Name: 高速液体クロマトグラフィー ESI Q TOF MS と光誘起分解によるエリスロマイシンの除去を使用して水生環境における医薬品の識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: 学ぶHPLC-ESI-QTOF-MSと光誘起分解による水環境中の医薬品の非標的分析法。エリスロマイシンの効率的な除去条件を評価し、環境保護のための汚染物質検出技術を習得できます。

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メラニー フォークトは Niederrhein 大学の応用科学の Promotionskolleg から奨学金に感謝しています。著者らは、さらに支援のための機関をありがとうございます。

1. 前処理: 固相抽出
<ol><li>約 1 リットルのサンプルの準備のための水を収集します。</li>
	<li>粗粒子を除去する 2 μ m の孔径のブルー ・ バンド フィルターの上、サンプルをフィルター処理します。</li>
	<li>メタノールと純水 3 mL 3 mL を使用して SPE カートリッジを平衡します。</li>
	<li>SPE カートリッジに濾液 (1 L) を適用し、適度な真空、例えばを使用して流速を高める。、ダイヤフラム ポンプ。 注: 複数の SPE カートリッジは、並列に実行できます。</li>
	<li>3 ml の超純水水サンプルを洗います。</li>
	<li>3 ml のメタノール カートリッジ ソルビン酸から検体を溶出します。</li>
	<li>3 mL の溶出液をロータリーエバポレーターを使用して乾燥を集中します。</li>
	<li>1 mL の純水に溶解します。</li>
	<li>シリンジ フィルターを通してソリューションをフィルター、高速液体クロマトグラフィー ESI Q TOF MS による非対象と解析のための瓶で保管します。</li>
</ol>2. 高速液体クロマトグラフィー-ESI-Q-TOF-質量分析法、非ターゲット、ターゲットを絞った分析、および MS/MS
<ol><li>高速液体クロマトグラフィー ESI Q TOF MS オートサンプラー バイアルを転送します。</li>
	<li>高速液体クロマトグラフィー-ESI-Q-TOF-MS のすべての関連するパラメーター (表 1) を設定します。 注: 有限の衝突エネルギーが使用されている場合すなわち。、衝突エネルギー (CE) ≠ 0、イオンが断片化されます。このモードは、ターゲットを絞った MS/MS 法に対応します。</li>
	<li>測定を開始します。</li>
	<li>結果として得られるクロマト グラムとマススペクトルを分析します。</li>
</ol>3. 紫外線照射実験
<ol><li>抗生物質の化合物は、例えばエリスロマイシン (750 mg/L)、20 mg/L の最終濃度で純水を溶解します。</li>
	<li>ソリューションの 750 ml のアルミ箔に包まれて、1 L 触媒反応管を埋めます。</li>
	<li>原子炉に 15 W の電力を提供するランプをご紹介します。</li>
	<li>500 rpm でマグネチックスターラーを適用します。</li>
	<li>3-4、6-7 または 8-9 HCl (0.1 M) の NH3 (0.1 M) 必要な場合を滴下することによって目的の値に pH 値を調整します。pH 6-7 は例として使用されます。</li>
	<li>注射器を使用して 0 時にサンプルとして反応溶液 2 mL を取るし、2 mL バイアルに転送。</li>
	<li>UV ランプのスイッチし、の経過時間を追跡します。 注: 10 分の照射時間が十分多い。光化学反応の完全性が必要な場合 2 番目の実験シリーズは最初のシリーズの結果を使用して記録する必要があります。 注意: 紫外線照射は、失明につながることがあります。</li>
	<li>すべての 30 のソリューションから 2 mL サンプルを描く s 最初の 5 分間。その後、すべての 60 のサンプルを取る実験終了時まで s。2 mL バイアルにサンプルを転送します。</li>
	<li>-4 ° C で高速液体クロマトグラフィー ESI Q TOF 質量分析までバイアルを保存します。</li>
	<li>手順 2 で説明した方法と高速液体クロマトグラフィー ESI Q TOF MS を使用して 16 のサンプルを分析します。</li>
</ol>4. カイネティクス解析
<ol><li>MATLAB R2016b のカーブ フィット ツールボックスなど適切なソフトウェアを準備します。</li>
	<li>親抗生物質の最初順序の動力学に従って化合物の光誘起劣化の時間データ対質量領域に収まるよう、参照してください 2 の eq42,43 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq1.jpg">(2) 濃度<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq2.jpg">B に最初の反応ステップ A から educt A、速度定数k1と反応時間tの実際の濃度cの初期濃度を参照</li>
	<li>対時間のカーブ質量領域に収まるよう、3 と 4 の eq を使用して分解、すなわち連続またはそれに続くフォロー アップ反応の中間体として記述することができます、製品 B または C 反応によるとモデル →B → C → d。 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq3.jpg">(3) <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq4v5.jpg">(4) 濃度cBおよびcC中間体 B および C を参照してくださいk、2k3 C、D に C に対応する速度定数 B</li>
	<li>照射時間は写真製品の劣化を観察するのに十分ではなかった場合、データに合うように式 5 を使用します。この degradate は、濃度CD速度定数を取得する最終的な製品開発として扱うことができます。 <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq6.jpg">(5)<ol>
<li>B 式 3 ではなく 6 の eq を使用して反応が B で終了した場合の濃度を計算します。C が最終的な製品の場合は、式 4 ではなく 7 の eq によると C の濃度を計算します。 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq7.jpg">(6) <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq8.jpg">(7)</li>
	</ol>
</li>
	<li>半減期t1/2の 8 の eq を使用します。 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/57434/57434eq10.jpg">(8)</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

