Name: 排水処理プロセスの有効性の評価のための化学的および生態毒性メソッドのバッテリーの使用は、エストロゲン効力を削除します (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶ排水処理プロセスの有効性評価のための化学的・生態毒性メソッドのバッテリー。エストロゲン効力を除去する新技術の評価手法を解説し、水生生物保護に貢献する最適技術の選定に役立つ。

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>jove_content<この論文で紹介されているプロジェクトは、セバーン・トレント・ウォーターとロンドンのブルネル大学によって資金提供されました。著者は、フィールドおよびラボの支援を提供してくれたAlan HenshawとJohn Churchleyに感謝します。T.J.C.は、ハインツ基金の支援に感謝します。M.R.M.は、スタインブレナー博士フェローシップを授与してくれたスタインブレナー研究所と、プレジデンシャルフェローシップを授与してくれたカーネギーメロン大学に感謝します。

<ol><li>Bergman, Å, Heindel, J., Jobling, S., Kidd, K., Zoeller, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-science+of+endocrine+disrupting+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Lett%22%5BJournal%5D)">State-of-the-science of endocrine disrupting chemicals.</a> Toxicol. Lett. 211, (2012).</li>
<li>Rodgers-Gray, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+juvenile+roach+%28Rutilus+rutilus%29+to+treated+sewage+effluent+induces+dose-dependent+and+persistent+disruption+in+gonadal+duct+development%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Exposure of juvenile roach (Rutilus rutilus) to treated sewage effluent induces dose-dependent and persistent disruption in gonadal duct development.</a> Environ. Sci. Technol. 35 (3), 462-470 (2001).</li>
<li>Jobling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sexual+maturation+and+gamete+production+in+wild+roach+%28Rutilus+rutilus%29+living+in+rivers+that+receive+treated+sewage+effluents%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+reprod%22%5BJournal%5D)">Altered sexual maturation and gamete production in wild roach (Rutilus rutilus) living in rivers that receive treated sewage effluents.</a> Biol. reprod. 66 (2), 272-281 (2002).</li>
<li>Tyler, C. R., Der Eerden, B. V. an, Jobling, S., Panter, G., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+vitellogenin%2C+a+biomarker+for+exposure+to+oestrogenic+chemicals%2C+in+a+wide+variety+of+cyprinid+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+B%2C+Biochem.+Syst.+Environ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of vitellogenin, a biomarker for exposure to oestrogenic chemicals, in a wide variety of cyprinid fish.</a> J. Comp. Physiol. B, Biochem. Syst. Environ. Physiol. 166 (7), 418-426 (1996).</li>
<li>Jobling, S., Nolan, M., Tyler, C. R., Brighty, G., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+sexual+disruption+in+wild+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Widespread sexual disruption in wild fish.</a> Environ. Sci. Technol. 32 (17), 2498-2506 (1998).</li>
<li>Jobling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+exposures+to+steroid+estrogens+in+U.K.+rivers+correlate+with+widespread+sexual+disruption+in+wild+fish+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Predicted exposures to steroid estrogens in U.K. rivers correlate with widespread sexual disruption in wild fish populations.</a> Environ. Health Perspect. 114, Suppl 1. 32-39 (2006).</li>
<li>Baynes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+treatment+of+wastewater+reduces+endocrine+disruption+in+wild+fish+-+a+comparative+study+of+tertiary+and+advanced+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Additional treatment of wastewater reduces endocrine disruption in wild fish - a comparative study of tertiary and advanced treatments.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (10), 5565-5573 (2012).</li>
<li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+surfactants+and+some+of+their+degradation+products+assessed+using+a+recombinant+yeast+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ. Toxicol. Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li>
<li>Grover, D. P., Balaam, J., Pacitto, S., Readman, J. W., White, S., Zhou, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disrupting+activities+in+sewage+effluent+and+river+water+determined+by+chemical+analysis+and+in+vitro+assay+in+the+context+of+granular+activated+carbon+upgrade%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Endocrine disrupting activities in sewage effluent and river water determined by chemical analysis and in vitro assay in the context of granular activated carbon upgrade.</a> Chemosphere. 84 (10), 1512-1520 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+determination+of+steroid+oestrogens+in+waters+using+chromatography+and+mass+spectrometry+%282008%29+Methods+for+the+Examination+of+Waters+and+Associated+Materials%22">The determination of steroid oestrogens in waters using chromatography and mass spectrometry (2008) Methods for the Examination of Waters and Associated Materials</a>. (2008), Environment Agency. Bristol, UK. (2008).</li>
<li>Van den Belt, K., Berckmans, P., Vangenechten, C., Verheyen, R., Witters, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+on+the+in+vitro%2Fin+vivo+estrogenic+potencies+of+17beta-estradiol%2C+estrone%2C+17alpha-ethynylestradiol+and+of+17beta-estradiol%2C+estrone%2C+17alpha-ethynylestradiol+and+nonylphenol%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat.+toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparative study on the in vitro/in vivo estrogenic potencies of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and of 17beta-estradiol, estrone, 17alpha-ethynylestradiol and nonylphenol.</a> Aquat. toxicol. 66 (2), 183-195 (2004).</li>
