排水処理プロセスの有効性の評価のための化学的および生態毒性メソッドのバッテリーの使用は、エストロゲン効力を削除します

分析化学、in vitroおよびin vivoの手法を含む、ここで概説する一連の試験の全体的な目的は、エストロゲン性汚染物質を除去するための新興および斬新な排水処理技術の有効性を判定することです。これらの手法は、例えば、排水のエストロゲン活性が変動している際に、最も効果的な排水処理プロセスを選択する場合など、環境工学における重要な疑問への回答に役立ちます。これらの技術の主な利点は、活性化合物の非常に低い濃度に対しても感度が高く、水生生物を保護するための最適な技術を証明できる点にあります。

手順の実演を行うのは、博士研究員のChris Green博士、大学院生のAngela Pinzon、研究員のAlice Baynes博士、およびシニアリサーチテクニシャンのNicola Beresfordです。SPEプロセスでは、試料の汚染を防ぐため、清潔さと整理整頓に細心の注意を払う必要があります。すべてのチューブ、タップ、フリットをメタノールで事前に洗浄してください。

サンプルの分析を開始する前に、移送ラインを抽出マニホールドに取り付け、システム全体を脱イオン水で洗浄します。サンプルの分析を行う際は、まず使い捨てのバルブライナーを取り付け、次にスチレンジビニルベンゼンSPEカートリッジを取り付けます。次に、カートリッジをコンディショニングするため、各リザーバーに5 mLの酢酸エチルをピペットで加えます。

このステップでは、SPEが密封されていることを確認してください。次に、真空ポンプをスイッチオンにし、流速を 10 millimeters per minute に設定します。カートリッジが乾燥する前に、5 milliliters のメタノールをロードし、続いて 5 milliliters の水をロードします。

SPEカートリッジを乾燥させないことが非常に重要です。水がほとんど通り抜けた後、ポンプのスイッチを切り、各カートリッジのリザーバーに水を補充します。次に、カートリッジのリザーバーとガラス製サンプルボトルを1/8インチのPTFEチューブで接続します。

次に、真空の流速を10 mL/min以下に切り替え、サンプル全体をカートリッジに通過させます。続いて、カートリッジ内部の色が変化するまで、SPEカートリッジを十分に乾燥させます。乾燥には真空またはガス流を使用してください。

次に、清潔で乾燥した10 mLのガラス製回収バイアルをラックにセットし、そのラックを抽出マニホールド内に配置します。各ライナーがバイアルの上に位置していることを確認してください。サンプルリザーバーにジクロロメタンを4 mL×2回、計8 mL充填し、真空ポンプのスイッチを入れて、液体をSPEに通過させ、回収バイアルに回収させます。

次に、濃縮器を用いて、すべての回収バイアルの容量を1 mLまで減らします。各サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、窒素ブローダウン装置を用いてさらに100 µLまで濃縮します。プロセスの次の段階では、GPCを用いて高分子干渉物質を除去します。

まず、溶出させたサンプル抽出液 95 µL を、GPCを装着したHPLCに注入します。濃縮機および窒素ブローダウン装置を用いて、GPC抽出液を 200 µL まで濃縮し、その後、ヘキサンで 2 mL までメスアップします。次に、使い捨てバルブライナー、アミノパープルカートリッジ、およびカートリッジリザーバーをSPEマニホールドに取り付け、10 mL ガラス回収バイアルを介して接続します。

次に、各カートリッジに2 mLのヘキサンをロードしてコンディショニングを行い、溶媒を廃棄します。続いて、GPCサンプル抽出液をリザーバーに入れ、吸引します。抽出液の回収分は脇に置いておき、洗浄液を回収するためにバイアルをラックに戻します。

次に、30%（v/v）酢酸エチル・ヘキサン溶液2 mLをカートリッジに通します。さらに酢酸エチル・ヘキサン溶液2 mLを加え、洗浄液の回収分を廃棄し、10 mL回収バイアルをラックに戻します。続いて、50%（v/v）酢酸エチル・アセトン溶液2 mLをリザーバーに加え、2 mL/min以下の低流量でポンプを開始します。

液体が通過した後、50%酢酸エチルをさらに2 mLリザーバーに加えます。次に、濃縮機を使用して、抽出液の量を1 mLまで減少させます。その後、サンプルをより小さなガラスバイアルに移し、窒素ブローダウン装置を用いて、抽出液をほぼ完全に蒸発させます。100 µLのメタノールを加え、サンプルを十分に混合した後、0.3 mLインサート付きのオートサンプラーバイアルに移します。

次に、抽出液のLC-MS/MS分析を行います。アッセイ開始の前日に、新鮮な増殖培地を調製し、使用するHER株のtenaxドックを接種します。翌日、テスト化学物質または流出液抽出物の100 µL連続希釈系列およびエタノール中でのE2標準曲線を作成し、アッセイの準備をします。

次に、10 µLずつ分注して、ラベル付きの滅菌済み96ウェルプレートに移します。その後、エタノールを蒸発させるため、プレートの蓋を開けたままにします。続いて、0.5 mLのCPRG溶液を含む増殖培地50 mLを調製します。

24時間培養した酵母培養液を用い、620 nmで濁度を測定して細胞密度を推定します。次に、50 mLのアッセイ培地に4,000万個の酵母細胞を添加します。接種したアッセイ培地を滅菌済みのトラフに移し、マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに培地を200 µLずつ分注します。

アッセイプレートの蓋を閉じ、エッジをテープで封止し、プレートシェーカーを用いて2分間激しく振盪します。次に、自然換気付きの恒温槽内で32 Celsiusでインキュベートします。3日間のインキュベーション後、再度振盪を行い、その後、酵母を約1時間静置して沈殿させます。

最後に、サンプルの光吸収度を540および620ナノメートルで測定します。汚泥処理プロセスを活性化させている従来の廃水処理施設からの水サンプルを、ネガティブイオンエレクトロスプレーLCMSを用いて分析したところ、エチニルエストラジオールが予測無影響レベルを超える濃度で検出されました。粒状活性炭（GAC）などの高度水処理を用いることで、エチニルエストラジオールのレベルを大幅に低減することが可能でした。

定量分析を可能にするため、すべての排水抽出物は同位体標識内部標準物質（赤色のピーク）を用いて分析されました。酵母エストロゲン・スクリーンアッセイは、標準物質であるエストラジオールに対して明確な感度を示しましたが、本質的にブランクであるエタノールに対しては反応を示しませんでした。酵母スクリーン細胞は活性汚泥法処理排水に対して明確な反応を示した一方、GAC処理排水では反応が減衰したものの、依然としてブランクよりも生物学的に活性でした。

この新しい廃水処理技術を用いて、青色で示されたエタノールエストラジール濃度と、緑色で示されたエストロゲン活性の両方が、過酸化水素とTAMLの併用処理によって有意に減少しました。廃水処理施設は、エストロゲン性物質による地表水の汚染の主要な発生源となっています。これらの処理水を改善するための水処理プロセスの新しい手法には、エストロゲン活性の詳細な試験が必要です。

このビデオを視聴することで、水試料中のエストロゲン活性を測定するために必要な、一連の化学分析および生態毒性試験について十分に理解することができます。試料および抽出物の汚染を最小限に抑えるため、慎重に取り扱うことが極めて重要です。例えば、一般的に使用されているプラスチックにはエストロゲン化合物が含まれているため、化学的な汚染を確認するための陰性対照（ネガティブコントロール）と、抽出法の有効性およびスパイクしたエストロゲンの良好な回収率を確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含めることが不可欠です。