このレポートで示した非ターゲット分析の例を示した HPLC ESI Q TOF MS、MS を使用して表面水における医薬品の識別/MS との比較は、最終的な証拠として基準を参照します。非対象と用いた TOF MS の強さは、特定の保持時間と予定の分子式の予測につながる高質量精度で全てのイオンの検出に基づいています。TOF 質量分析計の代わりに、水44汚染物質分析のため軌道イオン トラップのアプリケーションをされていた。分子式の予測は、基準をすばやく選択する開始点として使用されました。Q TOF MS 機器の対象となる MS 法の適用は、事前に選択されたイオンだけが四重極フィルターを通るので特定の化合物の検出を許可しました。一般にまた水分析45にトリプル四重極質量分析計を使用して解析が実行されます。機器の欠陥による理論的質量からの偏差を補うために標準の参照とガスクロマト グラフの比較が実行されます。ターゲットを絞った MS/MS 法は、同定解析で選択されるかもしれない。ここでは、イオンが選択されている断片化しているし、その断片が検出されました。MS/MS は MS よりも敏感なので, 水試料中医薬品の濃度が断片を生成する低すぎます。ただし、断片が検出された場合、化合物はより確実に識別できます。十分な感度は、初期の水サンプルの大量集中することで問題に対処できます。さらに、測定実施されなければならないサンプリング後できるだけ早く潜在的な分解46,47,48,49のため。それ以外の場合、サンプルは、化合物の分解や反応を除外する-20 ° C で格納する必要があります。
時々 同じ m/z 値は、別の保存時に表示されます。これは、そのため異性体はさまざまな分析技術を必要とする可能性があります。それは、化合物検出される可能性がないすべてでは、これは必ずしも彼らの不在を証明しないこともあります。彼らはフォーム イオンだけではない可能性があります。 または検出限界以下が発生します。水の種類は、医薬品の存在に影響を行使します。医薬品はほとんど排水処理植物48,50,51,52,53からの源水と下水処理水および廃水と比べて地下水を入力します。
光束またはランプのフルエンス率の光子は劣化と劣化のメカニズムに大きく貢献して以来劣化実験のため照射ソース、事前に特徴する必要があります。おそらく、真空紫外光/紫外線ランプの初期の試みでは、低圧水銀ランプで十分です。一般的には、過酸化水素、H2O2添加は劣化27,36,37,54を加速します。別のランプ、例えばとき UVA ランプを使用すると、ヒドロキシラジカルの形成を確保する、例えば、。、二酸化チタン23,24,30,の添加で。31. 医薬品自体の反応性の写真ではなく、エリスロマイシン、OH ラジカルなど多くの化合物のも劣化を誘発する種27です。
カイネティック ・ パラメーターの測定、照射時間と濃度を表す質量検出クロマト グラム信号の領域がプロットされます。データに合わせて、適切なソフトウェアを使用することをお勧めします。ここでは、MATLAB の曲線のフィッティング ツールに使用された、できる迅速に計算し、正しい方程式データに適合。中間体の運動より複雑な数式によって決定されます。フィット感、すなわち品質パラメーター。、R2および RMSE、同様得られたすぐに。
この研究では、検出して医薬品の汚染物質と純水のエリスロマイシンの光分解を識別する河川水の分析を示した。地表水などの環境水の異なる劣化速度と速度定数は humins などの物質を吸収する光のためなります。著者の経験によると劣化は、しばしば起こるよりゆっくりと、しかし時々 同等の料金41,56。
水生環境の結果の危険性、特に抗生物質医薬品の世界的な問題は、1の成長を続けています。多様化や化学物質、代謝産物の多様性と分解等をターゲットとした解析環境57年の発見の最も重要な解析の武器になります。効果的な除去、下水処理場における新しい段階は高度な酸化プロセスに基づいて設計する必要があります、UV を照射する部分があります。

