排水処理プロセスの有効性の評価のための化学的および生態毒性メソッドのバッテリーの使用は、エストロゲン効力を削除します

分析化学、in vitroおよびin vivo法など、ここで概説する一連の試験の全体的な目標は、エストロゲン汚染物質を除去するための新興および新規の廃水処理技術の有効性を判断することです。これらの方法は、例えば、移動するエストロゲン様の廃水処理能力において最も効果的な廃水処理プロセスを選択する場合など、環境工学における重要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の主な利点は、非常に低濃度の活性化合物に敏感であることであり、したがって、水生生物を保護するための最良の技術を証明しています。

ポスドク研究員のクリス・グリーン博士、大学院生のアンジェラ・ピンゾン博士、研究員のアリス・ベインズ博士、上級研究技術者のニコラ・ベレスフォードが手順を実演します。SPEプロセスでは、サンプルの汚染を防ぐために、清浄度と秩序性に細心の注意を払う必要があります。すべてのチューブ、タップ、フリットをメタノールで事前に洗浄します。

サンプルを泳動する前に、トランスファーラインを抽出マニホールドに取り付け、システム全体を脱イオン水ですすいでください。サンプルを実行するには、まず使い捨てバルブライナーを取り付け、次にスチレンジビニルベンゼンSPEカートリッジを取り付けます。次に、5ミリリットルの酢酸エチルを各リザーバーにピペットで入れ、カートリッジをコンディショニングします。

このステップでは、SPEが密封されていることを確認してください。次に、毎分10mmの流量で真空ポンプのスイッチを入れます。カートリッジが乾く前に、5ミリリットルのメタノールをロードし、続いて5ミリリットルの水をロードします。

SPEカートリッジが乾かないようにすることが非常に重要です。水がほとんど流れ込んだら、ポンプのスイッチを切り、各カートリッジリザーバーに水を補充します。次に、カートリッジリザーバーとガラスサンプルボトルの間に1/8インチPTFEチューブを接続します。

次に、真空を毎分10ミリリットル未満の流量に切り替え、サンプル全体がカートリッジを通過するようにします。次に、SPE カートリッジを、カートリッジの内容物の色が変わるまで完全に乾かします。真空またはガス流を使用してください。

次に、清潔で乾燥した10ミリリットルのガラス収集バイアルをラックにロードし、ラックを抽出マニホールド内に置きます。各ライナーがバイアルの上にあることを確認します。サンプルリザーバーに4ミリリットルの2倍、合計8ミリリットルのジクロロメタンをロードし、真空ポンプのスイッチを入れ、液体をSPEを通過して収集バイアルに流します。

次に、濃縮器を使用して、すべての収集バイアルの容量を1ミリリットルに減らします。各サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、窒素ブローダウン装置を使用してさらに100マイクロリットルまで濃縮します。プロセスの次の段階は、GPCを使用して高分子干渉を除去することです。

まず、逃れたサンプル抽出物95マイクロリットルをGPC搭載のHPLCに注入します。濃縮器と窒素ブローダウン装置を使用して、GPC抽出物を200マイクロリットルまで濃縮し、次にヘキサンで最大2ミリリットルまで充填します。次に、使い捨てバルブライナー、アミノパープルカートリッジ、カートリッジリザーバーをSPEマニホールドに取り付け、10ミリリットルのガラスコレクションバイアルに通します。

次に、各カートリッジに2ミリリットルのヘキサンを装填し、それらを調整して溶媒を廃棄します。次に、GPCサンプル抽出物をリザーバーにロードし、吸引します。抽出物コレクションを脇に置き、バイアルをラックに交換して洗浄を収集します。

次に、体積比30パーセントの酢酸エチルとヘキサンの2ミリリットルをカートリッジに通します。次に、さらに2ミリリットルの酢酸エチルとヘキサンを追加し、洗浄液のコレクションを廃棄して、10ミリリットルのコレクションバイアルをラックに戻します。次に、容量の50パーセントの酢酸エチルとアセトンを2ミリリットルリザーバーに追加し、毎分2ミリリットル未満の低流量でポンプを始動します。