<li>Mills, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+ecotoxicity+of+17%CE%B1-ethinylestradiol+using+TAML%2Fperoxide+water+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Removal of ecotoxicity of 17α-ethinylestradiol using TAML/peroxide water treatment.</a> Sci. Rep. 5, 10511(2015).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22EN+14962%3A2006+Water+quality+-+Guidance+on+the+scope+and+selection+of+fish+sampling+methods%22">EN 14962:2006 Water quality - Guidance on the scope and selection of fish sampling methods</a>. , British Standards Institute. London, UK. (2006).</li>
<li>Beresford, N., Brian, J. V., Runnalls, T. J., Sumpter, J. P., Jobling, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+activity+of+tropical+fish+food+can+alter+baseline+vitellogenin+concentrations+in+male+fathead+minnow+%28Pimephales+promelas%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic activity of tropical fish food can alter baseline vitellogenin concentrations in male fathead minnow (Pimephales promelas).</a> Environ. Toxicol. Chem. 30 (5), 1139-1145 (2011).</li>
<li>Nolan, M., Jobling, S., Brighty, G., Sumpter, J. P., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+histological+description+of+intersexuality+in+the+roach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fish+Biol%22%5BJournal%5D)">A histological description of intersexuality in the roach.</a> J. Fish Biol. 58 (1), 160-176 (2001).</li>
<li>Dascenzo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+of+natural+estrogen+conjugates+in+municipal+sewage+transport+and+treatment+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Fate of natural estrogen conjugates in municipal sewage transport and treatment facilities.</a> Sci. Total Environ. 302 (1-3), 199-209 (2003).</li>
<li>Gomes, R. L., Birkett, J. W., Scrimshaw, M. D., Lester, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+natural+and+synthetic+steroid+estrogens+and+their+conjugates+in+aqueous+matrices+by+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Environ.+Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of natural and synthetic steroid estrogens and their conjugates in aqueous matrices by liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Int. J. Environ. Anal. Chem. 85 (1), 1-14 (2005).</li>
<li>Metcalfe, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+potency+of+chemicals+detected+in+sewage+treatment+plant+effluents+as+determined+by+in+vivo+assays+with+Japanese+medaka+%28Oryzias+latipes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Estrogenic potency of chemicals detected in sewage treatment plant effluents as determined by in vivo assays with Japanese medaka (Oryzias latipes).</a> Environ. Toxicol. Chem. 20 (2), 297-308 (2001).</li>
<li>Stalter, D., Magdeburg, A., Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozonation+and+activated+carbon+treatment+of+sewage+effluents%3A+Removal+of+endocrine+activity+and+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Ozonation and activated carbon treatment of sewage effluents: Removal of endocrine activity and cytotoxicity.</a> Water Res. 45 (3), 1015-1024 (2011).</li>
<li>Caldwell, D. J., Mastrocco, F., Anderson, P. D., Länge, R., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted-no-effect+concentrations+for+the+steroid+estrogens+estrone%2C+17%CE%B2-estradiol%2C+estriol%2C+and+17%CE%B1-ethinylestradiol%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Predicted-no-effect concentrations for the steroid estrogens estrone, 17β-estradiol, estriol, and 17α-ethinylestradiol.</a> Environ. Toxicol. Chem. 31 (6), 1396-1406 (2012).</li>
<li>Gardner, M., Comber, S., Scrimshaw, M. D., Cartmell, E., Lester, J., Ellor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+hazardous+chemicals+in+wastewater+treatment+works+effluents%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">The significance of hazardous chemicals in wastewater treatment works effluents.</a> Sci. Total Environ. 437, 363-372 (2012).</li>
<li>Filby, A. L., Shears, J. A., Drage, B. E., Churchley, J. H., Tyler, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+advanced+treatments+of+wastewater+effluents+on+estrogenic+and+reproductive+health+impacts+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of advanced treatments of wastewater effluents on estrogenic and reproductive health impacts in fish.</a> Environ. Sci. Technol. 44 (11), 4348-4354 (2010).</li>