医薬品は、水生環境1,2,3,4,5で定期的に発見されます。重要な情報源は、廃液排水処理植物 (WWTP)6,7,8,9です。医薬品の発生、水のサイクル全体を通じて検討されています exemplarily トゥリア川流域10。とりわけ、抗生物質を表す彼らはしばしばきれないの生物学的段階を通るので、薬の特定の危険等級は変更されず、環境11,報12,13 で細菌の抵抗を引き起こす可能性があります。.マクロライド系は、人間および獣医学の両方に適用される抗生物質のクラスを構成します。その代表は、1 μ g/L の排水14,15,16,17,18,19の最大濃度で発見されました。それらの 1 つはエリスロマイシン (Ery)20,21です。海域では、エリスロマイシンは、しばしば伴って anhydroerythromycin Ery A (- H2O)、dehydrate22,23で。エリスロマイシンからの水の除去は、酸に不安定なためです。Anhydroerythromycin 対エリスロマイシンの比率は、pH24,25,26,27に依存します。
化学的に、マクロライド系を含む macrocylic ラクトンは様々 な糖鎖が接続されている、例えば。、desosamine、cladinose、または mycaminose。マクロライドは、発酵プロセスから天然物を化学的に変更が、彼ら多くの場合混合物として存在しています。種と呼ぶ A、B、C、等。、砂糖の置換基が異なります。糖鎖と、ラクトンで自分の位置、マクロライド28,29の作用のモードを担います。環境に害を最小限に抑える、水生環境27,30,31,32に入る前に医薬品を完全に石化することが望ましいです。
この研究の最初の部分を扱う表面海水は、医薬品の検出排水と公海の監視のために重要であります。さまざまな種類の行列のマイクログラム範囲で正体不明の物質を検索するため非ターゲット分析、選択20,33,34,35の方法です。特に、高速液体クロマトグラフィー (HPLC) エレクトロ スプレー イオン化四重極でその特異性と感度のための特別な値の飛行質量分析法 (高速液体クロマトグラフィー-ESI-Q-TOF-MS) の時間を証明されています。感度がさらに物質の同定が拡張する対象となる MS を用いた四極子による選択モードで運営し、衝突セル内衝突エネルギーは 0 に設定。したがって、イオンに到着する断片化されていない TOF 検出器。
この作品の第二の重点は、エリスロマイシンの除去です。いわゆる高度な酸化プロセス (AOPs) は使用される医薬品の除去、 e.g。、UV ライト36,37,38照射による開始。分解に不可欠な真空紫外光による水からヒドロキシルラジカルの形成である UVC 照射次の式 1/。
H2O + hν(< 200 nm) → H2O * → H. + .ああ (1)
水酸基ラジカル物質36,37の劣化に積極的に貢献する 2.8 V、高い酸化電位を持っています。
ここでは、真空 UV/紫外線照射水を用いたエリスロマイシンの劣化は pH の影響を考慮して説明されています。さらにもっと危険な製品の形成は、AOPs39,40を使用しての欠点と思われます。したがって、医薬品の完全な鉱化作用まで照射することが重要です。照射時間を反応の速度論的モデルを適切に推定するには、反応速度定数と半減は、初期の薬物とその紫外線の両方に決定されます。この目的のため濃度-時間 (c t) プロットは HPLC ESI Q TOF MS 測定から派生し、MATLAB を用いた化学反応速度論モデルと比較していた。劣化の速度が優先順に従って進むし、紫外線は、連続またはそれ以降のフォロー アップ反応27,41の中間生成物として記述されていた。

