活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション
2010年5月2日
このビデオは利用してニワトリ胚脊髄の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路を可視化する方法を示しています卵のエレクトロポレーション。
こんにちは、私はエルサレムのヘブライ大学の医学神経生物学部のDr.Review Klarの研究室のハムです。こんにちは、私はSophie Esmanで、同じくラースの研究室から来ました。今日は、Innovo、エレクトロポレーション、脊髄オープンブックの準備の手順をお見せします。
私たちの研究室では、この手順を使用して、胚性脊髄の遺伝的に定義されたニューロン集団の軸索軌道を研究しています。それでは始めましょう。この手順を開始するには、受精した白いレグホーン鶏の卵を室温から加湿インキュベーターに移し、できれば摂氏37〜38度のロッキングトレイを使用します。
生存可能で同期した胚を得るためには、インキュベーターの温度と湿度を監視することが重要です。ニワトリの胚は、ハンバーガーとハミルトン、またはエンハンサー依存性特異的発現に最適なステージであるHHステージ18〜20に到達したときにエレクトロポレーションされます。この段階では、頭は胴体に対して直角にあります。
また、HHステージ18〜20では、前後の左右の生命線血管などの余分な胚性血管の広大なセットも見られるはずです。ニワトリの胚は、66時間のインキュベーション後にHHステージ19〜20に到達し、その時点でインキュベーターから卵を取り出した後、水平に置き、5〜10分間待ちます。胚は今、卵の上極に位置しています。
エレクトロペリングに先立って、胚はペニシリン1ミリリットルあたり100単位、ストレプトマイシン1ミリリットルあたり0.1ミリグラムでハンク溶液を調製します。マイクロリットルあたり2〜5マイクログラムのDNAの所望の混合物を調製し、注入されたDNAの視覚化を容易にするために、高速緑色染料を数粒加えます。マウスピペット、滅菌注射針、小さなはさみ、テープも用意してください。
直径0.5mmのガラスキャピラリーをピペットプーラーで引っ張ってマイクロキャピラリーを作製します。タングステン電極をマイクロマニピュレータに配置し、電極をパルス発生器に接続します。パルス発生器の電圧をマイナス30ボルトに、各パルスの長さを50ミリ秒に、パルス数を3に設定します。
胚を露出させて取り扱う前に、エレクトロポレーションに進みます。卵の細い棒に注射器を挿入し、各卵から5〜6ミリリットルのアルブミンを取り除きます。アルブミンはこぼれないように除去されます。
次のステップでカットするときは、小さなハサミを使ってカットします。ひよこの胚を明らかにした後、卵の上側に楕円形の窓を開き、0.5〜1ミリリットルのハンクとペニシリンストレプトマイシン溶液で湿らせます。次に、口のパーペットを使用してガラスマイクロキャピラリーをロードします。
DNA色素混合物を使用すると、正しい直径のマイクロキャピラリーにDNAが簡単にロードされます。両眼位置下で、DNAを神経管に注入するための胚。胚の尻尾を手前に向けて置きます。
この発達段階では、脊髄がはっきりと見えるため、対照的な技術は必要ありません。脊髄は頭と尾端の両方で密閉されています。ただし、マイクロキャピラリーパンクにより神経管により多くの穴が開き、浅い角度で貫通するため、十分に薄くて正しい直径のマイクロキャピラリーは、チューブを損傷することなくチューブを貫通するはずです。
口のパーペットを使用してDNAを注入します。正しい直径のマイクロキャピラリーは、定期的に呼気してDNAを放出するはずです。緑色の染料は、尾の先端から発達中の脳の小胞まで広がるはずです。
神経管がDNAで満たされるまで注入し、注入されたDNAが細胞に入るためにはまずエレクトロポレーションが必要です。電極を神経管と平行に配置し、神経管自体に触れないようにできるだけ神経管の近くに配置します。パルス中の導電性を確保するために、電極が液体で覆われていることを確認してください。
通常、胚を露出させた直後に添加したハンク溶液で十分です。しかし、電極を配置し、液体パルスに沈めて電気操作するためにパルスの直前にハンクの溶液を1滴も飲まない場合は、電極を慎重に取り外し、窓と卵をテープで密封します。次の孵卵期間中の胚の乾燥を防ぐために、卵子を完全に密封することが重要です。
卵をインキュベーターに戻し、ひよこの胚が発生胚に達するまでインキュベートします。6日目またはE6日目、エレクトロポレーションされた胚が発生胚に達したときのイメージングの時間です。エレクトロポレーションの6日目、E6日後3日後、卵から取り出し、PBSを含むシリコンコーティングされたシャーレに細いハサミで入れます。
膜を切り取り、シリコンに押し込まれたピンを使用して胚を腹側に伸ばして所定の位置に保持します。鋭利なタングステンマイクロキャピラリーを使用。ルーフプレートに沿って後脳から尾まで縦方向に切開します。
脊髄の両側にさらに2つの縦方向の切開を行い、脊髄から後根神経節またはDRGを分離します。尾から後脳までの組織から床板を取り外し、脊髄をそのままにします。最後に、細いハサミを使って後脳の横断面に脊髄を切断し、脊髄を体から分離します。
脊髄が分離されたので、PBSを含む新しいシリコンコーティングされたペトリ皿に広げ、ピンを使用して後脳から尾に保持し、フラットマウントの準備を作成します。脊髄をPBSの4%パラアルデヒドに1時間室温免疫染色で固定します 免疫組織化学手順、脊髄を開くための詳細および付随する書面によるプロトコル。イメージングのための本の準備。
スライド上にグリースまたはシリコンを長方形に広げ、長方形内にPBSを滴下します。ピンセットを使用して脊髄を配置し、長方形の中央を伸ばして、その周りに液体を引き出します。ペット1匹につきパスタ1個につき、脊髄に1〜2滴の封入剤をセットし、カバースリップで覆います。
カバースリップに圧力をかけます。気泡を避けるため。スライドを摂氏4度の暗所に保ちます。
共焦点顕微鏡を使用して脊髄を検査します。これは、CMVからのユビキタスエンハンサー要素を利用してすべてのニューロンでRFPが発現する制御実験におけるニワトリ脊椎間ニューロンの軸索拒絶の代表的な結果であり、ほとんどのニューロンとその軸索が標識されています。ニューロン亜集団の軸索軌道を解読することは不可能です。
しかし、特定の増強要素を適用すると、この例では、特定の亜集団DIの2つのニューロンの定義された軸索経路が明らかになります。そこで、E3で特定のニューロンエンハンサーを使用して頬の神経管を電気操作する方法と、E6でオープンブックの脊髄を準備する方法を紹介しました。この手順を行うときは、注意して忍耐強くなることを忘れないでください。
というわけで、これです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。がんばって。
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概要
このビデオは、体内での電気泳動を使用して、胚のニワトリ脊髄における遺伝的に定義されたニューロンの軸索経路を可視化するための手順を示しています。この方法により、研究者は軸索の軌道を効果的に研究することができます。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 発生生物学
- 電気生理学
背景
- 軸索経路の理解は神経科学研究にとって重要です。
- 体内での電気泳動は報告遺伝子を導入するために使用される技術です。
- 胚のニワトリ脊髄はニューロンの発達を研究するためのモデルとして機能します。
- 遺伝的に定義されたニューロン集団は特定の神経回路に関する洞察を提供することができます。
研究の目的
- 胚の脊髄における軸索経路を可視化すること。
- 遺伝子発現研究に体内での電気泳動を利用すること。
- ニューロンの発達と接続性の理解を深めること。
使用された方法
- 受精したニワトリの卵を加湿されたインキュベーターに移す。
- インキュベーションを摂氏37度から38度で維持する。
- 報告遺伝子を導入するために体内での電気泳動を行う。
- 可視化のための脊髄のオープンブック調製を準備する。
主な結果
- 脊髄における軸索経路の成功的な可視化。
- 体内での電気泳動の有効性の実証。
- 遺伝的に定義されたニューロン集団の軌道の洞察。
- ニューロンの発達を研究するための信頼できる方法の確立。
結論
- この方法は神経科学研究のための価値あるツールを提供します。
- 体内での電気泳動は胚のモデルにおける遺伝子送達に効果的です。
