Name: の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法ショウジョウバエ光刺激に感光体と介在ニューロンインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶショウジョウバエの感光体と視覚介在ニューロンへの鋭い微小電極を用いた細胞内電気生理学的記録法。光刺激に対する神経応答の長時間高品質記録が可能です。

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著者は、リグの多くの電気的および機械的なコンポーネントの設計と構築における重要な貢献に対して、Mick Swann、Chris Askham、Martin Gautreyに感謝します。MJの現在の研究は、Biotechnology and Biological Sciences Research Council(BBSRC助成金:BB/M009564/1)、State Key Laboratory of Cognitive Neuroscience and Learningオープンリサーチファンド(中国)、High-End Foreign Expert Grant(中国)、Jane and Aatos Erkko Foundation Fellowship(フィンランド)、Leverhulme Trust助成金(RPG-2012-567)の支援を受けています。

著者は開示するものは何もありません

鋭い従来の微小電極を使用して、無傷のフライアイにおけるR1-R6光受容体とLMCの細胞内応答を記録する方法の基本的な重要なステップを提示しました。この方法は、過去18年間にわたって、特注のハードウェアおよびソフトウェアツールとともに最適化され、幅広い実験的な質問に答える高品質で長持ちする記録を提供します。堅牢で正確な実験セットアップを構築し、良好な電気特性を備えた微小電極を製造するために時間とリソースを投資することで、ショ ウジョウバエ の視覚神経生理学に取り組むあらゆる研究室で高品質の記録が標準になる可能性があります。さまざまな実験パラダイムを迅速に実行するには、適切に設計された記録および光刺激システムが重要ですが、記録を成功させるには、(i)目の損傷を最小限に抑えてハエの準備を行うこと、(ii)適切な電気的特性を持つ微小電極を引っ張ること、(iii)先端を壊さずに記録電極を眼に打ち込むこと、という3つの手順がさらに重要です。最終的に、意味のあるデータを記録するために、研究者は電気生理学の物理的基盤と、標的細胞タイプに適した微小電極を作製する方法を理解する必要があります。
したがって、この手法の限界は、主に研究者の忍耐力、経験、および技術的能力によって設定されます。この技術は小さな ショウジョウバエ 細胞を習得するのに長い時間がかかる可能性があるため、研修生の電気生理学者は、最初に同じリグを使用して、フチ36 やイナゴ35などの大きな昆虫の目で練習することをお勧めします。より大きな光受容体と介在ニューロンからの高品質の細胞内記録が日常的になったら、ショ ウジョウバエ の目に移ります。この技術のもう一つの制限は、細胞の同定に関するものです。浸透した ショウジョウバエ 細胞は、ルシファーイエローやニューロビオチンなどの色素を電気泳動的にロードすることができます。ただし、微小電極の先端サイズが小さいため、電気泳動はパッチ電極などの低抵抗電極よりも効率が悪くなります。さらに、色素で満たされた微小電極は、特徴的に電気的特性があまり好ましくないため、 ショウジョウバエ の光受容体やLMCから高品質の応答を記録することがはるかに困難になります。
時々発生する技術的な問題は、入力信号が不安定であるか、入力信号が完全に欠如していることです。これは、多くの場合、電圧信号が常にドリフトしているか、アンプの録音範囲よりも高い/低いことに関連しています。ほとんどの場合、この動作は、記録電極がブロックされている(または、その先端が細すぎて、抵抗または壁内静電容量が高すぎて、高速信号変化を適切に行うことができないこと)によって引き起こされます。電極の静電容量をブーンと鳴らしてチップのブロックを解除しようとすることもできますが、多くの場合、記録電極を交換するだけで状況を解決するのが最善です。これには、新しい電極の先端抵抗を下げるために、微小電極プーラー装置のパラメータ調整がさらに必要になる場合があります。また、ワセリンで角膜穴を覆うのに時間がかかりすぎた製剤で電極先端が詰まることもあります。長時間空気と接触すると、露出したばかりの網膜組織が乾燥し、その表層が接着剤のような物質に変わる可能性があります。この場合、研究者は通常、記録電極を目から引き抜くときに、記録電極に組織の赤い塊が付着しているのを見ます。ここでの唯一の解決策は、新しい準備をすることです。ワセリンは、電気生理学的記録に多くの利点をもたらす可能性があります:(i)電極の先端を壊す可能性のある血リンパの凝固を防ぎます。(ii)電極先端をコーティングして壁内静電容量を減少させ、電極の時定数を低下させ、したがって、記録された神経信号の時間分解能を改善する可能性を有する40,41;(iii) 電極先端を清潔に保ち、浸透を容易にします。そして、浸透後、(iv)電極先端を細胞膜42に密閉するのにさえ役立つかもしれない。 
電極ホルダーの塩化銀線が断線または脱塩素化されると、信号がさらに不安定になったり、失われたりする可能性があります。その場合は、古いワイヤーを交換または再塩素化するだけです。信号の欠落は、電極ホルダーの一方(または両方)がジャックにしっかりと接続されていないことが原因である可能性もあります。しかし、機器が故障することは極めて異例です。信号が検出できず、他のすべての可能性が使い果たされた場合は、ヘッドステージ、アンプ、ローパスフィルター、AD/DAコンバーターなど、記録装置の各部分が正しく接続され、正常に機能していることをテストします。これを実現する 1 つの方法は、各機器を、正常に動作することが知られているリグの別の機器と交換することです。または、信号発生器を使用して、電子部品の性能を 1 つずつチェックします。
