Name: 小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶ、水試料からのエストラジオルの自動固相抽出法。低コストで省スペースな装置を用い、免疫学的検出のための効率的な前濃縮を実現します。環境モニタリングにおける有機汚染物質分析に適用可能です。

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この作業は、欧州連合第7次フレームワークプログラムFP7/2007-2013の助成金契約番号265721の下で資金提供されました。著者らは、このプロジェクトでの支援について、RIKILT Institute for Food Safety(NL)に感謝します。

注意：以下のプロトコルは、SPEが50％（v / v）のメタノールで18の吸着剤および溶出で100mlの水のサンプルに対して行う説明します。酵素免疫測定法（ELISA）キットを用いて連結された濃縮されたサンプルは、分析前に10％（v / v）のメタノールに達するように希釈されます。 1.試薬の準備<ol><li>水サンプルを準備<ol><li>他のステップの前に、0.2μmの孔径のフィルターを各100 mlの水のサンプルをフィルタリングします。 </li><li>水の量に参照溶液の適切な量を希釈することにより、所望の濃度でサンプルをスパイク。例えば、300μgの/ Lの濃度のE2参照溶液の3.3μLを希釈することにより、E2の100 ngの/ Lの水サンプルを100mlを調製します。 10 ngの/ L E2をスパイクサンプルを得るために、このソリューションを10回希釈します。 1 ngの/ L E2で100mlのサンプルを取得するために、この後者に別の10倍希釈します。 </li><li> Gでガラス瓶にろ過した試料（未修正またはスパイク）を配置L45スレッド。同じ日にサンプルを使用してください。初期濃度を推定するためにELISAを用いて分析する小さな部分を取ります。 </li></ol></li><li>タイトなチューブに50％v / vのに脱イオン（ジ）を水にメタノールを希釈することにより溶離液の300μlのを準備します。 </li></ol> SPEカラムの調製<ol><li>最初のメタノールの1,600μL、次いで逆相吸着剤の40 mgのジ水400μLを加えることによって、オクタデシル - シリカ吸着剤粒子の20 mg / mlの懸濁液を調製。しっかりと蓋を閉め、ボルテックスで攪拌します。 </li><li>列の一番下の膜のインストール<ol><li>細孔径11ミクロンと1ナイロン膜を選択し、防塵組織の二重の層の上に置きます。直径3mmのパンチで、膜中に二つの小さな部分をカット。 </li><li>フラットエンドフィルタのピンセットで小さな膜のいずれかをつかみ、列の一方の側に配置します。 </li><li>チューブを平底コネクタをねじ込み、締めます。膜はnですOW、所定の位置に吸着剤を確実に加えることができます。膜が配置された端部に向かって列のポインティングの身体の矢印を描画します。 </li></ol></li><li>パックされた吸着剤カラムの準備<ol><li>底部に向かって矢印をホルダーに列を固定します。列には、できるだけ垂直に設定する必要があります。 </li><li>ルアーロックコネクタを使用して、列のチューブの端部に空の10ミリリットルを使い捨て注射器を取り付けます。 </li><li> 20-200μlの先端にマイクロピペットを準備し、100μlにボリュームを設定します。このピペットチップのフォーマットを調製するための吸着剤カラムのサイズに適合されます。手順は、1ミリリットルピペットで使用されるものと大きなピペットチップで、より困難であろう。 </li><li>ボルテックスで吸着剤懸濁液を攪拌し、急速に列を中心に100μLをピペット。注入しながら、吸引優しくすべてのピペッティングソリューションは、もう一方の手で注射器を使用することにより、膜の谷。このSTで年齢は、シリンジの充填溶液は、粒子の明確でなければならず、粒子床は、結局は列で観察することができます。 </li><li>溶液中の粒子の均一な懸濁液を確保するために、すべてのピペット操作の間にストック懸濁液を撹拌することにより、このプロセスをさらに2回繰り返します。結果の列は、吸着剤の6ミリグラムが含まれています。 </li><li>懸濁液の300μlのがロードされ、注射器で吸引することにより、乾燥された場合には、位置に注射器を保持し、もう一方の手で鉗子を使用して上に第二のナイロン膜を配置します。 </li><li>チューブと第二のコネクタをネジ止めし、注射器を廃棄してください。 SPEカラムを使用する準備ができました。 </li></ol></li></ol> 3.システムの準備<ol><li>ルアーロックコネクタを使用して、デバイス上のSPEカラムを締めます。矢印は、デバイス上に示したものと同様の方向を指している必要があります。 </li><li>ねじ込むことによって、デバイスへのサンプルが入ったボトルを接続しますその上GL45安全キャップを提供します。 </li><li> 「溶離液」リザーバ内に溶離液の200μlのをロードします。 </li><li> 「希釈」リザーバ内の負荷ジ水800μLを。 </li><li>抽出工程中に処理水を収集するために、廃棄物の出口にボトルを置きます。フォーマットは重要ではないが、体積が試料体積に関して十分に大きくする必要があります。 </li><li> 1.5ミリリットルの最小容積容量を有するセンサー出口に小さなバイアルを置きます。濃縮された溶出液および希釈液を収集する際に気泡がこの出口で形成するように1ミリリットルの最大容量は小さくなりすぎます。 </li><li>逆時計回りのさらなる移動が不可能になるまで、圧力調整器は、それを手動で回して閉じた位置にあることを確認します。 </li></ol>プロトタイプ4. SPE <ol><li>背面のボタンを押して、プロトタイプのスイッチをオンにします。 </li><li>ユーザーインターフェースを用意し、プログラムを選択します<ol><li>ユーザーインターフェースを開きます。選択デバイスがリストから接続し、ボタン「次へ」をクリックされているコンピュータの通信ポート。 </li><li>値PSET 580とdpsetのための30を入力します。ポンプが動作しているとき、580±30ミリバールで加圧されたシステムや貯水池内の圧力を維持するために調整されます。 </li><li>自動モードを選択します。 </li><li>自動モードのコーナーでは、ボックス「設定ファイルパス」内のプログラムファイルをロードします。 </li></ol></li><li>圧力調整器を調整します<ol><li>ポンプを起動します。 </li><li> プリプレグのための読み値は劣るが、320ミリバールに近くなるまで手動で圧力調整器を回します。 </li><li>ポンプを停止します。 </li></ol></li><li> SPE手順を開始します<ol><li>自動モードの隅に押して「スタート」。ポンプはスイッチオンし、抽出、溶出および希釈のステップが自動的にお互いに従います。 100 mlのサンプルの全体の手順は、50分で行われます。 </li><li>プリプレグの値を確認してください。最適な流量を確保するために、抽出工程中に350ミリバール - それは範囲320でなければなりません。 </li><li>分析まで暗所に4〜5℃の小瓶と店を閉じます。分析対象物の劣化を防止するために、次の30時間で分析を実行します。 </li><li>処理された水を廃棄してください。 </li></ol></li><li>システムのクリーニング 注：各抽出手順の後、システムは、交差汚染を防止するために洗浄される必要があります。 <ol><li> GL 45ガラス瓶中のメタノール70％v / vの10 mlの溶液を調製します。 </li><li> SPEカラムを抜いて、コネクタ付きチューブを差し込みます。 </li><li>自動モードでは、「クリーニング」ファイルを選択し、同じ圧力設定で起動します。 </li></ol></li></ol> ELISAとエストラジオール濃度の5検出<ol><li>使用されているELISAキットで提供されたプロトコルに示されているように濃度のキャリブレーションサンプルを準備します。 1 Calibraでの準備ンは、サンプルと同じマトリックスを設定し、メタノール10％v / vので設定1つの較正。 </li><li>製造業者の指示に従って、プレート上のウェル中の試料の必要量を分注します。 、キャリブレーションサンプルを使用して変更されていないし、メタノール10％v / vの水のフィルタリングではなく、SPEで処理したサンプル、および濃縮されたサンプルをスパイクしました。検定に関連する誤差を低減するために、サンプルあたり3ウェルを使用してください。 </li><li>酵素と反応物の添加のためのキット、インキュベーション時間、洗浄、さらに反応が設けられており、プロトコルの指示に従ってください。 </li><li>プレートリーダー機器との​​キット製造業者の説明書に従って、各ウェルに光信号を読み取り、データを収集します。 </li><li>較正曲線に適合し、同じマトリックスと最初のサンプル中、およびメタノール10％v / vのに富む試料中のE2濃度を決定するために、プレートリーダー装置のソフトウェアを使用します。 </li></ol>