- 軸索経路の理解は神経回路形成に関する研究に情報を提供します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables precise visualization of axonal trajectories in genetically defined neuronal populations, addressing a key challenge in target validation where bilateral labeling obscures ipsilateral versus contralateral projections. By restricting reporter expression to one side of the neural tube via unilateral in ovo electroporation, researchers achieve mechanistic de-risking of neuronal circuit hypotheses early in discovery. The approach supports predictive confidence in target selection by clarifying pathway-specific connectivity patterns relevant to neurodevelopmental disease models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating axonal projections of specific neuronal subpopulations defined by enhancer-driven reporters.
- Operational Value: Provides unilateral labeling to distinguish ipsi- and contra-laterally projecting axons, reducing ambiguity in circuit mapping.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of targets by clarifying whether a neuronal population engages excitatory or inhibitory pathways critical for disease mechanism.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable axonal trajectory data as a phenotypic readout for screening genetic or pharmacological modulators of neuronal guidance.
- Operational Value: Produces standardized, reproducible whole-mount preparations compatible with high-resolution confocal imaging and automated analysis pipelines.
- Scalability Value: Utilizes chick embryo model amenable to scale for multi-condition testing of enhancer activity or electroporation efficiency.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Maps disease-relevant axonal pathways in vertebrate spinal cord models, enabling alignment with human neurodevelopmental disorder biomarkers.
- Mechanistic Continuity: Bridges discovery-stage target validation with preclinical assessment of circuit-level drug effects on axonal growth or guidance.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing whether a target modulates specific projection patterns linked to functional recovery or pathology.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis generation through lead identification, providing mechanistic insights that precede functional assay development and support translational biomarker alignment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of enhancer-specific gene expression in defining neuronal subpopulations and their axonal trajectories.
- Screening: Enables assay-ready biological systems with standardized, unilateral reporter expression for evaluating compound effects on axon guidance.
- Analytics: Delivers quantitative spatial readouts of axonal projection patterns, facilitating comparison across genetic or treatment conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing disease-relevant axonal pathway models for biomarker correlation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative testing of genetic constructs, enhancer elements, or electroporation parameters across multiple neuronal targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving axonal projection directionality, a critical factor in assessing circuit-specific drug effects.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through defined electroporation parameters (voltage, pulse length, number) and staged embryo handling.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets whose axonal pathways are misaligned with desired therapeutic mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets that modulate specific projection patterns relevant to clinical endpoints in neurodevelopmental indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryological techniques, including embryo staging, microinjection, and electroporation parameter optimization.
- Depends on instrumentation such as pulse generators, micro manipulators, tungsten electrodes, and confocal microscopy for imaging.
- Necessitates standardization of DNA concentration, enhancer element selection, and electrode placement across users and labs for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when transferring the model to other vertebrate systems or neuronal types beyond spinal interneurons.
- Practical limitations include embryo viability sensitivity to incubation conditions and the technical challenge of achieving uniform unilateral electroporation without tube damage.