<table><tbody><tr><td>液体クロマトグラフィー用メタノール LiChrosolv</td><td>メルク</td><td>1060181000</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Riedel-de Haen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH3</td><td>Riedel-de Haen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Simplicity 185 浄水システム</td><td>EMD MilliQ</td><td>-水</td>エリスロマイシンを製造するためのミリポア<td></td></tr><tr><td></td><td>BioChemica AppliChem</td><td>A2275,0005</td><td></td></tr><tr><td>フィルター ロチラボフィルター、Typ 113A</td><td>Roth</td><td>AP78.1</td><td></td></tr><tr><td>SPE-カートリッジ オアシス HLB 3cc (60mg)</td><td>Waters</td><td>WAT094226</td><td></td></tr><tr><td>BAKER SPE-12G</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メンブレンポンプ PC3001 VarioPro&nbsp;</td><td>Vacuubrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロータリーエバポレーター;Laborota 4000 efficient</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、2 mL</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナイロンシリンジフィルター Target2</td><td>Thermo Scientific</td><td>10301345</td><td></td></tr><tr><td>C-18 CoreShell カラム 寸法 50 mm x 2.1 mm 寸法、2.6 &mu;m 粒度</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC 1200</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ESI-Q-ToF-MS 6530</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>photoreactor, UV Labor Reactor System 3</td><td>Peschl Utraviolet GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VUV/UVC-lamp, TNN 15/32, 15 W</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-meter, pHenomenal pH 1100L</td><td>vwr</td><td>662-1657</td><td></td></tr><tr><td>マグネチックスターラー</td><td>Heidolph Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MassHunter Workstation B.06.00</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB R2016b</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

高速液体クロマトグラフィー esi q tof ms と光誘起分解によるエリスロマイシンの除去を使用して水生環境における医薬品の識別

Identification of Pharmaceuticals in The Aquatic Environment Using HPLC-ESI-Q-TOF-MS and Elimination of Erythromycin Through Photo-Induced Degradation

水環境のため、最終的に人間の健康の重要性が増して水サイクル全体を通じて医薬品を監視します。対象し、非対象と解析が選ぶ今日の手段。助けを借りて、通常分析対象とトリプル四重極の質量分析計はより敏感であることが、以前に選択した唯一の化合物を識別できます。本研究で使用される最も強力な非ターゲット分析は時間の飛行質量分析計 (TOF-MS) 拡張を四重極質量アナライザー (Q) によって実行されます。非ターゲットを絞ったアプローチの前に固相抽出法と高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、高い感度と選択性をすべてイオン化可能な物質を検出することができます。Q TOF MS 機器をフルに活用タンデム質量分析 (MS/MS) 実験は加速し、識別を容易にする対象となる MS 法感度を高めるが、識別のための基準に依存しています。ライン川の水から 4 医薬品の同定が示されています。ライン川トーマ湖、スイスのグラウビュンデン州と南湾、オランダの近く、北の海への流れに由来します。その長さは 1232.7 km になります。水循環から医薬品を効果的に除去するために主な興味だから効果 UV-C 照射は実験室規模で示されています。このメソッドは、マクロライド系抗生物質のエリスロマイシンの exemplarily 示されている医薬品の高速分解できます。上記の高速液体クロマトグラフィー Q-TOF MS メソッドを使用して、親の薬物およびその分解生成物の濃度-時間図が得られます。一階を逐次反応のための方程式を確立した後計算継ぎ手により照射時間および条件内で第 4 段階として可能性があると考えられる場合を予測するのに役立つ可能性があります速度論的パラメーターの決定排水処理。

水で医薬品を識別するために最適なツールとして時間の飛行質量分析装置を用いた非対象と分析のためのプロトコルを提案します。その除去における紫外光照射の応用を示す.照射、化合物の分離, 同定と劣化プロファイルのキネティック モデルを含む分析が示されています。

高速液体クロマトグラフィー ESI Q TOF MS と光誘起分解によるエリスロマイシンの除去を使用して水生環境における医薬品の識別

Monitoring pharmaceuticals throughout the water cycle is becoming increasingly important for the aquatic environment and eventually for human health. ...

