Name: 活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-02T20:17:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶヒヨコ胚の脊髄における遺伝的に定義された神経細胞の軸索経路の可視化法。in ovoエレクトロポレーションを用いて神経回路の発生と接続性を研究する手法を解説します。

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この作品は、イスラエル科学財団、健康のイスラエル省、およびDFG（ドイツ研究協会）からAKへの補助金によって支えられている。

I.エレクトロ卵の取り扱い<ol><li>ロッキングトレイ付きインキュベーター° C、好ましくは37から38への加湿インキュベーターセットに卵を置きます。 </li><li>胚は、彼らはハンバーガー＆ハミルトン（HH）ステージ18から20に到達したときに、インキュベーションの約66時間後に電気穿孔されています。この段階で頭がトランク（頸屈と呼ばれる状態）に直角に位置し、そのような、前方後方、左右の卵黄静脈のような余分な胚の血管の広大なセットを見られるべきである。これは、エンハンサー依存性の特異的発現を1,3,4に最適なステージです。それは生存可能と同期胚を得るために、インキュベーターの温度と湿度を監視することが重要です。 </li><li>インキュベーションの66時間後、インキュベーターから卵を取り除く。水平に卵を置きます。 5〜10分待ちます。胚は、現在卵の上極に位置しています。 </li></ol>準備<ol><li>ペニシリン/ストレプトマイシン（P / S）（1:100希釈）とのハンクス溶液を準備します。 </li><li>マイクロキャピラリーにガラスキャピラリーを（直径0.5mm）を引き出します。 </li><li>マイクロマニピュレータに電極（タングステン）を配置し、パルス発生器（ECM 830）に電極を接続する。 </li><li> - 3、パルス50msの長さは電圧30V、パルスの数：次のパラメータを使用してパルス発生器を調整します。 </li><li>口の中のピペット、シリンジの針やテープを準備します。 </li><li> DNA（2-5μg/μl）の所望の混合物を準備し、ファストグリーン色素を追加します。 </li></ol> Windowingとエレクトロポレーション<ol><li>シリンジを用いて、それぞれの卵からアルブミンの5-6 mlを削除します。 </li><li>小さなはさみで卵の上側に楕円形のウィンドウを開きます。 </li><li> 0.5〜1ミリリットルハンクス+ P / Sソリューションと胚しっとり。 </li><li> DNAの混合物とマイクロキャピラリーガラスをロードするために、口のピペットを使用してください。 </li><li>あなたに向かって尾で胚を置きます。この段階で、胚の脊髄は、はっきりと見られている。したがって、何対照的なテクニックは必要ありません。脊髄は、両端、頭部と尾部で密封されていますが、あなたのマイクロキャピラリーが十分に薄い場合には、穿刺小さな穴をすることができると浅い角度で神経管を貫通される。右の直径のマイクロキャピラリーはそれを損傷することなくチューブを貫通し、定期的な呼気でDNAを放出、DNAで簡単にロードする必要があります。 </li><li>口のピペットを用いてDNAを注入する。緑色の染料は、脳の発達の小胞にまで尾の先端から広がるはず。 </li><li>チューブ自体とパルスを触れることなく、はできるだけ近くに、神経管に平行に電極を配置。パルスの時に、電極が電気伝導を可能にするための液体で覆われている必要があります。通常、ハンクの物乞いで追加されたの量は十分です。パルスのハンクの直前の一滴を追加する場合ではない。 </li><li>慎重に電極を取り外して、テープで窓をシール。以下の潜伏期間中に胚の乾燥を防ぐために、完全に卵を密封することが重要です。 </li><li>バックインキュベーターに卵を置きます。 </li></ol> II。脊髄のオープンブックの準備胚から脊髄の脱離<ol><li>卵から、E6で、eletroporated胚を削除し、PBSを含有するシリコーンでコーティングしたペトリ皿に入れてください。 </li><li>膜を切り取ると、それを保持するためのピンを使用して、彼の腹側に胚を伸ばす​​。 </li><li>鋭いタングステンを使用すると、ダウンテールに後脳から、屋根板に沿って縦切開を作る微小毛細血管。 </li><li>離れて脊髄から後根神経節（DRGS）を切り離し、脊髄の両側にさらに2つの縦方向の切開を加えます。 </li><li>脊髄はそのままに、テールから後脳に始まる組織から床板を外してください。 </li><li>細かいハサミを使って後脳での横断面で脊髄を切断し、本体から分離する。 </li></ol>固定<ol><li>後脳からフラットマウント製剤を製造する尾にそれを保持するためにピンを使用してPBSを、、を含むシリコンを塗布した新しいペトリ皿の中で孤立した脊髄を広げる。 </li><li>皿からPBSを注ぎ、リン酸緩衝生理食塩水で4％パラホルムアルデヒドと交換してください。 </li><li> 1時間室温でインキュベートする。 </li></ol>免疫組織化学<ol><li> PBSで一次抗体を含むバイアルに固定された脊髄を転送します。 </li><li> 4℃で一晩穏やかな扇動でインキュベート℃に</li><li> PBSで抗体X5回、穏やかな扇動と1時間ごとに洗浄を洗う。 </li><li>二次抗体を追加し、4℃で一晩穏やかな扇動でインキュベート℃に</li><li>それぞれ、PBSで抗体X5回洗浄する穏やかな扇動で1時間洗浄してください。 </li></ol>イメージング用取付開いた本<ol><li>スミアのグリースまたはシリコンスライド上に四角形状にし、内にPBSを滴下。 </li><li>ピンセットを使用して四角形の中央に張ら脊髄を置き、パスツールピペットを用いてその周りに液体を引き出す。 </li><li>脊髄への搭載メディアの1〜2滴を置き、カバースリップでカバーしています。スカッシュは、空気の泡を避けるために。 </li><li> 4℃で暗所でスライドしてください</li><li>共焦点顕微鏡を用いて脊髄を検査する。 </li></ol>