<ol><li>Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+methods+of+identification%2C+analysis+and+removal+of+endocrine+disrupting+compounds+%28EDCs%29+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Hazard.+Matter%22%5BJournal%5D)">The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water.</a> J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

イムノアッセイを用いて分析を行った水試料の調製のための新しい方法を提案しました。機器は、自動化されたユーザーフレンドリーな方法で固相抽出を行うことができます。 システムに前の注入に水試料の濾過が非常に重要です。溶液中にまだ存在する任意の粒子は、潜在的に流体ネットワークの目詰まりの原因とSPEカラムを妨害します。もう一つの重要なステップは、SPEカラムの製造です。カラム中の粒子の量は、可能な限り最高のパフォーマンスを達成することが重要です。粒子の凝集を回避するために、吸着剤粒子の懸濁液を調製する場合には、特別な注意が必要です。この吸着剤は、乾燥し、次いで脱イオン水画分に第一の溶媒の画分を添加することによって達成されます。ピペットで100μLを吸引しながら、包装工程の間に、それはよくサスペンションを混合することが重要です。 SPEのプロの終わりcedureは、システムを適切に洗浄することが重要です。異なるサンプルを扱う場合、まず、それは、交差汚染を防止し、そして第二に、それは、それが使用されていない機器の生物汚染の危険性を回避します。 <p class="jove_conten...

サンプル調製は、任意の分析のプロセスの重要なステップです。具体的には、マトリックス効果、干渉の減少、および分析物の濃縮の除去は、正確な結果を得るため、検出の下限に到達するために必要です。内分泌かく乱化合物（のEDC）による生物に対する作用に特に懸念た場合であっても、環境が非常に低いレベルで存在します。天然ホルモン17βエストラジオールは、EUの水質汚染の監視リスト上に存在し、欧州の水枠組み指令で規制優先物質のリストに追加されやすいです。固相抽出（SPE）は、一般に、化学1-5（クロマトグラフィー、質量分析法）及び免疫6-9検出方法の両方で、水の小さな汚染物質の分析に適用されます。後者は、イムノアッセイは、フォーマットの多種多様で利用可能であるTAに固有のものとして、環境モニタリングの分野に関心を得ました目標確認検体、検出の下限に達した。6、7、10、11、種々の酵素免疫測定法（ELISA）は市販されており、マルチウェルプレート上で一度に複数のサンプルを分析するために使用可能に連結されました。手続きには数時間かかることがあり、連続反応工程で構成されています。反応の最終生成物は、検量線に基づいて、標的分子の濃度を決定するために、光学的に検出することができます。 クラシックSPE手順は、吸着剤プレコンディショニング、サンプル抽出、洗浄、溶出、および溶離液の蒸発による濃縮を含みます。この抽出物の希釈のために使用される溶媒は、検出方法に応じて選択されます。免疫学的方法については、強く、有機溶媒の影響方法の感度の量。12 回復及び予備濃縮性能に加えて、この方法は、簡単かつコスト効率的である必要があります。 procedurの自動化eは人間関連のエラーを削減することができます。私たちの以前の研究13では、自動化されたSPEのためのプロトタイプを導入し、私たちの方法は、海水試料中の天然ホルモンの17βエストラジオールの分析に適用しました。現在の映像で、私たちは、オフラインの伝統とオンラインSPE、および免疫反応による検出とその特定の互換性に比べて提案手法の技術的な利点を強調したいと思います。我々は、17βエストラジオールの検出のための水サンプルに適用プロトコルを記述する。 SPEは、オクタデシルシリカ（C18）吸着相と溶出を希釈メタノールを用いて行われると実行されます。

