小さな汚染物質の免疫学的分析のための水試料の自動固相抽出ための簡単​​な方法

この試料調製法の全体的な目的は、水試料中の低濃度の有機汚染物質を、ユーザーにとって使いやすく、費用対効果が高く、かつ自動化された方法で前濃縮することです。この手法は、ウェルプレート免疫アッセイやバイオセンサーなどの免疫検出法を用いて水試料の汚染を研究する場合、標準的なSPE（固相抽出）プロセスに代わることができます。この技術の主な利点は、SPEの手順が自動化されており、従来のアプローチと比較して装置の設置面積とコストが低いことです。

さらに、濃縮プロセスの性能は、低溶媒含有量と前濃縮効率の両面において、免疫測定法の分析要件を満たしています。まず、0.2 µmの孔径を持つフィルターを用いて、100 mLの水試料をろ過します。ろ過した試料をGL 45ネジ付きのガラス瓶に入れます。

密閉チューブ内で、脱イオン水でメタノールを希釈し、容量比50%の溶出液を300 µL調製します。次に、ガラスバイアルに入れた40 mgの逆相吸着剤に、メタノール1,600 µL、続いて脱イオン水400 µLを加え、20 mg/mLのオクタデシルシリカ吸着剤粒子の懸濁液を調製します。蓋をしっかりと閉め、ボルテックスミキサーで撹拌します。

孔径11 µmのナイロンメンブレンを、2枚重ねの防塵ティッシュの上に置きます。3 mm径のパンチを用いて、メンブレンから2箇所の小さな円を切り出します。次に、平先フィルター鉗子で切り出したメンブレンの1枚を掴み、カラムの片側に配置します。

次に、フラットボトムコネクターをチューブに取り付けて締め付けます。その後、メンブレンを配置した末端方向を指すように、カラムの本体に矢印を記入します。この状態で、矢印が下を向くようにカラムをホルダーに固定してください。

下部のロックコネクタを使用して、空の10 milliliter使い捨てシリンジをカラムのチューブ端に取り付けます。ボルテックスミキサーで吸着剤懸濁液を撹拌し、100 microlitersをカラムの中央に迅速にピペッティングします。注入しながら、もう一方の手でシリンジを用いて、ピペッティングした溶液をメンブレンを通して緩やかに吸引します。

SPEカラムの調製は非常に重要です。粒子懸濁液をカラムに注入する際、シリンジを用いて溶液をメンブレンから適切に吸引してください。そうしないと、粒子が密に充填されません。

溶液中の粒子を均一に懸濁させるため、すべてのピペッティング操作の間にストック懸濁液を撹拌しながら、前述の工程をさらに2回繰り返します。懸濁液全体をロードし、シリンジで吸引して乾燥させた後、シリンジをそのままの位置に保持し、もう一方の手でピンセットを用いて2枚目のナイロンメンブレンを上に配置します。その後、チューブを用いて2つ目のコネクターを締め付け、シリンジを廃棄します。

この時点で、下部のロックコネクタを使用してSPEデバイスのカラムを固定します。提供されているGL 45セーフティキャップを締め、試料の入ったボトルをデバイスに接続します。溶出液リザーバーに200 µLの溶出液をロードします。

次に、希釈リザーバーに脱イオン水を800 µL注入します。圧力レギュレーターを反時計回りに止まるまで回し、閉位置にあることを確認してください。プロトタイプを起動した後、psetに580、delta psetに30の値を入力します。

圧力レギュレーターを調整するには、ポンプを起動します。次に、pregの読み取り値が320 millibarを下回るが、それに近い値になるまで、圧力レギュレーターを手動で回します。ポンプを停止した後、自動モードコーナーのstartを押してSPE手順を開始します。

SPEの手順が完了したら、サンプルの小瓶を密閉し、ELISA分析を行うまで4〜5°Cの暗所で保存します。システムの洗浄には、GL 45ネジ付きのガラス瓶で、容量比70%のメタノール溶液を10 mL調製します。SPEカラムを取り外し、チューブをコネクタで塞ぎます。

自動モードでクリーニングファイルを選択し、pset、delta pset、およびpregに以前使用したのと同じ圧力設定で開始します。吸着剤充填の再現性は、ガラスバイアルに分注した吸着剤を乾燥させ、重量を測定することで評価しました。注入時間の再現性は、100 milliliterのサンプルを用いて検証しました。

初期サンプルおよび濃縮後のスパイクサンプルの濃度は、市販の17 beta-estradiol ELISAキットを用いて決定した。検量線から、濃縮サンプルのメタノール比率が免疫測定法の感度に影響を与えないことは明らかである。回収率は、脱イオン水で128 ± 22 %、人工海水で107 ± 6 %であった。

適切に実施すれば、SPEカラムの調製は習熟後5分以内に完了します。SPEの手順全体は1時間以内で完了可能です。この手法の開発により、環境科学分野の研究者が小分子有機汚染物質をモニタリングするための免疫検出法の開発を検討する道が開かれました。

このビデオを視聴することで、免疫測定法による汚染物質分析に向けた、コスト効率の高い自動装置を用いた水サンプルの調製方法について十分に理解できるはずです。有機汚染物質や溶媒を取り扱う際は危険が伴うため、この工程を行う際は、適切な手袋や保護ゴーグルの着用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。