<li>Magdeburg, A., Stalter, D., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+effluent+toxicity+assessment+at+a+wastewater+treatment+plant+upgraded+with+a+full-scale+post-ozonation+using+aquatic+key+species%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Whole effluent toxicity assessment at a wastewater treatment plant upgraded with a full-scale post-ozonation using aquatic key species.</a> Chemosphere. 88 (8), 1008-1014 (2012).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAML+oxidant+activators%3A+a+new+approach+to+the+activation+of+hydrogen+peroxide+for+environmentally+significant+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">TAML oxidant activators: a new approach to the activation of hydrogen peroxide for environmentally significant problems.</a> Acc. Chem. Res. 35 (9), 782-790 (2002).</li>
<li>Collins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+Ligands+for+Oxidizing+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Designing Ligands for Oxidizing Complexes.</a> Acc. Chem. Res. 27 (9), 279-285 (1994).</li>
<li>Truong, L., Denardo, M. A., Kundu, S., Collins, T. J., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Assays+as+Developmental+Toxicity+Indicators+in+The+Design+of+TAML+Oxidation+Catalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Assays as Developmental Toxicity Indicators in The Design of TAML Oxidation Catalysts.</a> Green Chem. 15 (9), 2339-2343 (2013).</li>
<li>Murk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+estrogenic+potency+in+wastewater+and+surface+water+with+three+in+vitro+bioassays%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Toxicol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of estrogenic potency in wastewater and surface water with three in vitro bioassays.</a> Environ. Toxicol. Chem. 21 (1), 16-23 (2002).</li>
<li>Test No 455: The Stably Transfected Human Estrogen Receptor-alpha Transcriptional Activation Assay for Detection of Estrogenic Agonist-Activity of Chemicals. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+4%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Kolle, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+house+validation+of+recombinant+yeast+estrogen+and+androgen+receptor+agonist+and+antagonist+screening+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+in+Vitro%22%5BJournal%5D)">In house validation of recombinant yeast estrogen and androgen receptor agonist and antagonist screening assays.</a> Toxicol in Vitro. 24 (7), 2030-2040 (2010).</li>
<li>Lee, O., Tyler, C. R., Kudoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+transient+expression+assay+for+detecting+environmental+oestrogens+in+zebrafish+and+medaka+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a transient expression assay for detecting environmental oestrogens in zebrafish and medaka embryos.</a> BMC Biotechnology. 12, 32(2012).</li>
<li>Brian, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+prediction+of+the+response+of+freshwater+fish+to+a+mixture+of+estrogenic+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Accurate prediction of the response of freshwater fish to a mixture of estrogenic chemicals.</a> Environ Health Perspect. 113 (6), 721-728 (2005).</li>
<li>Test No 229: Fish Short Term Reproduction Assay. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
<li>Test No 230: 21-day Fish Assay: A Short-Term Screening for Oestrogenic and Androgenic Activity and Aromatase Inhibition. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guidelines+for+the+Testing+of+Chemicals%2C+Section+2%22">OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2</a>. , OECD Publishing. Paris. (2009).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

廃水処理プラントは、EDCと地表水汚染の主要経路です。 、従来の高度なまたは新興の処理プロセスの内分泌活性の除去の有効性の評価は、化学的および生物学的アッセイの様々なを使用する必要があります。非標的および標的分析を用いて化学分析は、個々の成分の除去の有効性に関する定性的または定量的なデータを提供し、したがって、評価が環境基準に対して行わまたは分析の化合物または化合物の混合物のための効果濃度を予測しないことを可能にします。 治療後の物質の不完全な鉱化作用に起因する変換生成物の生成と廃水中の未知の生物学的に活性な成分の存在だけでは、化学試験の有用性を制限します。 in vivoおよび分析化学者との併用のin vitroバイオアッセイでの組み合わせRYスクリーニングは、新興の排水処理プロセスによるEDCの除去の有効性を決定するための有用なツールボックスを提供します。伝統的な水質パラメータおよび他の毒性学的および微生物学的エンドポイントと一緒に行ったこれらのテストは、現在および新興の排水処理技術の重要な評価を可能にします。 ベースのエストロゲン画面（ 例えば 、YES）は、化学物質や廃水のエストロゲン効力を決定するためのin vitroアッセイだけではないという酵母を注意することが重要です。安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞に基づくアッセイの数は、例えば、ER-CALUX 27およびヒト乳癌細胞又は子宮頸部腫瘍細胞と28hERα-たHeLa-9903はそれぞれ、あまりにも開発されてきました。 YESが類似哺乳類細胞ベースのアッセイと比較され、再現性の同等の高いレベルを有することが見出された、真陽性および真陰性のエストロゲン識別率29、althoぐふ時々 27わずかに感受性が低いことが考えられています。酵母ベースのレポーターアッセイの1つの利点は、それほど厳しくバイオ制御対策や滅菌技術を必要とする哺乳動物細胞培養での豊富な経験のないラボでYESをより容易に（YES必要に応じて作業台の上に行うことができます）、採用することができるということです。ヒトの細胞に基づくアッセイはまた、YESで使用される標準的なインキュベーターとマイクロプレートリーダーに比べてCO 2インキュベーターとルミノメーターを必要とします。業種を強調-二つの酵母ベースのエストロゲンレポーターアッセイ（YES、 サッカロマイセス・セレビシエおよびA-YES、Arxulaのadeninivorans）は、現在、ISO 19040「水のエストロゲンポテンシャルの決意と排水水質」の検証のための研究室間のコースを受けていますこれらの技術への関心。 潜在的な汚染を含んで記載されている方法の多くの制限があります。フィールドや実験室環境からまたはヒトの汚染（ 例えば、可塑剤、界面活性剤、パーソナルケア製品）によって発信エストロゲン様物質とサンプリング、試料保存および分析中のサンプル。 YESアッセイ（または他の細胞ベースのレポーターアッセイ）における汚染のこのタイプは、バックグラウンドを上昇し、アッセイの使用に影響を与えます。ペットボトルに格納された水サンプルまたは溶媒が簡単に偽陽性を引き起こす可能性があります。 LCMS / MSとYESアッセイの両方が検出可能なレベルにエストロゲンを濃縮するためにSPEを必要とする偽陰性も懸念されています。マトリックスは、SPE吸着剤と溶出溶媒の選択は、抽出効率溶出化合物の種類に影響を与えることができます。高極性及び塩基性化合物は、難吸着剤によって保持されるように、このプロトコールに記載された条件を使用して抽出するためのC18 SPEカートリッジを使用して、負のバイアスを生成することができます。また、このプロトコルは、メタンから溶出YESの溶離液の再構成を必要としますオールは、揮発性化合物の損失をもたらす出資者の窒素を乾燥するまで蒸発によりエタノールへ。その結果、プロトコルは、試験した試料の過小評価エストロゲン活性を提供することができます。