<table><tbody><tr><td>フィルターメンブレン0.2 &mu;m 細孔径</td><td>メルク ミリポア</td><td>GNWP04700</td><td>サンプルろ過用</td></tr><tr><td>ナイロン膜 11 &mu;m孔径</td><td>メルクミリポア</td><td>NY1104700</td><td>SPEカラム用</td></tr><tr><td>使い捨て生検パンチ 5 mm</td><td>医療予算</td><td>39302439</td><td></td></tr><tr><td>Nucleodur C18 ec&nbsp;</td><td>Macherey Nagel</td><td>713550.01</td><td>50 &mu;m 粒子径</td></tr><tr><td>合成海水</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>SSWS500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>17β-エストラジオール標準</td><td>エンツォ ライフサイエンス</td><td></td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>17β-エストラジオール ELISA キット</td><td>エンツォ ライフサイエンス</td><td>ADI-900-008</td><td>96 ウェル、範囲 30 - 3,000 ng/L</td></tr></tbody></table>

小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単​​な方法

A Simple Method for Automated Solid Phase Extraction of Water Samples for Immunological Analysis of Small Pollutants

環境水サンプルの固相抽出（SPE）のための新たな方法が提案されています。開発されたプロトタイプは、コスト効率的でユーザーフレンドリーであり、迅速な自動化と単純なSPEを行うことができます。プレ濃縮液は、低有機溶剤の含有量を、免疫測定法による分析と互換性があります。この方法は、100 mlの水サンプル中の天然ホルモンの17βエストラジオールの抽出及び予備濃縮のために記載されています。逆相SPEは、オクタデシル - シリカ吸着剤を用いて行われ、溶出はメタノール50％v / vの200μlで行われます。溶離液は、メタノールの量を低下させるために脱イオン水を添加することによって希釈されます。手動SPEカラムを準備した後、全体的な手順は、1時間以内に自動的に行われます。プロセスの終わりには、エストラジオール濃度は、市販の酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を用いて測定されます。 100倍のプレ濃度が達成され、わずか10％v / vの中のメタノール含有量。分子の完全な回復1 ngので達成される/ Lは、脱イオン化された合成海水サンプルをスパイクしました。

吸着剤の充填の再現性は、乾燥することによって評価し、ガラスバイアルにピペッティング吸着剤を重み付けし、その結果を図1に示された。 図2に示すように、注入の時間の再現性を、100 mlのサンプルを試験した。初期およびプレで濃縮スパイクされたサンプルは、17βエストラジオールのための市販のELISAキットを用いて測定し、 図3に示されて濃縮しました。 提案された手順は、吸着相（ 図1）の調製のためのユーザを含みます。吸着剤粒子は、機械的安定性のための2つの膜の間保持され、密列中の懸濁液をピペットながら注射器で加えられる圧力によってパックされています。結果の列は、この値のわずか6％の誤差で選ばれた吸着剤の6ミリグラムの最適化された量が含まれています。このステップは、働き吸着剤のコンディショニ...

自動化された小型化されたシステムを使用して、水サンプルからエストラジオールを抽出し、予備濃縮するためのプロトコルが提示されます。

A new method for solid phase extraction (SPE) of environmental water samples is proposed. The developed prototype is cost-efficient and user friendly, and ...

