脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーションカタユウレイボヤ

Ciona胚における一過性トランスフェクション技術の全体的な目標は、オタマジャクシのような幼虫を形成するために必要な遺伝子調節と機能を研究し、その不変の細胞系譜とコンパクトな無脊椎動物のゲノムを利用して、脊索動物無脊椎動物の起源についての洞察を得ることです。この方法は、幹細胞研究や創薬に関連する脊索動物発生プログラムの保存されたメカニズムなど、分子遺伝学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、胚エレクトロポレーションを使用すると、1日で数百または数千の同期胚を処理できることです。

一般的に、この方法に不慣れな個々の人は、壊れやすい胚の解体のために、そして効率的なマイクロインジェクション技術を開発するのが難しいため、苦労するでしょう。摂氏18度の冷却胚室でシオナの成虫を解剖することから始めます。小さなハサミを使用して、サイフォンの反対側の端と短いサイフォンの側面に切開を行い、その下に卵管と精子管が流れます。

切開部を伸ばして卵管を露出させます。次に、はさみの先端を使用して、卵管を正確に切開します。閉じたハサミで卵管をそっと押し、卵をはがします。

HEPESを含む人工海水が入った6つのウェルプレートに卵を直接落とすのを待ちます。ASWHで事前にすすいだパスツールピペットを使用して、残りの卵を採取して移します。精子を採取するには、ハサミで精管を切断し、別のパスツールピペットを使用して濃縮された精子を採取し、1.5ミリリットルのチューブに移します。

1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに1ミリリットルのASWHと50マイクロリットルのトリスを組み合わせて精子を活性化します。その後、濃縮精子を20マイクロリットル加えてキャップを閉め、チューブを反転させるか、パスツールピペットを使用して穏やかに混合します。次に、卵子の各ウェルに100〜200マイクロリットルの活性精子溶液を加え、ピペッティングで上下させてよく混ぜると、卵子が培地に浮かぶようにします。

接合子を集めてガラス管に分注することにより、デコレーションを開始します。手遠心分離機で、受精卵をGの1200倍で約20秒間回転させ、その後、遠心分離機をゆっくりと停止させます。パスツールピペットでペレットからASWHを取り出します。

各チューブのペレットに4ミリリットルの活性化デコレーション溶液を追加します。.水道水処理されたパスツールピペットを使用して静かに上下にピペッティングし、小さなゴムナシをトッピングして、受精卵を懸濁します。溶液は1〜3分後に黄色がかった色に変わるはずです。

デコレーション中に、パスツールピペットを使用して、デコレーション懸 ?? 液の小さなアリコートを取り除きます。.スライド上に一滴を沈殿させ、解剖顕微鏡で観察します。接合子の懸濁液を上下にピペットで動かし、20〜30秒ごとにスライドを確認します。

最初に卵胞細胞が剥離し、次に絨毛膜が黄色で不透明に変わり、最後に接合子から剥離します。ピンクのデコレーションされた受精卵は、ガラス管の底に沈みます。受精卵の50%以上が脱角化されたら、チューブにASWHを充填します。

非常に穏やかに約10〜15秒間遠心分離し、デコレーションされた接合子を沈殿させるのに十分な量です。遠心分離機をゆっくりと停止します。浮遊物を含むガラス管からほぼすべての液体を取り除き、ASWHと交換します。

ゆっくりとピペットで上下させて洗浄し、前と同じように静かに遠心分離します。絨毛膜の破片がなくなるまで再度洗浄します。重力沈殿物は、シリコン処理された1.5ミリリットルチューブ内のデコレーションされた接合子に洗浄します。

沈殿後、ASWHをチューブの100マイクロリットルマークまで取り除きます。次に、パスツールピペットを使用して、以前に調製した250マイクロリットルのDNAをマンニトール溶液で1本の接合子に添加します。穏やかに混合し、すぐに混合物を4ミリメートルのエレクトロポレーションキュベットに移します。

キュベットをエレクトロポレーションホルダーに入れ、50ボルトで16ミリ秒のシングルパルスを与えます。次に、同じパスツールピペットを使用してキュベットから接合子を取り出し、新鮮なろ過されたASWHを含む培養皿に排出します。皿を攪拌して接合子を広げます。

ASWHのビーカーでピペットをすすぎ、次のサンプルに移ります。すべての接合子をエレクロポレートした後、受精卵を摂氏15〜20度で培養します。マイクロマニピュレーターを摂氏18度の冷却室に設置します。

プラスチックチューブとニードルホルダーを、鉱物油で満たされた10ミリリットルのガラスシリンジに接続します。チューブとニードルホルダーにオイルを埋め戻し、気泡を排出します。注射針を挿入すると、ニードルホルダーに緑色のバイタル染料を含む0.5マイクロリットルの注射液が含まれています。

そして、ホルダーをマイクロマニピュレーターに置きます。ニードルホルダーを調整して、表面に対して45度の角度で直線に沿って移動するようにします。小さなアガロースコーティングされた培養皿にデコリオン化卵をくぼみに沿って向き付け、卵を解剖顕微鏡で1つずつ注入できるようにします。

必要に応じて、アガロースの上に置かれたガラスカバースリップに針をそっと押し付けて、針先を折ってください。針先が開いていることを確認するために、わずかな圧力をかけます。最初に針を卵に導入し、卵膜を壊すためにわずかに吸引することにより、未受精卵を1つずつ注入します。

次に、緑色の注入液を卵の中央に、細胞直径の最大3分の1まで注入します。すべての卵を注入した後、針を抜き、注入した未受精卵を新鮮な培養皿に移し、受精するまで摂氏15〜18度でインキュベートします。マイクロインジェクションは、Ciona intestinalis myelin転写因子、またはMyTのCiona胚の原腸期での調節を研究するために利用されました。

insituハイブリダイゼーションによってモニターすると、野生型の6列目の神経板前駆体に内因性発現が観察されます。転写因子であるフォークヘッドボックスAなどの初期胚性因子をノックダウンするためのモルフォリノスのマイクロインジェクションは、MyTの発現を全体的に排除します。逆に、MyT発現はリンパ節のダウンレギュレーション時に異所性に活性化され、リンパ節は通常、これらの外側神経索前駆体のMyT発現を抑制することを示唆しています。

転写因子GATAaにVenusタグを付け、pfogドライバーを用いて外胚葉割球にエレクトロポレーションしました。ここで見られるように、GATAaは転写因子として予想されるように、主に核に局在しています。一方、金星の表現はどこにでもあります。

このビデオを見れば、エレクトロポレーションによる同期シオナ接合子への一過性トランスフェクションの実施方法、壊れやすいデコリオネーション胚の取り扱い方法、マイクロインジェクションの正しい角度の見つけ方について十分に理解できるはずです。その開発後、これらの技術は機能ゲノミクスへの道を開きました。遺伝子機能、遺伝子制御ネットワーク、およびヒトの組織形成にも重要な発生モジュールの保存を探求すること。