彼らは、抽出されていないか、またはそれらが蒸発により失われるため、未知または予期しない化合物は、見逃される可能性があるとして、YESアッセイを検討する際にこれらの制限は特に重要です。また、LCMS / MS技術は、標識された内部標準の使用は回復のために補正することができます。このアプローチはYESアッセイで使用することができません。 流出物のin vivo試験の重大な制限は、in vitroの方法に比べて評価のために必要とされる高コストと時間が含まれます。現在、エストロゲン活性を検出するために魚の胚試験の使用が制限されます。しかし、将来のアプリケーションを持っている可能性があり、魚の胚30を 、輝くエストロゲン応答遺伝子導入を生産するといくつかの成功がありました。このprotocで使用ファットヘッドミノー（オール）一般的な実験の種であり、男性の魚でVTGの誘導は、エストロゲン暴露と流出廃水のエストロゲン22または他のエストロゲン様化合物または混合物31の定量化可能な測定値の十分に立証されたバイオマーカーです。内分泌かく乱化学物質のためのOECDテストガイドラインは、VTGは、すべての3種におけるエストロゲン暴露の敏感なバイオマーカーであることで、大人のファットヘッドミノー、メダカとゼブラフィッシュ32,33を使用して検証されています。しかし、VTG誘導は直接ひどく陰陽ゴキブリ3に見られるように、生殖障害に相関し、したがって、排水曝露の生態影響しません。一方、ゴキブリは、それらの大きなサイズ、長い世代時間（2〜3年は、性的成熟に達するために）、生殖スタイルに生態毒性の研究のための古典的な「実験室の種」ではありません。グループ産卵（繁殖）が中以外（年に一度行われ、雌から雄性を識別するための難しさ産卵期）。しかし、この通常gonochoristic種は非常にうまくによるエストロゲン排水廃液の下流、オスの魚は彼らの内分泌学に（ 例えば 、女性特有の彼らの血中ビテロゲニンの存在）および組織病 ​​理学（ovotestisの複数形の摂動を示した発見に、英国で研究されています-精巣および/ ​​または雌の生殖管）5,6に卵を開発。したがって、これらのプロトコルの将来の応用として、ローチ（または類似種）は排水の質（および減少エストロゲン）に真の改善が進んで処理された排水を受ける河川に見られているかどうかを示すために有用な野生センチネル種である可能性があります。彼らはまた、パイロット規模プラント7の技術的改良の流出物を監視するために配管システムの端部に用いることができます。 生体内排水評価でで使用する種検討する場合に比べて、実験室の種を使用して、比較的迅速かつ制御されたテストの間にトレードオフが存在します長いフィールド基づいていますが、在来種を使用してテストし、より環境に関連します。しかし、in vivoでの評価において 、このようなコスト高であり、唯一の化学分析およびin vitroアッセイを使用して評価を次のテストの最終セットとして考慮されるべきです。 記載されたプロトコル内の重要なステップは、準備とサンプルやガラス製品の取り扱いを含むプラスチックやとサンプルの接触を制限するなどの環境汚染物質からのサンプルの汚染を避けるために（ すなわち、ボトルやサンプリング装置は、適切な界面活性洗浄剤で前処理する必要があります）偽陽性を生成することができる他の材料。水槽や魚露光システムを設計し、構築するとき、これは同様に重要です。理想的には水槽（住宅ストック及びエクスポージャーの間）は、最小限の汚染リスクが低い吸着32を有する材料から構築されるべきです。ステンレス鋼は、流出物または水保持タンクに使用することができます。ガラス構造のタンクを水槽に好適であるのに対し、（これはまた、魚の容易観察を提供するように）。低グレードのプラスチックパイプまたはチューブの使用は、32を避けるべきである、PVC 34とABS &#39;が適切に味付け」の場合に使用することができ、 すなわち、使用前に少なくとも12時間、希釈水を実行中の任意の汚染物を浸出するために放置しました。医療グレードのシリコンチューブはタンクに化学薬品や排水/希釈水の蠕動ポンプの送達のために、私たちの施設で正常に使用されています。だけでなく、水泳システムの構築と運営にエストロゲン汚染を考えると、魚の食生活を考えることも重要です。多くの可否魚食品は、魚のエストロゲンであることが見出されています。したがって、以前の研究のこれらのタイプでそれらを使用する（ベレスフォードら 14を参照してください、酵母エストロゲン画面で、 例えば ）活性のために任意の食品をテストすることが重要です。 トラブルシューティング品質保証サンプルは、複数の旅行、研究室を含む、溶媒ブランクは偽陽性と偽陰性の結果を排除するためにポジティブコントロールと実際のサンプルと一緒に分析している場合は簡略化されて記載された化学分析YESまたはアッセイプロトコールの。陽性（ 例えば 、EE2）と負（希釈水のみ）コントロールも常に（期待生物バイオマーカーまたはエンドポイント（ すなわち 、VTGまたは組織病 ​​理学）の感度を確認し、任意の予想外の汚染を検出することができるようにインビボアッセイにおいて使用されるべきです例えば、実験のセットアップ、ダイエット、または希釈水）から。プロトコル内の任意の変更は、任意の調査を実施する前に検証する必要があります。 WWTP流出液を経由して環境に入るエストロゲン化合物の規制強化で、より効果的な排水処理技術を開発する必要があること心に描くです。この原稿賛辞で説明するテストのバッテリー生態毒性および化学的評価試験は、通常、廃水処理工場排水放電に適用されます。そのため、テストの総合的なバッテリーのこのタイプの将来のアプリケーションは、特定の規制エストロゲン様化学物質および全体的な生物学的活性の両方を除去するための最良の方法を考慮し、最も生態学的に安全な設計を実現するために、排水技術開発者、およびプラントオペレータを有効にする必要があります。

野生生物の生殖に関する健康上の化合物を内分泌かく乱の影響に関する懸念は、水枠組み指令（WFD）の下の「ウォッチリスト」の2つのエストロゲン様物質（エストラジオール及びエチニルエストラジオール）を配置するために、欧州連合（EU）をリードしてきました。 EDCは、天然および合成ステロイドエストロゲン、医薬品、農薬、および工業用化学物質や野生生物に関する既知の悪影響を消費者製品の成分を含む化学クラス、さまざまなを包含する。これらの化合物のいくつかは、潜在的に人間の健康1に影響を与える可能性があります 。 研究は、WWTPからの流出物は、2を魚にエストロゲンであることが示されている、結果として多くの水域は、魚類3にエストロゲンでもあります。これは最初の野生のオスの魚の血と高前で増加ビテロゲニン濃度（女性特有の卵黄タンパク質前駆体4）を示したイギリスの国民の調査を通して実証されました通常gonochoristic魚種5,6における半陰陽の価数（オス魚の精巣に卵および/ ​​または女性の生殖管の開発）。 従来の下水処理は、一般的に溶解し、有機物を中断削除し、プライマリとセカンダリの両方の処理を行った予備スクリーニングからなる3段階のプロセスです。個々のEDCの除去の有効性は、物質の物理化学的特性にして適用処理プロセスの有効性に依存します。吸着および生物学的分解を介して、多くのEDCの除去には有意であるが不完全である可能性があります。三次処理、砂ろ過として、（例えば、オゾンなど）の高度な酸化を使用して高度処理のに対し、EDCの除去7を増加させるのに有効であることができ、または活性炭を完全に除去7の近くに達成するのに有効であることができます。 廃水処理旧姓のための新しい技術の評価EDCの除去で提案されたプロセスの有効性を決定するために、DS。対象となる化学物質の生態毒性試験と一緒に分析、in vivoおよびin vitroのバイオアッセイで使用することを含むテストのバッテリーは、この目的のために総合的なデータを提供します。規制目的のために非常に有用であるが、標的化学分析は、監視対象の化合物（及び特定の代謝産物）に関するデータを提供することができます。バイオアッセイは、さらに、それ以外の場合は8,9を未検出であろう副産物代謝産物および治療 ​​で生成された廃水変換の副作用の「検出」を可能にします。本論文では、原油と下水処理水のエストロゲン効力を除去し、水を受信する際に高度な新興廃水処理プロセスの数の有効性を評価するための化学的および生態毒性の実験室アッセイのバッテリーの使用を記載しています。

<table><tbody><tr><td>Wellwash Versa プレートワッシャー</td><td>Thermo Scientific</td><td>5165010</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax 340PC</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Memmert</td><td>INB 400</td><td>37 &#176;コイアッセイに必要なCインキュベーション</td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ワーリミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13214789</td><td></td></tr><tr><td>製氷機</td><td>スコッツマン</td><td>AF80</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネルF1デジタルマルチチャンネルピペット</td><td>サーモサイエンティフィック フィンピペット</td><td>4661070</td><td></td></tr><tr><td>ELISAキット</td><td>バイオセンスラボラトリーズ</td><td>V01018401-096 (ファットヘッドミノー) V01003402-096 (コイ)</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ、0.5 ml</td><td>Alpha labs</td><td>LW2372</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ、1.5 ml</td><td>Alpha labs</td><td>LW2375</td><td></td></tr><tr><td>硫酸、95-98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ティッシュプロセッサー</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>TP1020</td><td></td></tr><tr><td>ワックスディスペンサー</td><td>Thermo Scientificレイモンドラム</td><td>E66HC</td><td></td></tr><tr><td>金属包埋金型</td><td>ライカバイオシステム</td><td>各種</td><td></td></tr><tr><td>ホットプレート</td><td>サーモサイエンティフィック シャンドン</td><td>3120063</td><td></td></tr><tr><td>コールドプレート (EG1150 C)</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14038838037</td><td></td></tr><tr><td>加熱鉗子 (EG