しかし、おそらく電気生理学者が直面する最も一般的な技術的な問題は、ノイズの記録の問題です。大まかに言えば、記録ノイズは、特定の刺激に対する直接的なニューロンの反応以外の観察された電気的活動です。フライの準備は、適切に行われれば非常に安定しているため、観察されたノイズ(応答の自然な変動を超えて)は、ほとんどの場合、記録機器のグランドループから生じるか、近くの電気機器から拾われます。このようなノイズは通常、50/60 Hz の主電源のハム音とその高調波です。しかし、より複雑な波形で構成されることもあります。ノイズの発生源を特定するには、ハエ準備ホルダーをセットアップから取り外し、ハエリンゲルの滴を通して記録電極と参照電極を接続し(または小さなリンゲル溶液浴に入れ、手順1.2.6を参照)、CCまたはブリッジモードで信号を記録します。記録された信号でノイズが観察可能な場合、これはノイズがフライ準備の外部にあることを意味している可能性があります。
ノイズの発生源を特定するためのもう一つの良いテストは、電極ホルダーをアンプに接続された電気セルモデルに交換することです。理想的に構成され、接地されたセットアップでは、記録された信号は実質的にノイズがなくなり、ADコンバータからの確率的ビットノイズのみを示すはずです(最良の場合はそれさえも表示しません)。ノイズがまだ発生する場合は、すべてのリグ機器が適切に接地されていることを再確認してください。グランドループを検出するための便利なアプローチは、(i)リグ内のすべての部品からすべてのアース線を外すことです。(ii) これを行った後、すべての部品がオーム計によって実際にアースから絶縁されていることを確認します。(iii) リグの他の部分を通さず、部品を 1 つずつ中央の地面に直接接続します。機器の構成も変更してみてください。たとえば、コンピューターとモニターをリグから遠ざけると、ノイズを軽減できる場合があります。しかし、機器ラック内でコンピューターを移動するとノイズが減少する場合もあります。また、近くの機器のプラグを抜いて、ノイズが減少するかどうかを確認したり、追加のコンポーネントをシールドしたりすることも価値があります。さらに、録音機器のさまざまなコンポーネント、特にBNCケーブル(アース接続に欠陥がある可能性があります)を抜くか交換してみてください。セルモデルを使用するときにビットノイズのみが観察される場合、最初のノイズ源は電極またはハエの準備自体のいずれかです。たとえば、参照電極が頭嚢内の運動神経または活動筋線維に誤って触れている可能性があります(または胸部に配置されている場合は、胸部の飛行筋を乱しています)。通常、ハエへのダメージを最小限に抑えるように注意しながら、記録用に新しいハエを準備するのが最も簡単です。しかし、ノイズが持続し、広帯域である場合は、電極が実験に最適ではない可能性があります。鋭すぎる/細かすぎる(したがってうるさすぎる)、または目的に合わない。石英電極がアンテナとして機能し、かすかな放送信号を拾うのを見たこともあります。特定の細胞タイプから一貫した高品質の記録を行うための適切な微小電極を生成するために、プーラー機器パラメータ設定を反復するには多大な労力がかかりますが、それだけの価値はあります。記録電極が実験に合わせて適切に調整されると、優れた品質の長期にわたる記録を提供できます。
鋭い微小電極記録技術は、昆虫の目および脳の異なる処理層を含む多数の準備における神経情報処理の研究に同様に適用することができる43,44。微小電極の先端は非常に細かくすることができるため、通常、ほとんどのパッチクランプアプリケーションよりも研究対象のセルに損傷を与えません。重要なことに、最新のサンプルアンドホールド微小電極アンプは、チップの電気的特性を良好に制御できる40,45〜47。したがって、正しく適用すると、この手法は、ミリ秒未満の分解能で高いS/N比で、 in vivo3,5,7-10,44 または in vitro48 調製の両方から信頼性の高いデータを提供できます。このような精度は、ノイズが多く遅い今日の光学イメージング技術では不可能です。さらに、この方法は、電流および電圧クランプ構成5,29,33,36,40-42,49の両方で小細胞の電気膜特性を特徴付けるために使用でき、実験を理論に結び付ける生物物理学的および経験的モデリングアプローチ7,8,11,33,49-54 に貴重なデータを提供します。

ミバエ（ キイロショウジョウバエ ）複眼は、神経画像サンプリングおよび処理のための感光体と介在ニューロンの配列の機能的な組織を調査するのに最適なモデルシステムであり、動物のビジョンのために。システムは、最も完全な配線図1,2を有しており、遺伝子操作および3-10（高い信号対雑音比と時間分解能の）正確な神経活動の監視に愛想です。 ショウジョウバエの目は一緒にその頭の周りのほぼすべての方向をカバーするパノラマ視野を飛ぶ提供個眼と呼ばれる〜750一見、通常のレンズキャップされた構造を含む、モジュール化されています。目の一次情報サンプリングユニットは、そのrhabdomeric光受容体7,8,11です。それぞれの個眼は、同じファセットレンズを共有する8光受容体細胞（R1-R8）を含むが、7つの異なる方向に整列されます。外光受容体R1-R6 ARながら青緑色の光、同じ方向に互いの上部と点に横たわる内側の細胞R7およびR8の分光感度、展示3独特のサブタイプに電子最も敏感：、淡い黄色と背側リムエリア（DRA）12- 15。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig1.jpg" /> 図1. ショウジョウバエ の目 の機能組織 。 （A）は、2つの第1の光学要素神経節、網膜およびラミナは、フライアイ内側の灰色で強調されています。網膜R1-R6の光受容体とラミナ大モノポーラ細胞（LMCS：L1-L3）は、従来の鋭い微小電極記録に生体内で容易にアクセスできます。模式電極は、網膜にR1-R6から記録するために通常のパスを強調しています。ラミナにLMCSから録音するための一つのパスを左に平行電極にシフトすることです。 （B）ラミナはretinotopically臓器のマトリックスであります視覚空間内の特定の小さな領域からの情報を処理するニューロンが詰め込まれて、それぞれが化さカートリッジ。神経重ね合わせのために、異なる隣接個眼から6の感光体は、L1〜L3とアマクリン細胞（アム）のヒスタミン出力シナプスを形成し、同じラミナカートリッジにその軸索（R1-R6）を送信します。ラミナカートリッジ内の（C）R1-R6の軸索末端と（L4、L5、Lawf、C2、C3とT1を含む）視覚介在ニューロン間の神経情報の普及は、複雑です。 （D）R1-R6の感光体の軸索は、L2とL4単極細胞からシナプスフィードバックを受けます。リベラ・アルバら2から変更された（B）及び（C）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ショウジョウバエの目は、神経重畳型16です。これは、トンを意味します帽子空間内の同じ点を見て7、隣接個眼に属する8の光受容体の神経信号は、次の2 neuropils内の1つの神経カートリッジで一緒にプールされていますラミナおよび髄質。 6外光受容体R1-R6プロジェクトラミナにおける神経の列への軸索の端末（ 図1）が、R7およびR8細胞は、この層をバイパスし、それらに対応する髄質列17-19とのシナプス接触を行います。これらの正確な配線はすべてのラミナ（ 図1A-C）その後、フライ初期視覚の網膜マッピングのための神経基盤を生成し、髄質カラム（カートリッジ）は、空間内の単一の点を表します。 ラミナ1,2,20およびアマクリン細胞（アム）：R1-R6の光受容体からの直接入力が大型単極細胞（L1、L2とL3 LMCS）によって受信されます。これらのうち、L1、L2は、（ 図1D）の主要な情報伝達経路を媒介する、WHIの最大の細胞でありますchのエッジをオンとオフの移動に応答し、したがって、動き検出器21,22の計算基礎を形成します。 L2細胞23,24におけるL1中にフロント、バックとフロントツーバック：行動実験は、中間対照的に、二つの経路が反対方向の運動知覚を促進することを示唆しています。接続は、さらにL4ニューロンは、隣接カートリッジ25,26間の横方向の通信において重要な役割を果たし得ることを意味します。逆数シナプスは、L2とL4同じに位置するセルと隣接する二つのカートリッジの間で発見されました。下流では、各L2細胞およびその関連する3つのL4細胞は、共通の目標に隣接カートリッジからの入力は、前面から背面への運動27の処理のために統合されると考えられている髄質、中Tm2がニューロンをその軸索を投射します。 L1のニューロンは、両方のギャップ結合とシナプスを介して、同じカートリッジL2Sからの入力を受け取るが、それらは直接L4sので、隣接するラミナカートリッジに接続されていません。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt; R1-R6の感光体の軸索へのシナプスのフィードバックは、L2 / L4回路に属するニューロンによってのみ提供されていなく、L1経路1,2（ 図1D）。同じカートリッジの接続は、L2からR1とR2およびL4からR5に選択されている一方で、すべてのR1-R6の光受容体は、いずれかのL4または両方の隣接カートリッジからシナプスフィードバックを受けます。また、R1、R2、R4及びR5の時から強いシナプス結合が存在し、およびグリア細胞は、シナプスネットワークに接続され、従って、神経画像処理6に参加することができます。最後に、薄層に隣接したR1-R6をリンクし、R6およびR7 / R8光受容体との間に、ギャップジャンクション軸索は、各カートリッジ14,20,28における非対称情報の表現と処理に貢献しています。 ほぼ無傷のショウジョウバエの個々の光受容体と視覚介在ニューロンからの細胞内の電圧の記録は高い信号対雑音Rを提供します接続されたニューロン間の高速神経計算の意味を理解するために必要なサブミリ秒の分解能3,5,7-10,29、のデータatio。 100ミリ秒の解像度 - 高精度のこのレベルは、有意に騒々しいであり、典型的には10で動作する現在の光イメージング技術によっては不可能です。電極は非常に小さく、鋭い先端を有するのでさらに、方法は、細胞体に限定されるものではないが、小さなアクティブ神経構造からの直接録音を提供することができます。このようなパッチクランプ電極のはるかに大きなヒントがアクセスすることはできませんLMCS「樹状突起や感光体の軸索、など。重要なことは、この方法は、ほとんどのパッチクランプのアプリケーションよりも構造的に低侵襲性および損傷であるので、あまり研究され、細胞の細胞内環境と情報のサンプリングに影響を与えます。このように、従来の鋭い微小電極技術が貢献し、かつ神経フォアに寄与し、基本的な発見やオリジナルの洞察に維持しています適切な時間スケールでの報処理;ビジョン3-10の我々のメカニズムの理解を向上させることができます。 この記事では、ショウジョウバエ R1-R6の光受容体とLMCSからin vivoでの細胞内記録はJuusolaの実験室で行われている方法について説明します。このプロトコルは、適切な電気生理学リグを構築する方法について説明フライを準備し、録音を行います。いくつかの代表的なデータが提示され、いくつかの一般的な問題や潜在的な解決策は、この方法を使用するときに遭遇する可能性があるという議論されています。