この方法は、水生環境における抗生物質の認識など、環境保護における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、非常に低濃度の医薬品汚染物質を検出し、同時にそれらを識別できることです。この方法は、医薬品や廃水の影響、河川水に関する洞察を得ることができますが、水生環境中の農薬やホルモン様物質など、他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、約1リットルの水を集めてサンプルを調製します。ブルーバンドフィルターでサンプルをフィルタリングして、コース粒子を除去します。次に、固相抽出カートリッジに3ミリリットルのメタノールを加えて平衡化します。メタノールがカートリッジから出るのを待ってから、3ミリリットルの超純水を追加します。水がカートリッジを離れたら、濾液を塗布し、ダイヤフラムポンプまたはその他の適度な真空を使用して流速を上げます。ですから、事前集中が非常に重要です。必ず、正しい固相の固相を持つ固相抽出カートリッジを使用してください。サンプルを3ミリリットルの超純水で洗浄します。次に、3ミリリットルのエタノールを使用して、カートリッジソルビン酸から分析種を溶出します。ロータリーエバポレーターを使用して、溶出した分析種を濃縮し、乾燥させます。得られた残留物を1ミリリットルの超純水に溶解します。この後、シリンジフィルターで溶液をろ過します。HPLC-ESI-QTOF-MSによるノンターゲット分析を行う準備ができるまで、バイアルで保存してください。UV照射実験は、目的の抗生物質化合物を超純水に溶かし、最終濃度20ミリグラム/リットルを目指します。この溶液の750ミリリットルを1リットルのフォトリアクターに移します。次に、マグネチックスターラーを追加し、15ワットのUVランプを反応器に導入します。500RPMで攪拌を開始します。塩酸またはアンモニアを滴下して添加し、pHを希望の値に調整します。シリンジを使用して、2ミリリットルの反応溶液を2ミリリットルのガラスバイアルに移します。このバイアルを時間ゼロでサンプルとしてマークします。この後、UVランプのスイッチを入れ、経過時間の追跡を開始します。最初の5分間は30秒ごとに2ミリリットルのサンプルを採取します。その後、実験の残りの部分で60秒ごとにサンプルを採取します。分析の準備ができるまで、バイアルを摂氏4度で保管します。LC MSを開始するには、バイアルをオートサンプラーに移します。テキストプロトコルの表1に示されているように、関連するすべてのパラメータを設定し、測定を開始します。高分解能MSおよびMS/MSラティチュードを使用することは、水中の医薬品のノンターゲット分析に最も有望な手法です。次に、テキストプロトコルで説明されているように、速度論的解析と曲線フィッティングを実行します。この研究では、河川水と超純水の両方のサンプルを分析して、医薬品汚染物質を検出および特定します。固相抽出後、各河川水サンプルは黄緑色または濃い緑色をしており、クロロフィル含有物質の存在を示しています。超純水のサンプルは、予想通り透明でした。代表的な河川水サンプルのベースピーククロマトグラムには 25 を超えるピークが含まれ、それぞれに異なる化合物が反映されていました。次に、これらの物質は、分子式を導き出し、それらを利用可能な参照標準と比較することによって同定されます。この比較は、ベータ遮断薬メトプロロール、鎮痛剤カルバマゼピン、マクロライド系抗生物質エリスロマイシンA、およびその誘導体であるアンヒドロエリスロマイシンAを含むドイツの地表水に含まれるいくつかの医薬品の存在を明らかにします。濃度時間図は、pH 7で最速の分解が起こり、最も遅いのはpH 3で見られることを示しており、この抗生物質の光誘起分解は中性pHで行うべきであることを示しています。この手順に続いて、SESP-NMRアルビトリップMS-OTUCなどの他の方法を実行して、分解物の酸化やティップオフOLL化などの追加の質問に答えることができます。このビデオを見れば、人工水域や環境水域における医薬品の分析方法や、その光照射による排泄物の検出方法について十分に理解できるはずです。化学薬品、医薬品、河川水、廃水を扱う作業は危険であり、個人用防護服、外装、廃水の場合は、この手順を実行する前または前に必ず予防接種を受ける必要があることを忘れないでください。

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