F)</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14038835824</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン切片浮き&nbsp; バス</td><td>電熱</td><td>MH8517</td><td></td></tr><tr><td>スライド乾燥ベンチ</td><td>電熱</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Stainmate 自動染色機</td><td>Thermo Scientific Shandon</td><td>E103/S10L</td><td></td></tr><tr><td>カセット、Histosette II、生検</td><td>Simport</td><td>M493</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>Thermo Scientific Raymond Lamb</td><td>W1</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear II</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-202</td><td></td></tr><tr><td>IMS(エタノールミックス)、IDA99</td><td>Tennants</td><td>ID440</td><td></td></tr><tr><td>Polysine接着スライド</td><td>Thermo Scientific Gerhard Menzel</td><td>J2800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、22x50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>Histomount</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-103</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン ハリス GURR</td><td>VWR</td><td>351945S</td><td></td></tr><tr><td>エオシン、1%、水性</td><td>ピラミッド イノベーション</td><td>S20007-E</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドのスライドボックス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11701486</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレード、MB35</td><td>サーモサイエンティフィック シャンドン</td><td>3050835</td><td></td></tr><tr><td>Bouin's ソリューション</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>HT10132-1L</td><td></td></tr><tr><td>酵母スクリーン</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>フローキャビネット</td><td>Labcaire Systems Ltd</td><td>SC12R</td><td></td></tr><tr><td>冷却インキュベーター</td><td>LMS 冷却インキュベーター</td><td>303</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Memmert</td><td>INB 400</td><td></td></tr><tr><td>シェーカー</td><td>グラント</td><td>PSU-10i</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド ワーリミキサー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13214789</td><td></td></tr><tr><td>プレートシェーカー</td><td>ハイドルフ タイトラマックス 100</td><td>544-11200-00</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネルF1デジタルマルチチャンネルピペット</td><td>サーモサイエンティフィックフィンピペット</td><td>4661070</td><td></td></tr><tr><td>12チャンネルピペット、ザ</td><td>ルトリウス735441</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96ウェル平底マイクロプレート</td><td>MP Biomedicals Thermo Scientific Nunc Sarstedt</td><td>76-232-05 260860 82.1581.001</td><td>これらのマルチウェルプレートはすべて低バックグラウンドを生成することがわかりました</td></tr><tr><td>HPLCグレードの水</td><td>Rathburn</td><td>RH1020</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>ヘイマンキミア</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5655</td><td></td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2939</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム、ペレット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-1767</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム、無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2643</td><td></td></tr><tr><td>硫酸鉄(III)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>307718</td><td></td></tr><tr><td>L-ロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8912</td><td></td></tr><tr><td>L-ヒスチジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-6034</td><td></td></tr><tr><td>アデニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2786</td><td></td></tr><tr><td>L-アルゲニン、塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6969</td><td></td></tr><tr><td>L-メチオニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5308</td><td></td></tr><tr><td>L-チロシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8566</td><td></td></tr><tr><td>L-イソロイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-7403</td><td></td></tr><tr><td>L-リジン、塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8662</td><td></td></tr><tr><td>L-フェニルアラニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5482</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-8415</td><td></td></tr><tr><td>L-バリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V-0513</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-4311</td><td></td></tr><tr><td>チアミン、塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-1270</td><td></td></tr><tr><td>ピリドキシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5669</td><td></td></tr><tr><td>D-パントテン酸、ヘミカルシウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5155</td><td></td></tr><tr><td>イノシトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-5125</td><td></td></tr><tr><td>D-ビオチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-4639</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース無水; 混合アノマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7021</td><td></td></tr><tr><td>L-アスパラギン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4534</td><td></td></tr><tr><td>L-Threonine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8441</td><td></td></tr><tr><td>硫酸銅(II)、無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1297</td><td></td></tr><tr><td>クロロフェノールレッド-&#946;-Dガラクトピラノシド (CPRG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-2025</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta;-エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-8875</td><td></td></tr><tr><td>ステロイド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>ラスバーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>ラスバーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンモニア溶液</td> ラス<td>バーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>ラスバーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硝酸銅(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>ラスバーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジクロロメタン</td><td>ラスバーン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d4-17&#946;-エストラジオール</td><td>CDN 同位体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d4-estrone</td><td>CDN 同位体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2,4,16,16-d4-17&#945;-エチニル エストラジオール</td><td>CDN同位体</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17&#946;-エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エストロン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17&#945;-エチニル エストラジオール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>ラスバーン</td><td></td><td></td></tr>塩<tr><td>酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>炭酸水素ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スチレン ジビニル ベンゼン カートリッジ (Isolute ENV+) 固相抽出カートリッジ (200 mg/6 ml)</td><td>Biotage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isolute アミノプロピル固相抽出カートリッジ (500 mg/6 ml)</td><td>Biotage</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fish 研究</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オレンジホワイトシリコンマニホールドチューブ0.63ボアpk 6</td>ワ<td>トソンマー</td>ロー982.0063.000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコーンチューブx 15 m(投薬タンク)</td><td>VWR</td><td>SFM1-3250</td><td></td></tr><tr><td>シリコーンチューブx 15 m(流入/流出用大)</td><td>VWR</td><td>SFM1-5450</td><td></td></tr><tr><td>2.5 Lガラスウィンチェスターpk 4</td><td>Fisher Scienctific</td><td>BTF-505-050B</td><td></td></tr><tr><td>磁気攪拌棒51 x 8 mm pk 10</td><td>Fisher Scienctific</td><td>FB55595&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸(MS222)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E10521-10G</td><td></td></tr><tr><td>17&α;-エチニルエストラジオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E4876-100MG</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>ヘイマンキミア</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>SPE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1/8インチPTFEチューブ「ストロー」色分けpk 4</td><td>シグマ</td>マニホールド用Aldrich <td>57276</td><td></td></tr>使い捨て<tr><td>ライナー</td><td>シグマAldrich</td><td>57059</td><td></td></tr><tr><td>ろ過チューブ、フリットなし 6ml pk 30</td><td>シグマAldrich</td><td>57242</td><td></td></tr><tr><td>リサービヤアダプター pk 12</td> マニホールド用シ<td>グマAldrich</td><td>57020-U</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼重量 pk 4</td> マニホールド用シ<td>グマAldrich</td><td>57278</td><td></td></tr><tr><td>オスルアープラグ pk 12</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>504351</td><td></td></tr><tr><td>SPE バキューム マニホールド</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>57265</td><td></td></tr><tr><td>抽出用ストップ コック (スーパーコ) pk 12</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT054806</td><td></td></tr><tr><td>セップパック プラス C18 カートリッジ ボックス 50&nbsp;</td><td>Waters</td><td>WAT020515</td><td></td></tr><tr><td>メタノール HPLC グレード 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>7 ml ガラスバイアル、蓋付き (58 x 17 mm) pk 399</td><td>Fisher Scientific</td><td>TUL-520-031K</td><td></td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Hayman Kimia</td><td>F200238</td><td></td></tr><tr><td>真空ポンプ、e.g.、VP シリーズ真空ポンプ</td><td>Camlab</td><td>1136915</td><td></td></tr></tbody></table>

排水処理プロセスの有効性の評価のための化学的および生態毒性メソッドのバッテリーの使用は、エストロゲン効力を削除します

Use of a Battery of Chemical and Ecotoxicological Methods for the Assessment of the Efficacy of Wastewater Treatment Processes to Remove Estrogenic Potency

内分泌かく乱化合物は、水生環境に重大なリスクをもたらします。エチニルエストラジオール(EE2)とエストロン(E1)は、最近、欧州水枠組み指令に基づく環境汚染物質の監視リストに含まれています。都市下水処理プラントは、地表水のエストロゲン様の効力に大きく貢献しています。廃水処理プラント(WWTP)の流出物のエストロゲン様の効力の多くは、処理プラントでのこれらの物質の不完全な除去によるエストラジオール(E2)、EE2、E1を含むステロイドエストロゲンの排出に起因する可能性があります。廃水処理プロセスの有効性を評価するには、化学分析法を使用して最も頻繁に行われる個々の物質の定量的測定が必要です。最も頻繁に使用される方法には、ガスクロマトグラフィー-質量分析(GCMS/MS)または多重反応モニタリング(MRM)を使用した液体クロマトグラフィー-質量分析(LCMS/MS)があります。ターゲット化学分析は、規制目的に非常に有用ですが、モニタリング対象の化合物(および特定の代謝物)に関するデータしか提供できません。生態毒性学の手法では、生成される副産物や未知のエストロゲン化合物も、その生物学的活性の測定によって評価されます。廃水サンプルのエストロゲン活性を測定するために、酵母エストロゲンスクリーニング(YES)を含む多くのin vitroバイオアッセイが利用可能です。in vivoおよびin vitroバイオアッセイと組み合わせた化学分析は、エストロゲン性内分泌かく乱化合物に関する廃水処理プロセスの有効性と適合性を評価するための有用なツールボックスを提供します。この論文では、一連の化学的および生態毒性試験を利用して、実験室およびフィールド研究における従来型、先進的、および新興の廃水処理プロセスを評価します。