<table><tbody><tr><td>はえの準備オ</td><td>リンパス</td><td>SZX12 DFPLFL1.6x PF接眼レンズを作るためのステレオズーム顕微鏡:WHN30x-H / 22</td><td>~150Xの倍率で長い作動距離が可能、特注の重いスチールテーブルマウントスタンド</td></tr><tr><td>細胞内セットアップ</td><td>&middotのステレオ顕微鏡;&nbsp;オリンパス</td><td>オリンパスSZX7;接眼レンズ:WHN30x-H / 22</td><td>30X接眼レンズは、小さな角膜穴を通して目に電極の先端反射をよく見るために必要です</td></tr><tr><td>ニコン顕微鏡</td>ニ<td>コンSMZ645;接眼レンズ:C-W30x / 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>防振テーブル</td><td>メレスグリオ</td><td>ブレッドボード上のメートル法のM6穴付き</td><td>私たちのオーダーメイドのリグは、ハエの準備プラットフォームポール(電子機器と銅製ヒートシンクを収容)を下からニュー</td></tr><tr><td>ポート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>Narishige Narishige</td><td>NMN-21</td><td>私たちの細胞内セットアップでは、フライアイにシャップ記録電極を駆動するために、異なるマイクロマニピュレーターシステムが使用されています。リストされたすべてのマニピュレーターは、ショウジョウバエの光受容体とLMCからの長期にわたる安定した記録を成功裏に提供しています。</td></tr><tr><td>ハクスリー バートラム</td><td>ハクスリー xyz軸 細かい手動制御</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sensapex</td><td>Sensapex 三軸</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M&auml;rzh&auml;ユーザー</td><td>M&auml;rzh&auml;追加のx軸ピエゾステッパーとMS 314コントローラー</td><td></td><td></td>を備えたユーザーDC-3K</tr><tr><td>磁気スタンド</td><td>オン/オフスイッチ付きの任意の磁気ベースで十分です</td><td></td><td>たとえば、ファラデーケージ内のケーブルを管理するには</td></tr><tr><td>電極ホルダー</td><td>ハーバード装置</td><td>ESP / W-F10N</td><td></td></tr><tr><td>シルバーワイヤー</td><td>ワールド精密機器&nbsp;</td><td>AGW1510</td><td>0.3 - 0.5 mmの直径;電極のホールダーのために塩素化される必要がある</td></tr><tr><td>光ファイバーの光源</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td>を含む多くの異</tr>なった、 <tr><td>光ファイバーの束</td><td>UltraFineの技術</td><td></td><td>Cardanの腕システムにLEDの軽い刺激を与えるため。私たちは、液体と石英の両方のライトガイド(UVからIRの範囲)</td></tr><tr><td>Thorn Labsフライ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケージチューブ</td><td></td><td>P80-50P 50mlセントチューブPP.、100個パック</td><td>50mlプラスチック遠心分離チューブから円錐形の底を切り取り、その上に1mlのピペットチップを接着します。</td></tr><tr><td>デジタル集録システム</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>単極電流/電圧クランプ微小電極増幅器</td><td>npi SEC-10LX</td><td>http://www.npielectronic.de/products/amplifiers/sec-single-electrode-clamp/sec-10lx.html</td><td>優れた性能</td></tr>を発揮しました!<tr><td>ヘッドステージ</td><td>標準(+/- 150 nA)</td><td>npi SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>LED光源およびドライバー</td>用<td>2チャンネルOptoLED(Cairn Research Ltd.、英国)</td><td></td><td>当社の刺激システムの多くは社内で構築されています&nbsp;</td></tr><tr><td>自己設計および構築</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>取得および分析ソフトウェア</td> Biosyst<td>から選択する多くの企業</td><td>; Juusola研究室での実験的および理論的作業のためのカスタムメイドのMatlabベースのシステム</td>パーソナルコンピュータまたはMac PCまたはMacがデータ収集システムおよびソフトウェアCardanアームシステムと互換性があることを確認してください&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>自己設計および構築</td><td></td><td>光刺激ペルチェ温度制御システムの正確なx、y、z位置決めを提供します</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>自己設計および構築された</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファラデーケージ</td><td>自己構築</td><td></td><td>型電磁ノイズシールド</td></tr><tr><td>フィラメントホウケイ酸ガラスキャピラリー</td><td></td><td>外径:1 mm</td><td></td></tr><tr><td>内径:0.5 - 