<ol><li>Zisman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolysis+and+membrane+capture+of+F-spondin+generates+combinatorial+guidance+cues+from+a+single+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteolysis and membrane capture of F-spondin generates combinatorial guidance cues from a single molecule.</a> J Cell Biol. 178 (7), 1237-1249 (2007).</li>
<li>Arakawa, T., Iwashita, M., Matsuzaki, F., Suzuki, T., Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paths%2C+elongation%2C+and+projections+of+ascending+chick+embryonic+spinal+commissural+neurons+after+crossing+the+floor+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Paths, elongation, and projections of ascending chick embryonic spinal commissural neurons after crossing the floor plate.</a> Brain Res. 1223, 25-33 (2008).</li>
<li>Avraham, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+axonal+guidance+and+sorting+in+dorsal+interneurons+by+the+Lim-HD+proteins+Lhx9+and+Lhx1%5BTitle%5D)+AND+%22+Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of axonal guidance and sorting in dorsal interneurons by the Lim-HD proteins Lhx9 and Lhx1.</a> Neural Dev. 4 (1), 21(2009).</li>
<li>Timmer, J., Johnson, J., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+in+ovo+electroporation+for+the+rapid+analysis+of+neural-specific+murine+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The use of in ovo electroporation for the rapid analysis of neural-specific murine enhancers.</a> Genesis. 29 (3), 123-132 (2001).</li>
<li>Reeber, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Robo+expression+in+vivo+perturbs+commissural+axon+pathfinding+in+the+chick+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Manipulating Robo expression in vivo perturbs commissural axon pathfinding in the chick spinal cord.</a> J Neurosci. 28 (35), 8698-8708 (2008).</li>
</ol>

ニワトリ胚へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションは、生体内異所性発現のための強力な技術として進化しています。特定のエンハンサー、およびニワトリのエレクトロポレーションの組み合わせは、神経細胞1,3,5の遺伝学的に定義されたグループの軸索経路を解読するための迅速かつ効率的なツールを提供しています。のCre / loxP部位とGal4/UAS増幅システムを活用すれば、表現のレベルと持続時間を増やすことができます。新興写真は、その軸索突起の方向によって定義された介在ニューロンの亜集団、から生じる軸索手がかりの複雑な相違である。さらに、2つの神経集団の同時分子との空間制限されたラベルを得ることができる。従って、神経回路3のアーキテクチャに関する情報を提供する。