この試料調製法の全体的な目的は、水試料中の低濃度の有機汚染物質を、ユーザーにとって使いやすく、費用対効果が高く、かつ自動化された方法で前濃縮することです。この手法は、ウェルプレート免疫アッセイやバイオセンサーなどの免疫検出法を用いて水試料の汚染を研究する場合、標準的なSPE（固相抽出）プロセスに代わることができます。この技術の主な利点は、SPEの手順が自動化されており、従来のアプローチと比較して装置の設置面積とコストが低いことです。さらに、濃縮プロセスの性能は、低溶媒含有量と前濃縮効率の両面において、免疫測定法の分析要件を満たしています。まず、0.2 µmの孔径を持つフィルターを用いて、100 mLの水試料をろ過します。ろ過した試料をGL 45ネジ付きのガラス瓶に入れます。密閉チューブ内で、脱イオン水でメタノールを希釈し、容量比50%の溶出液を300 µL調製します。次に、ガラスバイアルに入れた40 mgの逆相吸着剤に、メタノール1,600 µL、続いて脱イオン水400 µLを加え、20 mg/mLのオクタデシルシリカ吸着剤粒子の懸濁液を調製します。蓋をしっかりと閉め、ボルテックスミキサーで撹拌します。孔径11 µmのナイロンメンブレンを、2枚重ねの防塵ティッシュの上に置きます。3 mm径のパンチを用いて、メンブレンから2箇所の小さな円を切り出します。次に、平先フィルター鉗子で切り出したメンブレンの1枚を掴み、カラムの片側に配置します。次に、フラットボトムコネクターをチューブに取り付けて締め付けます。その後、メンブレンを配置した末端方向を指すように、カラムの本体に矢印を記入します。この状態で、矢印が下を向くようにカラムをホルダーに固定してください。下部のロックコネクタを使用して、空の10 milliliter使い捨てシリンジをカラムのチューブ端に取り付けます。ボルテックスミキサーで吸着剤懸濁液を撹拌し、100 microlitersをカラムの中央に迅速にピペッティングします。注入しながら、もう一方の手でシリンジを用いて、ピペッティングした溶液をメンブレンを通して緩やかに吸引します。SPEカラムの調製は非常に重要です。粒子懸濁液をカラムに注入する際、シリンジを用いて溶液をメンブレンから適切に吸引してください。そうしないと、粒子が密に充填されません。溶液中の粒子を均一に懸濁させるため、すべてのピペッティング操作の間にストック懸濁液を撹拌しながら、前述の工程をさらに2回繰り返します。懸濁液全体をロードし、シリンジで吸引して乾燥させた後、シリンジをそのままの位置に保持し、もう一方の手でピンセットを用いて2枚目のナイロンメンブレンを上に配置します。その後、チューブを用いて2つ目のコネクターを締め付け、シリンジを廃棄します。この時点で、下部のロックコネクタを使用してSPEデバイスのカラムを固定します。提供されているGL 45セーフティキャップを締め、試料の入ったボトルをデバイスに接続します。溶出液リザーバーに200 µLの溶出液をロードします。次に、希釈リザーバーに脱イオン水を800 µL注入します。圧力レギュレーターを反時計回りに止まるまで回し、閉位置にあることを確認してください。プロトタイプを起動した後、psetに580、delta psetに30の値を入力します。圧力レギュレーターを調整するには、ポンプを起動します。次に、pregの読み取り値が320 millibarを下回るが、それに近い値になるまで、圧力レギュレーターを手動で回します。ポンプを停止した後、自動モードコーナーのstartを押してSPE手順を開始します。SPEの手順が完了したら、サンプルの小瓶を密閉し、ELISA分析を行うまで4〜5°Cの暗所で保存します。システムの洗浄には、GL 45ネジ付きのガラス瓶で、容量比70%のメタノール溶液を10 mL調製します。SPEカラムを取り外し、チューブをコネクタで塞ぎます。自動モードでクリーニングファイルを選択し、pset、delta pset、およびpregに以前使用したのと同じ圧力設定で開始します。吸着剤充填の再現性は、ガラスバイアルに分注した吸着剤を乾燥させ、重量を測定することで評価しました。注入時間の再現性は、100 milliliterのサンプルを用いて検証しました。初期サンプルおよび濃縮後のスパイクサンプルの濃度は、市販の17 beta-estradiol ELISAキットを用いて決定した。検量線から、濃縮サンプルのメタノール比率が免疫測定法の感度に影響を与えないことは明らかである。回収率は、脱イオン水で128 ± 22 %、人工海水で107 ± 6 %であった。適切に実施すれば、SPEカラムの調製は習熟後5分以内に完了します。SPEの手順全体は1時間以内で完了可能です。この手法の開発により、環境科学分野の研究者が小分子有機汚染物質をモニタリングするための免疫検出法の開発を検討する道が開かれました。このビデオを視聴することで、免疫測定法による汚染物質分析に向けた、コスト効率の高い自動装置を用いた水サンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。有機汚染物質や溶媒を取り扱う際は危険が伴うため、この工程を行う際は、適切な手袋や保護ゴーグルの着用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。

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環境

このプロトコルは、水性の検出のための代替手順として、タンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過試料濃度システムの使用と熱解離について説明します。...