0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フィラメント石英ガラスキャピラリー</td><td></td><td>外径:1 mm</td><td></td></tr><tr><td>内径:0.5 -0.7 mm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットの引き手</td><td>のSutterの器械の会社</td><td>モデルP-2000レーザーの炎/茶色のマイクロピペットの引き手</td><td>ホウケイ酸の参照電極のために、前もって調整されたプログラム#11 (パッチ電極)を使用して下さい: 熱= 350;フィラメント= 4;速度36;遅延 = 200).1.2.1)ホウケイ酸記録電極の場合は、プリセットプログラム#12を使用します(これは通常、光受容体記録用の優れた従来の鋭利物&nbsp;を引き出します):熱= 355;フィラメント= 4;速度50;遅延 = 225;プル = 150。LMC記録では、先端の細い電極が必要なため、これらの値を調整する必要があります。石英キャピラリーを引っ張るために、P-2000のマニュアルは、細かい先端の微小電極のためのプログラムを提案します。これらのプログラムは、プリセットパラメータは、良好な浸透成功と低記録ノイズの電極を生成するための体系的な変更の有用な出発点として機能します。</td></tr><tr><td>参照電極のための細胞外リンガー溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10326390、NaCl 10010310、KCl 10147753、TES 10161800、CaCl2 10159872、MgCl2 10000430、スクロース</td><td>プロトコルセクションのレシピを参照してください</td></tr><tr><td>フィラメント記録微小電極を充填するためのM KCl溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>10010310からの塩、KCl</td><td></td></tr><tr><td>ワセリン ワセリン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>非ステンレス鋼のかみそりの刃ブレードホルダー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>/ブレーカー</td><td>ファインサイエンスツールデュモン</td><td>10053-09</td><td>9 cm</td></tr><tr><td>ブルータック</td><td>Bostik</td><td></td><td>または、デュ</td></tr><tr>モン<td>11252-00</td> <td>#5SF(超微細チップ)</td>で成形粘土<td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td></tr>を使用してください</tbody></table>

の記録細胞内の電圧応答のための電気生理学的手法<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;光刺激に感光体と介在ニューロン<em&gt;インビボ</em

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

昆虫の光受容体と視覚介在ニューロンの電圧応答は、従来の鋭い微小電極で正確に記録することができます。ここで説明する方法により、研究者は、単一のショウジョウバエR1-R6光受容体および大型単極細胞(LMC)からの光刺激に対する高品質の細胞内応答を長時間(数分から数時間)測定できます。この記録システムはノイズが少ないため、ハエの目の個々の細胞間のばらつきや、その出力が視覚環境の物理的特性をどのように反映しているかを研究するために使用できます。この手法を実行するためのすべての主要な手順を概説します。実験装置の設計や選択など、記録のための適切な電気生理学セットアップを構築するための基本的な手順について説明します。また、適切な(シャープな)記録と(鈍い)参照電極を作成することにより、記録の準備方法についても説明します。無傷のフライを特注のフライホルダーに固定する方法、目に小さな窓を準備する方法、この穴に記録電極を挿入する方法について詳しく説明します。細胞の受容野の中心を局在化し、研究対象の細胞を暗くまたは光に適応させ、動的光刺激に対するその電圧応答を記録する方法について説明します。最後に、安定した正常記録の基準を説明し、さまざまな光刺激に対する個々の細胞の特徴的な高品質電圧応答を示し、それらのシグナル伝達性能を定量化する方法を簡単に定義します。この方法の多くの側面は技術的に困難であり、習得するには練習と忍耐が必要です。しかし、研究者の実験目的に合わせて学習し、最適化すると、優れたin vivo神経生理学的データが得られます。

鋭い微小電極記録方法は、 ショウジョウバエの眼のためにここに適合したように、確実に神経情報サンプリングおよび処理網膜および薄層細胞において、それらの間の通信4,5,7,8,10,33を定量化するために使用することができます。別の野生型株、変異体または遺伝子操作フライ株における符号化を研究するためにそれを使用することにより、この方法は、その価値を証明しています。だけでなく、突然変異、温度、食事または選択した式3,4,6,9,10,14,30,34の効果を定量化ではなく、変更された視覚的な行動14,34のための機構的な理由を明らかにしました。この方法はまた、neuroethologicalビジョンの研究に力を与える他の昆虫の製剤35,36、に容易に適用可能です。次に、その成功したアプリケーションのいくつかの例を紹介しました。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig7.jpg" /> 図7. 