廃水処理プロセスの改善の影響を理解したり、排出さ廃液の内分泌攪乱活動の除去の有効性に関して、既存のWWTPで三次処理などの機器を改造するために最も適切な技術を決定する試みだけでなく、キーの化学物質の測定を必要とします作品を入力するだけでなく、内分泌攪乱作用を有することができる分解生成物の分析を必要とするコンポーネント。国内の下水排水では、存在する最もエストロゲン様物質は、ステロイドホルモン、エストロン（E1）、17βエストラジオール（E2）と17αエチニルエストラジオール（EE2）5,8です。ステロイドエストロゲンは主に不活性なコンジュゲート16,17の混合物として身体から排泄されます。これらの結合型エストロゲンは、実質的に細菌の活動によって下水道に脱抱合され、さらに劣化がWWTPで発生します。脱抱合ステロイドは、AReは汚泥への吸着により、廃水流から除去または形成をもたらす二次処理中に生分解、まず変換副産物の、最終的に完全な無機化は、初期の活性成分の発生する可能性があります。流出ストリーム中のすべての個々の化合物の化学分析は、時間とコストがかかることは困難であろうと、試料中に存在する未知の活性成分をカバーしていないだろう。また、各成分のエストロゲン寄与の合計は、分析される化合物のサンプルの累積エストロゲン効力の指標を提供します。これは、変換プロセスが未知のエストロゲン様物質を生成したり、流入が工業起源であるリスクです。 in vivoおよびin vitro生態毒性のバイオアッセイで用いて化学分析を組み合わせることで、このような下水処理水の混合物中の未知のエストロゲン様成分の存在に対する解決策を提供します。このような酵母エストロゲンのScrなどのin vitroアッセイをEENは（YES）下水排水のエストロゲン活性を決定し、処理した試料8,18,19に活性成分を識別するために広く使用されてきました。しかし、in vivoでおよびin vitro試験での間の比較は、11の重要な内分泌かく乱効力の治療に対する新しいプロセスを総合的に評価することができ、化学的及び生態毒性試験のバッテリーを必要とします。 個々の処理プラントまたはプロセスは、廃水流からの活性化合物を除去するか否かの決意は、ほとんどの場合、LCMS（/ MS）またはGCMSを用いて行わ、サンプル抽出、濃縮及び分析の前に抽出物のクリーンアップに続く化学分析を用いて達成することができます（/ MS）法。化学分析から得られたデータは、個々の準拠を決定するために使用することができる無影響濃度（PNEC）20や環境基準を予測しなかっS（EQS）特定の個々の化合物の21、したがって、そのような方法は、規制コンプライアンスデータのために不可欠です。さらに、標的または非標的化学分析法は、全応答を提供する生物学的方法と比較して個々の化合物または異性体の同定および定量を可能にします。化学分析法は、したがって、個別の化合物の評価を満たすために、個々の処理プラントに基づいて、これらの排水処理の課題を解決するためになされることを可能にします。研究は、合成ホルモンの除去はEE2はあまり効果的である傾向があるが、従来の排水処理（ 例えば、活性汚泥プラント）は、天然のステロイドホルモンの除去に非常に有効であることができることを示しています。それらはPRED以下にEE2を除去するために、エンド・オブ・パイプ溶液として使用することができるようなオゾンのような技術を利用して高度な処理を使用してフィールド試験は、造粒活性炭（GAC）と膜は、高コストであるが、実証されていますicted効果レベルと検出限界以下に。 図3は、パイロットスケールの都市廃水処理プラントでGACを使用して、EE2の除去を示しています。パイプGAC処理の終了を使用して、地方自治体の廃水処理プラントでのパイロットスケールで行った研究はまた、 図4に見られるようにGAC以下エストロゲン効力の低下は、酵母エストロゲン画面（YES）を用いて測定を示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig3.jpg" /> 高度な三次治療後のエチニルエストラジオールの除去を示す、図3の例フィールドのデータ。（A）サンプルは、サンプルの保存のために説明した手順に従って、従来の（活性汚泥プラント）治療後のWWTPから収集されています。 （B）サンプルを、順相SPEを用いて妨害物質を除去するために、固相抽出、クリーンアップを使用して抽出されゲル浸透クロマトグラフィー。 （C）清浄な濃縮抽出物を低容量に濃縮し、MRMモードでの陰イオンエレクトロLCMS / MSを用いて分析します。結果は、同位体標識内部標準を使用して内部標準を用いて計算されます。図示の例では、EE2は0.1 ngの/ Lと環境に安全な濃度にGACとオゾン（O 3）を用いて除去されるの予測無影響レベル（PNEC）を超える濃度で流出物の最終ASPで存在している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig3large.jpg" target="_blank">こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig4.jpg" /> サンプルのエストロゲン活性に関する黄色から赤色への色の変化を示す図4.酵母エストロゲン画面の写真（YES）アッセイプレート（A）。補正後の吸光度（540を示すYESアッセイプレートから作成されたプロットエストラジオール標準（B）のNM）は、活性汚泥処理流出物（ASP）と粒状活性炭（GAC）処理された廃水流出物のサンプル（C）は、各サンプルを二重に試験しました。 ASPとGACの流出物を抽出し、セクション1に概説SPE法を用いて濃縮した<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig4large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> オゾン処理は、従来、処理された下水処理場からステロイドエストロゲンおよびエストロゲン活性の除去にも効果的です。オゾンは、廃水試料中の有機汚染物質の広い範囲、溶解有機物質を酸化することができ、消毒特性を提供します。オゾン処理の有効性は、pH、有機物の量とオゾンの適用量として水の特性に依存します。不十分従来の治療によって除去されるエストロゲンは、することができます0.8および2 mgのO 3 / mgのDOCの用量で廃水から除去します。オゾンは、EDCの数の内訳に適用可能なオゾンを作る電子リッチな部位（不飽和炭素 - 炭素結合、芳香族アルコールを含む芳香族化合物）と反応する選択的酸化剤、です。しかし、個々の化合物の除去は、必ずしも元の化合物の完全な無機化にはつながりません。オゾン化の後、有機物質が副生成物、低分子量、例えば、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、ケト酸、及び臭素化合物などの化合物の極性のクラスの数を含む中間体または形質転換の酸化を生成する形質転換することができます。例としては、臭素酸塩、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒドおよびカルボン酸が挙げられます。 インビボでの使用およびインビトロのバイオアッセイでは、オゾンが部分的にのみ、いくつかの化学物質を酸化するが、得られた主要な変換産物が低いestrogを有することが示されましたENIC効力ひいてはエストロゲン活性の高い除去に適切な用量の結果でオゾンの応用。 廃水の追加の治療の主な利点の1つは、水を受け雄魚の女性化の減少です。低受精率3につながることができます悪影響。魚を用いたin vivo研究（ 例えば 、ゴキブリやファットヘッドミノー）（ 図5に見られるように、例えば ）オスの魚の精巣で排水ショー女性の生殖細胞や卵母細胞に曝露しました。インターセックスや男性のVTGが存在しないか、または大幅にそのようなGAC 7やオゾン22などの高度な治療後の魚が縮小されています。これらの研究は、しかし、これは、生成流出物の毒性に対処していない、オゾン処理の間に生成変態生成物はエストロゲン様ではないことを示しています。この問題は、例えば、他の研究でマグデブルクらの研究に対処されてきました。 <s&gt; 23まで副産物オゾン酸化は、ニジマスに有毒であるが、この毒性はオゾン以下下流砂ろ過によって除去することができることを示しています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig5.jpg" /> フィールドベースの評価における廃水にさらさ図正常な男性（A）および成人ローチから半陰陽（B、C）生殖腺の5顕微鏡写真（Rutilus rutilus）。顕微鏡写真-Aは、通常の男性の精巣の組織切片を示しています。顕微鏡写真-B及び-C、6ヶ月間活性汚泥プロセス廃水流出物にさらされた、半陰陽男性の魚の組織切片を示しています。矢印は、精巣組織内に存在する卵母細胞を示しています。スケールバーは、それぞれの顕微鏡写真では100μmを表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <p class="jove_content" fo:keep-together.withinページ= &quot;1&quot;&gt;オゾンを使用してパイプ処理の終了の高コストは、GACまたは膜技術は、代替の低コスト化、化学物質（EDC）除去内分泌撹乱するための持続可能な方法の開発が必要です。また、吸着分離方法は、単に劣化を経由して、それらを排除するのではなく、別の相からEDCを分離します。 26 - TAML活性剤は、廃水12,24有機micropollutantsの過酸化水素の酸化を触媒するために開発されています。 TAMLは効果的に純粋な実験室水にだけでなく、自治体の下水処理施設からの排水にし、12スパイク尿サンプル中EE2および他のステロイドエストロゲンを低下させ、H 2 O 2と活性化剤。 TAML / H 2 O 2処理がEE2除去含む高ステロイドエストロゲンの除去を提供し、実質的YESバイオアッセイ及び物質を用いてインビトロで測定したエストロゲン活性を低下させる実験室での研究を示していますLLY VTGバイオアッセイ（ 図1および図6）を用いて測定し 、in vivoでの魚の女性化が低下します。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54243/54243fig6.jpg" /> ベースラインと暴露した雄の魚（B）図6.平均EE2濃度と処理および未処理タンクの水（A）中のエストロゲン活性および血漿ビテロジェニン。A）EE2濃度（ngの/ L、ダークブルーバーは）LCMS / MSにより測定しました。男性のファットヘッドミノーでのin vitroの酵母エストロゲン画面（YES）。B）プラズマビテロジェニン（ngの/ mlの、水色のバー）濃度は、定量的酵素を介して測定された経由して、エストロゲン活性（EE2同等ngの/ L、暗緑色のバー）を測定しました免疫吸着検定法（ELISA）を - 結合。 &lt;0.03 ngの/ L EE2（ すなわち、検出限界（LOD）未満）として報告EE2化学分析結果は、半分のLOD（ すなわち、を有するように処理しました。 </em&gt;の平均値、標準誤差と統計解析の計算に使用するための0.015 ngの/ L EE2）。 EE2とエストロゲン活性は、21日間暴露上でサンプリングされた平均測定濃度です。血漿VTGは、露光前（ベースライン）および21日の曝露後に測定しました。治療法は、から構成され;ネガティブコントロール（希釈水のみ）、EE2 + H 2 O 2 + TAML、EE2 + H 2 O 2、及びEE2のみ。グラフAにおけるエラーバーは平均の標準誤差を表し、グラフBにおけるエラーバーは標準偏差を表します。グラフ-Bでバーの上の文字は、統計的な類似性を表します。この図は、ミルズらから変更されている。12 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54243/54243fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

内分泌撹乱化合物（EDC）は、水生環境に対して実質的なリスクをもたらします。都市廃水処理プラントは地表水のエストロゲン効力に対する主要な貢献者です。このホワイトペーパーで提供方法論は、EDCの除去に関して、廃水処理プロセスの有効性と適合性の評価が可能になります。

Endocrine Disrupting Compounds pose a substantial risk to the aquatic environment. Ethinylestradiol (EE2) and estrone (E1) have recently been included in ...