液体が引き込まれたら、さらに2ミリリットルの50%酢酸エチルをリザーバーに追加します。次に、濃縮器を使用して抽出物の量を1ミリリットルに減らします。次に、サンプルを小さなガラスバイアルに移し、窒素ブローダウン装置を使用して抽出物を蒸発させ、100マイクロリットルのメタノールを追加し、サンプルをよく混合し、0.3ミリリットルのインサートを備えたオートサンプラーバイアルに移します。

次に、抽出物のLC-MS/MS分析を行います。アッセイ開始の前日に、新鮮な増殖培地を調製し、HER使用株のテナックスドックを接種します。翌日、試験化学物質または廃液抽出物の100マイクロリットルの連続妄想を作成し、次にエタノールでE2標準曲線を作成することにより、アッセイの準備をします。

次に、10マイクロリットルのアリコートをラベル付きの滅菌96ウェルプレートに移します。次に、プレートを蓋をせずに放置して、エタノールを蒸発させます。次に、50ミリリットルの成長培地と0.5ミリリットルのCPRG溶液を調製します。

24時間酵母培養から、620ナノメートルの濁度を測定し、細胞密度を推定します。次に、50ミリリットルのアッセイ培地に4,000万個の酵母細胞を加えます。接種したアッセイ培地を滅菌トラフに移し、マルチチャンネルピペットを使用して200マイクロリットルの培地をアッセイプレートの各ウェルに移します。

アッセイプレートの蓋を元に戻し、端をテープでシールし、プレートシェーカーを使用してアッセイプレートを2分間激しく振ってください。次に、プレートを摂氏32度で、自然に換気された加熱キャビネットでインキュベートします。3日間のインキュベーション後、再びシェイクを繰り返し、酵母を約1時間落ち着かせます。

最後に、サンプルによる光吸収剤を540ナノメートルと620ナノメートルで測定します。従来の廃水処理計画からの水サンプルは、そのスラッジプロセスを活性化し、マイナスイオンエレクトロスプレーLCMSを使用して分析され、エチニルエストラジオールは、予測された影響レベルを超える濃度で存在していました。粒状活性炭(GAC)などの高度な水処理を使用すると、エチニルエストラジオールレベルを大幅に低下させることができました。

すべての廃水抽出物は、定量化のために同位体標識された内部標準であるレッドピークで分析しました。酵母からエストロゲンへのスクリーニングアッセイは、標準的なエストラジオールに対して明らかに敏感でしたが、本質的にブランクであるエタノールに対する反応を選択しませんでした。酵母スクリーン細胞は活性汚泥プロセス廃液に明らかに反応しましたが、GAC処理廃液は応答が減少しましたが、ブランクよりも生物学的に活性でした。

この新しい廃水処理技術を用いて、過酸化水素とTAML処理の組み合わせにより、エタノールエストラジオール濃度(青)とエストロゲン活性(緑)の両方が大幅に減少しました。廃水処理プラントは、エストロゲン物質による地表水汚染の主な原因です。これらの廃液を改善するための水処理プロセスの新しい方法には、エストロゲン活性の詳細な試験が必要です。

このビデオを見れば、水サンプル中のエストロゲン活性を測定するために必要な一連の化学的および生態毒性試験についてよく理解できるはずです。サンプルや抽出物の汚染を最小限に抑えるために、サンプルや抽出物を慎重に取り扱うことが非常に重要です。例えば、一般的に使用されるプラスチックにはエストロゲン化合物が含まれているため、化学的汚染をチェックするためのネガティブコントロールと、抽出方法が機能していること、およびスパイクされたエストロゲンの良好な回収があることを確認するためのポジティブコントロールを含めることが不可欠です。