電圧20および25 O℃で光パルスにミバエR1-R6感光体の応答鋭い微小電極の貫通部には、多くの場合、非常に安定しているので、で与えられた光刺激に対して同じR1-R6の感光体の電圧応答を記録することができますハエを温めるまたは冷却することにより、異なる周囲温度。我々のセットアップでは、フライホルダーは閉ループペルチェ素子に基づく温度制御システムに配置されています。これは、秒単位でハエの頭の温度を変更することを可能にします。より高い温度は、電圧応答を加速し、特徴（赤い矢印で示されているように）R1-R6の光受容体の静止電位を低下させる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 感光体の出力に及ぼす温度の影響を研究 25°Cの （ 図7）で同じR1-R6の感光体に記録された明るい10ミリ秒の長パルス、に電圧応答を示します。 4.9前に定量化されるように、温暖化は暗闇の中で光受容体の静止電位を低下させ、その電圧応答を加速します。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig8.jpg" /> フルーツフライR1-R6感光体は、光強度に向上しました 図8. シグナリングパフォーマンス （A）感光体の出力（下）暗くし、明るい（上記; 10,000倍明るい光）。同じ微小電極によって記録された自然光強度の時系列を繰り返します20 O℃で同一セル内彼らはより多くのサンプル、単一光子4,5,7,8に基本応答（バンプ）を統合するので、明るい刺激に対する応答は、大きくなっています。 （B）20の連続した1秒の長電圧応答が重畳されています。適応傾向は（Aの矢印）（Aの破線ボックス）後退した後、個々の応答（ライトグレー）を採取しました。対応する応答手段（信号）が暗くトレースです。信号と個々の応答との間の差は、ノイズです。 （C）細胞を、標準的な方法4,5,7,8を用いて信号対雑音比（SNR）」シグナリング性能を記録することによって定量化しました」。感光体の出力がsで、 &#39;（20ヘルツまでの薄暗い ≥1、薄暗いSNR）よりも（84ヘルツまでの明るい ≥1、明るい刺激SNR）&#39;での信頼性のシグナル伝達の約64 Hzの広い範囲を持っていますignal対雑音比が大幅に向上します。 SNR 薄暗い MAX = 87からのSNR ブライト MAX = 1868へ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 反復刺激によって適応と神経エンコーディングを学びます 網膜およびラミナ構造で比較的少ない損傷を引き起こす方法の非侵襲性は、in vivoでの彼らの近くに自然の生理的状態の異なる光刺激に対する個々の細胞の信号伝達性 ​​能を研究するために理想的です。8に示すR1-の電圧応答を図 20°Cので暗く、明るい繰り返さ自然光強度の時系列刺激に対するR6の感光体、 図9のに対し、 </stronグラム&gt; 25 O℃で異なる自然刺激に別のR1-R6の感光体とLMCの応答を示します同じフライで2鋭い微小電極、網膜内の1とラミナ内の他の同時細胞内記録は、30生存可能であるには余りにも困難であるため、前とシナプス後録音は、二つの異なるハエとは別に行われました。 <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig9.jpg" /> 別のハエとは異なる微小電極によって記録された25℃。（A）R1-R6（灰色）およびLMC（黒）出力で繰り返さ自然主義的刺激へのミバエR1-R6感光体とLMCの 図9 の電圧応答 。 （B）光に示す完全に明順応連続20前（上）と個々の応答と同じ自然な刺激パターンにシナプス後（下）の応答を、灰色暗いトレースとしてDに対応する応答手段（信号）。信号と個々の応答との間の差は、ノイズです。 （C）細胞信号対雑音比（SNR）」シグナリング性能を記録することによって定量化しました」。 LMC出力は&#39;（R≥1、94ヘルツまでのR1-R6の出力SNR）よりも（104ヘルツまでLMC≥1、信頼性の高いシグナリングSNR）」の約10 Hzの広い範囲を持っています。両方の信号対雑音比が高い（SNR LMC MAX = 142、SNR R MAX = 752）、記録ノイズが低かったとして、その違いは、細胞間の実際のエンコーディングの違いを反映している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig9large.jpg" target="_blank">の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。</a> 刺激開始後、録音典型的なLY大部分は5-6秒以内に治まる高速適応傾向を示します。その時から、細胞が（各点線のボックスは、これらの20を囲む）各1秒長い刺激提示に非常に一貫性のある応答を生成します。これらは（ 図8Bおよび図9B）重畳されたときの応答の再現性が明白になります。個々の応答は、薄い灰色の痕跡であり、その厚い暗いトレースを意味します。 神経雑音は、平均、各個々の応答4,5,9,37,38との差であるのに対し、平均応答は、 神経信号として取り出されます。周波数領域でそれぞれの信号対雑音比（ 図8C及び図9C）は 、パワースペクトルに信号とノイズデータチャンクをフーリエ変換し、対応する平均雑音パワースペクトル4との平均信号パワースペクトルを分割することにより得られました5,9,37,38。特徴的に、最大の信号対雑音比O自然な刺激に記録された神経の出力は（100 -千）高いF（。 例えば 、 図8C）、および非常に低い記録ノイズで最も安定した製剤中の値&gt;&gt;千に達することができます。通知はまた、温暖化は&#39;（ ブライト ≥1セル信頼性のシグナル4 SNR）の帯域幅」を展開します。例えば、 図8 及び図9中の2つのR1-R6sとの間の相対的な差は、それぞれ、10ヘルツ（84、20 O Cと94ヘルツ25 O Cで）です。 一つは、さらに、シャノンの式32を使用することによって、または三重外挿法39を介して応答&#39;エントロピー及び雑音エントロピーレートの差を計算することにより、その信号対雑音比の情報転送の各セルの速度を推定することができます。