分析化学、in vitroおよびin vivoの手法を含む、ここで概説する一連の試験の全体的な目的は、エストロゲン性汚染物質を除去するための新興および斬新な排水処理技術の有効性を判定することです。これらの手法は、例えば、排水のエストロゲン活性が変動している際に、最も効果的な排水処理プロセスを選択する場合など、環境工学における重要な疑問への回答に役立ちます。これらの技術の主な利点は、活性化合物の非常に低い濃度に対しても感度が高く、水生生物を保護するための最適な技術を証明できる点にあります。手順の実演を行うのは、博士研究員のChris Green博士、大学院生のAngela Pinzon、研究員のAlice Baynes博士、およびシニアリサーチテクニシャンのNicola Beresfordです。SPEプロセスでは、試料の汚染を防ぐため、清潔さと整理整頓に細心の注意を払う必要があります。すべてのチューブ、タップ、フリットをメタノールで事前に洗浄してください。サンプルの分析を開始する前に、移送ラインを抽出マニホールドに取り付け、システム全体を脱イオン水で洗浄します。サンプルの分析を行う際は、まず使い捨てのバルブライナーを取り付け、次にスチレンジビニルベンゼンSPEカートリッジを取り付けます。次に、カートリッジをコンディショニングするため、各リザーバーに5 mLの酢酸エチルをピペットで加えます。このステップでは、SPEが密封されていることを確認してください。次に、真空ポンプをスイッチオンにし、流速を 10 millimeters per minute に設定します。カートリッジが乾燥する前に、5 milliliters のメタノールをロードし、続いて 5 milliliters の水をロードします。SPEカートリッジを乾燥させないことが非常に重要です。水がほとんど通り抜けた後、ポンプのスイッチを切り、各カートリッジのリザーバーに水を補充します。次に、カートリッジのリザーバーとガラス製サンプルボトルを1/8インチのPTFEチューブで接続します。次に、真空の流速を10 mL/min以下に切り替え、サンプル全体をカートリッジに通過させます。続いて、カートリッジ内部の色が変化するまで、SPEカートリッジを十分に乾燥させます。乾燥には真空またはガス流を使用してください。次に、清潔で乾燥した10 mLのガラス製回収バイアルをラックにセットし、そのラックを抽出マニホールド内に配置します。各ライナーがバイアルの上に位置していることを確認してください。サンプルリザーバーにジクロロメタンを4 mL×2回、計8 mL充填し、真空ポンプのスイッチを入れて、液体をSPEに通過させ、回収バイアルに回収させます。次に、濃縮器を用いて、すべての回収バイアルの容量を1 mLまで減らします。各サンプルをオートサンプラーバイアルに移し、窒素ブローダウン装置を用いてさらに100 µLまで濃縮します。プロセスの次の段階では、GPCを用いて高分子干渉物質を除去します。まず、溶出させたサンプル抽出液 95 µL を、GPCを装着したHPLCに注入します。濃縮機および窒素ブローダウン装置を用いて、GPC抽出液を 200 µL まで濃縮し、その後、ヘキサンで 2 mL までメスアップします。次に、使い捨てバルブライナー、アミノパープルカートリッジ、およびカートリッジリザーバーをSPEマニホールドに取り付け、10 mL ガラス回収バイアルを介して接続します。次に、各カートリッジに2 mLのヘキサンをロードしてコンディショニングを行い、溶媒を廃棄します。続いて、GPCサンプル抽出液をリザーバーに入れ、吸引します。抽出液の回収分は脇に置いておき、洗浄液を回収するためにバイアルをラックに戻します。次に、30%（v/v）酢酸エチル・ヘキサン溶液2 mLをカートリッジに通します。さらに酢酸エチル・ヘキサン溶液2 mLを加え、洗浄液の回収分を廃棄し、10 mL回収バイアルをラックに戻します。続いて、50%（v/v）酢酸エチル・アセトン溶液2 mLをリザーバーに加え、2 mL/min以下の低流量でポンプを開始します。液体が通過した後、50%酢酸エチルをさらに2 mLリザーバーに加えます。次に、濃縮機を使用して、抽出液の量を1 mLまで減少させます。その後、サンプルをより小さなガラスバイアルに移し、窒素ブローダウン装置を用いて、抽出液をほぼ完全に蒸発させます。100 µLのメタノールを加え、サンプルを十分に混合した後、0.3 mLインサート付きのオートサンプラーバイアルに移します。次に、抽出液のLC-MS/MS分析を行います。アッセイ開始の前日に、新鮮な増殖培地を調製し、使用するHER株のtenaxドックを接種します。翌日、テスト化学物質または流出液抽出物の100 µL連続希釈系列およびエタノール中でのE2標準曲線を作成し、アッセイの準備をします。次に、10 µLずつ分注して、ラベル付きの滅菌済み96ウェルプレートに移します。その後、エタノールを蒸発させるため、プレートの蓋を開けたままにします。続いて、0.5 mLのCPRG溶液を含む増殖培地50 mLを調製します。24時間培養した酵母培養液を用い、620 nmで濁度を測定して細胞密度を推定します。次に、50 mLのアッセイ培地に4,000万個の酵母細胞を添加します。接種したアッセイ培地を滅菌済みのトラフに移し、マルチチャンネルピペットを使用して、アッセイプレートの各ウェルに培地を200 µLずつ分注します。アッセイプレートの蓋を閉じ、エッジをテープで封止し、プレートシェーカーを用いて2分間激しく振盪します。次に、自然換気付きの恒温槽内で32 Celsiusでインキュベートします。3日間のインキュベーション後、再度振盪を行い、その後、酵母を約1時間静置して沈殿させます。最後に、サンプルの光吸収度を540および620ナノメートルで測定します。汚泥処理プロセスを活性化させている従来の廃水処理施設からの水サンプルを、ネガティブイオンエレクトロスプレーLCMSを用いて分析したところ、エチニルエストラジオールが予測無影響レベルを超える濃度で検出されました。粒状活性炭（GAC）などの高度水処理を用いることで、エチニルエストラジオールのレベルを大幅に低減することが可能でした。定量分析を可能にするため、すべての排水抽出物は同位体標識内部標準物質（赤色のピーク）を用いて分析されました。酵母エストロゲン・スクリーンアッセイは、標準物質であるエストラジオールに対して明確な感度を示しましたが、本質的にブランクであるエタノールに対しては反応を示しませんでした。酵母スクリーン細胞は活性汚泥法処理排水に対して明確な反応を示した一方、GAC処理排水では反応が減衰したものの、依然としてブランクよりも生物学的に活性でした。この新しい廃水処理技術を用いて、青色で示されたエタノールエストラジール濃度と、緑色で示されたエストロゲン活性の両方が、過酸化水素とTAMLの併用処理によって有意に減少しました。廃水処理施設は、エストロゲン性物質による地表水の汚染の主要な発生源となっています。これらの処理水を改善するための水処理プロセスの新しい手法には、エストロゲン活性の詳細な試験が必要です。このビデオを視聴することで、水試料中のエストロゲン活性を測定するために必要な、一連の化学分析および生態毒性試験について十分に理解することができます。試料および抽出物の汚染を最小限に抑えるため、慎重に取り扱うことが極めて重要です。例えば、一般的に使用されているプラスチックにはエストロゲン化合物が含まれているため、化学的な汚染を確認するための陰性対照（ネガティブコントロール）と、抽出法の有効性およびスパイクしたエストロゲンの良好な回収率を確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含めることが不可欠です。

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