活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

神経細胞におけるレポーター遺伝子の発現を駆動するエンハンサーエレメントの雇用は、軸索投射を追跡するために広く使用されているパラダイムである。脊椎動物における脊髄介在ニューロンの軸索投射を追跡するために、生殖細胞ラインをターゲットとしたレポーター遺伝子としては、左右対称ラベルをもたらす。したがって、それは、IPSI -＆コントラ横方向に突出する軸索を区別するのは困難です。ひよこ神経管への一方的なエレクトロポレーションは、中枢神経系の一方の側にレポーター遺伝子の発現を制限するために、そして両側に軸索投射に従うことが有用な手段を提供します。<sup&gt; 1 ,2 - 5</sup&gt;。このビデオでは、注射前に卵を処理する方法を第一を示しています。 HHステージ18から20で、DNAは神経管の仙骨レベルに注入され、その後、タングステン電極は、胚に平行に配置され、短い電気パルスは、パルス発生器で投与されています。卵は、テープで密封し、さらなる発展のためにインキュベーターに戻されます。三日後（E6）脊髄は、胚から開いた本の準備として除去固定されており、全体のマウントの抗体染色のために処理されます。ステンド脊髄は、スライド上にマウントし、共焦点顕微鏡を用いて可視化されています。

このビデオは利用してニワトリ胚脊髄の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路を可視化する方法を示しています<em&gt;卵の</em特定のエンハンサーエレメントの制御下にレポーター遺伝子の&gt;エレクトロポレーション。

ニューロンにおいてレポーター遺伝子の発現を誘導するためにエンハンサー要素を利用することは、軸索投射を追跡するための広く用いられているパラダイムである。追跡のために...