情報理論解析、およびそれらの使用および制限に関する詳細具体的には、この方法では、Sは、以前の刊行物7,8,39に示されています。 <img alt="図10" src="/files/ftp_upload/54142/54142fig10.jpg" /> 19℃。（A）R1-R6（灰色）およびLMC同じフライから同じ微小電極によって記録（黒）出力で繰り返さ自然主義的刺激へのキラーフライR1-R6感光体とLMCの 図10 の電圧応答 。電極が目に進めたとして、後シナプス前最初のシナプス後部と、。同じ自然な刺激パターンに（B）20の連続した前（上）とシナプス後（下）の応答（ライトグレーのトレース）は、最初の適応（Aの点線のボックス）の後に捕獲されました。個々の応答に、それぞれの違いは、ノイズを与えながら、その手段は、信号（上部の暗いトレース）です。 （C）に対応するシグナリットル対ノイズ比（SNR）は 、図8C及び図9Cのように計算しました。 LMC出力が&#39;（134ヘルツまでのR MAX≥1、SNR）R1-R6の出力よりも（234ヘルツまでのLMC MAX≥1、信頼性の高いシグナリングSNR）」の100 Hzの広い範囲について持っています。両方の信号対雑音比は、（SNR LMC MAX = 137、SNR R MAX = 627）高く、同じ微小電極がレコーディングに使用されたとして、その違いは、前と後シナプス神経出力の本当の違いを反映しています。これらの結果は、記録システムは、低ノイズを持っていた、と分析への影響が限界であったことを示唆している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54142/54142fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> Neuroethologicalビジョン研究 </p&gt; この方法はまた、視覚情報の処理の比較neuroethological研究を可能にする、異なる昆虫種の化合物の眼7,8,35,36（ 図10）から前およびシナプス後電位の応答を記録するために使用することができます。提示記録システムの場合、唯一の必要な適応を検討した種のための適切なサイズの開口部を有する新規作成ホルダー、それぞれです。これらの例示的な録音は女性キラーフライ（Coenosiaのattenuata）のからのものです。彼らは、 図9のショウジョウバエの対応のために使用されるように、同一の繰り返し光刺激に対するR1-R6の感光体とLMCの細胞内の電圧応答を示すが、19℃。でこの場合、前およびシナプス後データの両方を同じ場から記録しました。 1第1の横の薄層を進行（3 M KClで満たされた）同じ記録電極と、他の前に入力した後、正面網膜る。でも、クーラーの温度で- - 25°Cの 、Coenosiaデータでのショウジョウバエのデータと比較してより高速なダイナミクスと応答を示しています。広い周波数範囲にわたって信頼できるシグナリング（信号対雑音比&gt;&gt; 1）の範囲を拡大します。自然刺激の神経符号化におけるこのような機能的適応は高速空中狩猟行動を達成するために高精度な時空間情報を必要とCoenosiaの捕食ライフスタイル36、と一致しています。

Sharp微小電極は、生きたショウジョウバエの光受容体および視覚介在ニューロン出力の正確な電気生理学的特性評価を可能にします。ここでは、この方法を使用して、制御された光刺激に対する個々の細胞の高品質な電圧応答を記録する方法を示します。この手法は、昆虫の複眼における神経情報処理の研究に最適です。

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

この手順の全体的な目標は、制御された光刺激に対するショウジョウバエの光受容体と視覚介在ニューロンの細胞内電気応答を記録することです。この方法は、光刺激がそれを応答の1つにどのようにエンコードするか、または視覚情報と光受容体および介在ニューロンが光刺激からどのように抽出するかなど、ニューロコーディング分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、細胞内環境や情報サンプリングへのダメージをほとんど受けずに、研究からの長期にわたる高品質の録音を提供できることです。これが影響を与える可能性のあるデモンストレーションの特徴は、そのさまざまなステップを見ずに正しく実行することを学ぶのが難しいため、重要です。フィラメント状のホウケイ酸から、または標準的なピペットプーラーを使用して石英ガラス管から参照微小電極を引き出します。短く、緩やかなテーパーを実現してみてください。正確な設定は機器によって異なります。先端の細孔サイズは、実験のために壊れるため、重要ではありません。次に、同じガラス管から記録電極を引き出し、長さ10〜15ミリメートルの細い緩やかなテーパーを実現してみてください。光学顕微鏡では、電極をガラス面に複数の接着剤で取り付け、40倍の空気対物レンズを使用してその先端を検査します。優れた電極は、目に見えないほど小さな先端まで滑らかに先細りになり、その周りに連続した平行な暗い干渉パターンと明るい干渉パターンが見られます。実験の直前に、粒子フィルターに接続された5ミリリットルのシリンジを使用して、参照電極をフライリンガーで埋め戻し、細かいプラスチックチップを付けます。光受容体実験の場合は、記録電極に3モルの塩化カリウムを負荷し、その大きい方の端に液滴が形成されるまで待ちます。これにより、録音中の液体接合部からのノイズが最小限に抑えられます。ヒスタミン作動性LMCを使用するには、記録電極に3モルの酢酸カリウム、0.5ミリモルの塩化カリウムを充填して、セルの塩化物バッテリーへの影響を最小限に抑えます。5〜10日齢のハエを新鮮なハエの小瓶に入れることから始めます。若いハエはより壊れやすいですが、から記録することができます。電気生理学の最初のフライを選択します。大きな女性は一緒に働くのが最も簡単です。