メガオームである必要があります。チップが詰まっている場合があり、アンプの容量性バズと電流パルス機能を使用してクリアできます。

それでも問題が解決しない場合は、新しい電極を使用してください。次に、アンプを電流クランプまたはブリッジに設定し、電極間の電圧をゼロにします。フライを数分間暗順応させた後、ピエゾステッパーを使用するか、微細解像度のノブを穏やかに回転させて、記録電極の先端を0.1〜1ミクロン刻みで目に打ち込みます。

各ステップで、1〜10ミリ秒のライトフラッシュで目を刺激します。ライトが点滅するたびに、電圧またはERGが一時的に低下します。電極の先端がラミナに入り、LMCを閉じると、ERGは反転します。

その後、測定に進みます。非侵襲性により、個々の細胞のシグナル性能を自然に近い状態で研究することができます。R1-R6感光体による薄暗い光と明るい光に対する電圧応答を摂氏20度で測定しました。

次に、R1-R6光受容体を25°CのLMCと比較しました。同じフライの2つの鋭い微小電極による細胞内記録は難しすぎて実行できないため、それぞれを異なるフライで測定しました。応答の再現性は、データが重ね合わせられると明らかになります。

周波数領域の信号対雑音比は、信号とノイズのデータチャンクをパワースペクトルに変換し、平均信号パワースペクトルを対応する平均ノイズパワースペクトルで除算して4年で求めました。その結果、最適な調製物ではシグナルに非常に敏感になります。この技術は、多くの種の記録に使用できます。

コエノキアのハエには、摂氏19度で同じ自然で反復的な光刺激が与えられました。データは、記録電極を前進させることにより、同じフライからシナプス前とシナプス後に取得されました。録音の速いダイナミクスは、この種の捕食性と一致しています。

このテクニックをマスターすると、適切に実行されれば、常に長く高品質の録音が可能になります。この手順を試みる際には、ピアノを弾くことを学ぶようなものだと認識することが重要です。練習すればするほど、より良い結果が得られます。

この手順に続いて、薬理学的介入などの他の方法を実行して、応答の形成における神経調節因子の役割などの追加の質問に答えることができます。この技術は、その開発後、神経生物物理学の分野の研究者が、光情報、捕捉、転送、および光変換装置およびそれに続く生物科学における腐食性生化学反応を最適化する方法を探求する道を開きました。このビデオを見た後、ショウジョウバエを細胞内実験用に準備する方法と、その光受容体と介在ニューロンからの神経応答を目覚めさせる方法についてよく理解しているはずです。