こんにちは。私はエルサレム・ヘブライ大学医学神経生物学部のDr. Review Klarの研究室のHamです。こんにちは、Sophie Esmanです。私もLarsの研究室に所属しています。今日は、in vivoでのエレクトロポレーションおよび脊髄のオープンブック標本作成の手順について説明します。当研究室では、胚脊髄における遺伝的に定義された神経細胞集団の軸索走行を研究するために、この手順を用いています。それでは、始めていきましょう。まず、受精したホワイトレグホン鶏卵を室温から、できればロッキングトレイを備えた37から38°Cの加湿インキュベーターに移します。生存可能で同調した胚を得るためには、インキュベーターの温度と湿度を監視することが重要です。ニワトリ胚は、エンハンサー依存的な特異的発現に最適なステージである、ハンバーガーおよびハミルトン（HH）ステージ18から20に達した時に電気穿孔されます。このステージでは、頭部が体幹に対して直角に位置しています。また、HHステージ18から20において、前方の血管、後方の左右のバイタルライン血管などの広範な胚外血管も観察されるはずです。ニワトリ胚は孵化後66時間でHHステージ19から20に達するため、その時点でインキュベーターから卵を取り出します。卵を取り出した後、卵を水平に置き、5分から10分間待ちます。これにより、胚は卵の上極に位置することになります。電穿孔法の前に、100 units/mLのペニシリンと0.1 mg/mLのストレプトマイシンを含むHank's溶液を調製します。2〜5 µg/µLの濃度で目的のDNA混合液を調製し、注入したDNAを容易に可視化するためにファストグリーン染料を少量加えます。また、マウスピペット、滅菌済みの注射針、小型の鋏、およびテープを用意しておきます。ピペットプラーを用いて直径0.5 millimeterのガラスキャピラリーを延伸し、マイクロキャピラリーを作製します。タングステン電極をマイクロマニピュレーターに装着し、電極をパルスジェネレーターに接続します。パルスジェネレーターの電圧をminus 30 voltsに、パルス幅を50 millisecondsに、パルス数を3回に設定します。胚を露出させて扱う前に、エレクトロポレーションに進みます。卵の狭極側にシリンジを挿入し、各卵から5〜6 mLのアルブミンを除去します。これは、アルブミンが漏れ出すのを防ぐために行います。次のステップで切断する際は、小さなはさみを使用してください。雛の胚を露出させた後、卵の上側に楕円形の窓を開け、0.5から1 mLのHanks液およびペニシリン・ストレプトマイシン溶液で湿らせます。次に、マウスピペットを使用してガラスマイクロキャピラリーに液を充填します。DNA染色剤混合液を用いて、適切な直径のマイクロキャピラリにDNAを容易に充填します。実体顕微鏡下で、神経管にDNAを注入するための胚を配置します。胚の尾側が自分の方を向くように置いてください。この発達段階では、脊髄が鮮明に視認できるため、コントラストを付けるための手法は必要ありません。脊髄は頭側と尾側の両端で密閉されています。しかし、マイクロキャピラリーで穿刺する際は、神経管により多くの穴を開け、浅い角度で貫通させます。十分に細く、適切な直径のマイクロキャピラリーを使用すれば、神経管を損傷させることなく貫通させることができます。マウスピペットを用いてDNAを注入します。適切な直径のマイクロキャピラリーを使用し、規則的な呼気でDNAを放出させてください。緑色の色素が尾の先端から発達中の脳の脳室まで広がるはずです。神経管がDNAで満たされるまで注入します。注入したDNAを細胞内に導入するには、電気穿孔法が必要です。まず、電極を神経管と平行に、かつ神経管自体に触れない限り限り近接して配置します。パルス発生時に電気伝導性を確保するため、電極が液体に浸っていることを確認してください。通常は、胚を露出させた直後に添加したHank液で十分です。しかし、不十分な場合は、電極を配置して液体に浸した状態で、パルスを加える直前にHank液を1滴加え、電気穿孔を行います。その後、電極を慎重に取り除き、窓と卵をテープで密封します。その後の培養期間中に胚が乾燥するのを防ぐため、卵を完全に密封することが重要です。卵をインキュベーターに戻し、雛胚が胚発生6日目（E6）に達するまで培養します。エレクトロポレーションを行った胚が胚発生6日目（E6）に達し、イメージングの時期（エレクトロポレーションの3日後）になったら、細いハサミを用いて卵から取り出し、PBSを入れたシリコンコーティング済みのペトリ皿に配置します。膜を取り除き、胚の腹側を伸ばして、シリコンに刺したピンで固定します。鋭いタングステン製マイクロキャピラリーを用い、後脳から尾側にかけて、 roof plate に沿って縦方向に切開します。脊髄の両側にさらに2本の縦切開を加え、後根神経節（DRG）を脊髄から切り離します。尾側から後脳に向かって床板を組織から切り離し、脊髄はそのまま残します。最後に、微細剪刀を用いて後脳の位置で脊髄を横断的に切断し、脊髄を体から分離します。脊髄を分離したので、PBSを入れた新しいシリコンコーティング済みのペトリ皿に広げ、後脳から尾端までピンで固定して、フラットマウント標本を作成します。脊髄を4%パラホルムアルデヒド含有PBS中で室温で1時間固定し、脊髄を展いた状態でマウントするための、詳細な付随書面プロトコルに従って免疫染色を行います。その後、イメージングのための標本作成を行います。スライド上にグリースまたはシリコンを長方形に塗り、その長方形の内側にPBSを滴下します。ピンセットを用いて、脊髄を長方形の中央に伸ばすように配置し、周囲の液体を吸い取ります。パスツールピペットを使用して封入剤を脊髄の上に1〜2滴滴下し、カバーガラスで覆います。カバーガラスに圧力をかけます。気泡が入らないようにしてください。スライドは4 °Cの暗所で保存します。共焦点顕微鏡を用いて脊髄を観察します。ここでは、CMV由来の遍在性エンハンサーエレメントを利用してすべてのニューロンにRFPを発現させた対照実験における、ニワトリ脊髄介在ニューロンの軸索投射の代表的な結果を示します。ほとんどのニューロンとその軸索が標識されているため、ニューロン亜集団の軸索経路を判別することは不可能です。しかし、特定の増強因子を適用すると、この例では特定のサブポピュレーションであるDI2ニューロンの明確な軸索経路が明らかになります。以上で、E3における特定のニューロン増強因子を用いた鶏神経管の電導入方法と、E6における脊髄のオープンブック標本の作製方法について説明しました。この手順を行う際は、慎重かつ根気強く取り組むことが重要です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りしております。それでは、頑張ってください。

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生物学

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