キャッチングチューブに入るときは、ピペットチップに上向きに登り、小さい方のチップをキャップする固有の傾向を利用します。次に、100ミリリットルの注射器と柔軟なプラスチックホースをピペットチップに接続し、ショウジョウバエを通すためだけに拡大し、もう一方の端をフライホルダーに取り付けられた大きなピペットチップに接続します。次に、シリンジから少量の空気を絞り、フライをフライホルダーに排出します。実体顕微鏡を覗き、フライホルダーの円錐形の端からハエの頭が突き出るまで、さらに空気を静かに投与します。ハエが胸部にしっかりと引っかかっていることを確認してください。次に、ハエを蜜蝋で固定します。ワックスヒーターの最低温度を使用して、透明に見えるワックスをきれいに溶かします。熱すぎるとワックスが燃え尽きてしまいます。角膜を避けて、吻と右目の角に少量の蜜蝋を塗って、ハエの頭を固定します。これらの2つのポイントをフライホルダーに固定します。ハエが焦げないように、この手順をすばやく完了してください。次に、ゴーグルを装着してマイクロナイフを製作します。非ステンレス製のカミソリの刃を2つのフラットグリップブレードホルダーで固定し、その鋭い刃の小さなストリップを割ります。理想的には、尖塔に似たかみそりの鋭いエッジを生成します。次に、慎重に、細部に細心の注意を払いながら、マイクロナイフを使用して、ハエの左目のいくつかのオンマチディアを開きます。たとえば、目の赤道のすぐ上の背側のキューティクルから4〜5オンマチディアを開きます。これにより、記録用微小電極の通路が得られます。これは非常に難しく、よくできたナイフが必要であり、練習して学ぶ必要があります。次に、角膜の小片を開口部からそっと取り出し、その下の網膜を露出させます。次に、ワセリンアプリケーターの細い毛を使用して、ワセリンの小さな塊で穴をすばやく覆います。このゼリーには、ピペットの壁内容量を減少させるという利点もあります。目を汚すと光学系がぼやけてしまうので避けてください。微小電極を操作するときは amplifier静電気を防ぐために、常にファラデーケージまたは防振テーブルの金属面に触れて接地してください。取り付けられたフライをフライ準備プラットフォームのポールに固定します。フライホルダーを回転させて、フライの左目が直接研究者に向くようにします。次に、小さなコースマイクロマニピュレーターを使用して、鈍い参照電極をハエのオセリを通してヘッドカプセルにそっと挿入します。ハエがまだ健康に見え、アンテナを動かしていることを確認してください。収録に値するほどの出来栄えでなければならない。次に、ゼリーコーティングされた開口部から鋭い記録微小電極を左目に打ち込みます。それが組織に入ると、電極の先端の位置はその反射率パターンによって明らかになるはずです。壊れやすい電極の先端は完璧にガイドしなければ壊れてしまいますが、これは非常に困難です。記録元の細胞の種類に応じて、ハエの頭の向きはわずかに異なるはずです。電極を所定の位置に配置した状態で、微小電極増幅器をオンにします。次に、冷光源の電源を切り、主電源からプラグを抜き、中央のアースに接続して、グランドループによる電気ノイズを最小限に抑えます。次に、グースネックライトガイドを調整して、カーデンアームシステムがフライで自由に動かせるようにします。次に、部屋の照明を消して、フライの準備を比較的暗い場所に置きます。次に、目の中の記録電極の抵抗を測定します。100〜260メガオームである必要があります。チップが詰まっている場合があり、アンプの容量性バズと電流パルス機能を使用してクリアできます。それでも問題が解決しない場合は、新しい電極を使用してください。次に、アンプを電流クランプまたはブリッジに設定し、電極間の電圧をゼロにします。フライを数分間暗順応させた後、ピエゾステッパーを使用するか、微細解像度のノブを穏やかに回転させて、記録電極の先端を0.1〜1ミクロン刻みで目に打ち込みます。各ステップで、1〜10ミリ秒のライトフラッシュで目を刺激します。ライトが点滅するたびに、電圧またはERGが一時的に低下します。電極の先端がラミナに入り、LMCを閉じると、ERGは反転します。その後、測定に進みます。非侵襲性により、個々の細胞のシグナル性能を自然に近い状態で研究することができます。R1-R6感光体による薄暗い光と明るい光に対する電圧応答を摂氏20度で測定しました。次に、R1-R6光受容体を25°CのLMCと比較しました。同じフライの2つの鋭い微小電極による細胞内記録は難しすぎて実行できないため、それぞれを異なるフライで測定しました。応答の再現性は、データが重ね合わせられると明らかになります。周波数領域の信号対雑音比は、信号とノイズのデータチャンクをパワースペクトルに変換し、平均信号パワースペクトルを対応する平均ノイズパワースペクトルで除算して4年で求めました。その結果、最適な調製物ではシグナルに非常に敏感になります。この技術は、多くの種の記録に使用できます。コエノキアのハエには、摂氏19度で同じ自然で反復的な光刺激が与えられました。データは、記録電極を前進させることにより、同じフライからシナプス前とシナプス後に取得されました。録音の速いダイナミクスは、この種の捕食性と一致しています。このテクニックをマスターすると、適切に実行されれば、常に長く高品質の録音が可能になります。この手順を試みる際には、ピアノを弾くことを学ぶようなものだと認識することが重要です。練習すればするほど、より良い結果が得られます。この手順に続いて、薬理学的介入などの他の方法を実行して、応答の形成における神経調節因子の役割などの追加の質問に答えることができます。この技術は、その開発後、神経生物物理学の分野の研究者が、光情報、捕捉、転送、および光変換装置およびそれに続く生物科学における腐食性生化学反応を最適化する方法を探求する道を開きました。このビデオを見た後、ショウジョウバエを細胞内実験用に準備する方法と、その光受容体と介在ニューロンからの神経応答を目覚めさせる方法についてよく理解しているはずです。

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