水性を検出するタンジェンシャルフロー中空糸限外ろ過と熱解離のステップを使用し変更されたEPAメソッド1623<em&gt;クリプトスポリジウム</em&gt;と<em&gt;ジアルジア属。</em

このビデオでは、採取済みのドナー腎臓からの代謝物のSPMEプローブベースの抽出を実演します。抽出された代謝物は、移植のための臓器の質を評価するために、メタボロームおよびリピドミクス分析を行うために使用できます。...

固相マイクロ抽出サンプリング:グラフト組織からのサンプル抽出のためのプローブベースの手法

この原稿は、次世代シーケンシングのためのDNA断片を精製するための自動ゲルサイズ選択アプローチについて説明しています。Ranger...

環境水試料から調製した次世代シーケンシングライブラリの品質を向上させるために自動化されたゲルサイズの選択

微量金属分析のための双極子支援固相抽出マイクロチップの製造プロトコルが提示されます。...

水試料中の微量金属分析のためのダイポールアシスト固相抽出マイクロチップの作製

5つの異なるパッシブサンプリングデバイスの特性評価と適用に関するプロトコルが提示されます。...

水中の農薬のモニタリングのための特性とパッシブサンプラーの応用

水生環境での微量金属研究のための水サンプルを適切に収集し処理するためには、「クリーンな技術」を使用した特別な注意が必要です。詳細な微量金属研究のための信頼性の高い環境モニタリングデータと高感度の結果を得ることを目的とした、サンプリング、処理、および分析手順のプロトコルが提示されます。...

きれいなサンプリングと微量金属の研究のために川や河口ウォーターズの分析

私たちは、水のクリーンで正確なポイントサンプリングのためのシンプルで非侵入型で信頼性の高い方法であるVacuSIPを紹介します。このシステムは、底生懸濁液フィーダーによって吸い込まれた水と吐き出された水をその場で同時に収集するために開発され、評価され、粒子状物質と溶解した化合物の除去と排泄をきれいに測定しました。...

VacuSIP、のための改良INEX方法<em&gt;その場で</em&gt;微粒子と溶解した化合物の測定は、アクティブサスペンションフィーダによって処理します

1つのサンプルを用いて生物学的組織からの脂質、代謝産物およびタンパク質を包括的に抽出するためのプロトコルを提示する。...

単一サンプルからの代謝産物、脂質およびタンパク質の包括的分析のための単純分別抽出法

ここでは、質量分析法による逐次対象数量と水中のフッ素化合物の非ターゲット分析のためのプロトコルを提案する.この方法は知られているフッ素系化合物の定量的なレベルを提供し、豊かさの半定量的な見積もり関連試料中の未知の化学物質を識別します。...

あたりを識別する-ポリフルオロ化学種の結合対象・非対象と検診高分解能質量分析ワークフロー

このプロトコールは、水および脂質が豊富な魚組織からのジオスミンおよび2-メチルイソボルネオールの抽出のための完全に自動化されたワークフローを示しています。この方法により、これらの分子が臭気の閾値に達する前に早期に検出できます。水産養殖環境からの代表的なデータが提供されます。...

大容量吸着抽出プローブとGC-MSを用いた、水および魚中のGeosminおよび2-メチルイソボルネオールの抽出と検出

学ぶ、水試料からのエストラジオルの自動固相抽出法。低コストで省スペースな装置を用い、免疫学的検出のための効率的な前濃縮を実現します。環境モニタリングにおける有機汚染物質分析に適用可能です。

小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単​​な方法

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小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単な方法