ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

この手順の全体的な目標は、微生物が実験室の条件で進化できるようにすることです。この方法は、副腎機能の関係、ストレス反応、代謝工学、そしてもちろん進化など、微生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、特定の実験室条件下で最も訴えられた子孫を連続的に選択することです。

この手順は、テキストプロトコルで説明されているように、機器、および初期媒体、応力媒体、および高応力媒体の準備から開始します。単一のコロニーまたは野生型大腸菌を、4ミリリットルの初期培地を含む15ミリリットルの試験管に接種します。試験管を振盪インキュベーターで摂氏37度、rpm220rpmで12時間インキュベー

ケモスタットジャーをインキュベートし、摂氏37度で6時間曝気および攪拌します。インキュベーション後、ポンプからのシリコンチューブの端部をケモスタットジャーに無菌的に接続します。1ミリリットルのプレカルチャーをケモスタットジャーに無菌的に移します。

出口ポンプを始動し、指数関数的段階で培養物を収集します。アウトレットチューブからの培養物の600ナノメートルでの光学密度を確認します。次に、インレットポンプを始動します。

24時間ごとに、出口チューブから600ナノメートルの培養物の光学密度を確認します。ケモスタットを96時間(9.6の完全なターンオーバー)操作した後、リザーバーを最低濃度の高応力媒体に交換します。リザーバーを高ストレス培地に交換すると、細胞に衝撃を与える可能性があります。

細胞密度が低すぎる場合は、細胞密度を回復するために、高ストレス培地への供給をしばらく停止します。光学密度が0.2未満の場合は、給餌入口ポンプを6時間停止します。インレットポンプを再起動し、光学濃度が0.2を超えていることを確認します。

ストレッサーの濃度を徐々に増やし、ストレッサーの濃度が高いリザーバーに変更します。適応した培養物がストレッサー適応のマイルストーンに達するたびにサンプルを採取し、さらなるゲノム解析のために保存します。サンプルの保存には、0.5ミリリットルの培養サンプルを滅菌した80%グリセロール溶液0.5リットルと混合し、摂氏80度で保存します。

培地と同じ濃度で同じストレッサーを含む1.6%agerプレート培地を準備します。ケモスタットからの出口培養物0.1ミリリットルをプレートに盛り付け、摂氏37度で16時間インキュベートします。インキュベーション後、滅菌爪楊枝を使用してプレートから単一のコロニーを採取し、ケモスタットと同じストレッサーを含み、同じ中濃度の15ミリリットルの試験管に接種します。

6時間インキュベートします。1ミリリットルの培養ブロスを、50ミリリットルの培地が入った250ミリリットルの三角フラスコに移します。1時間ごとに0.5ミリリットルの培養液を採取し、600ナノメートルの光学密度を測定します。

適応した株の成長率を、ストレッサーを与えられた野生型株の成長率と比較します。野生型大腸菌株は、高コハク酸ストレス条件下で270日間進化し、これは約930世代に相当します。コハク酸ストレスが高まると、バイオマス濃度はすぐに下げられ、その後回復しました。

ここに示されているのは、高いコハク酸ストレスに対して耐性のある変異体によるケモスタットの概略図です。ほとんどの野生型細胞はストレス条件下で洗い流され、変異体はより増殖します。最終的に、突然変異の子孫の人口は増加します。

2番目と3番目の突然変異は、ケモスタットのために継続的に選択され、最終的には優勢になります。この図は、適応株が高コハク酸ストレス条件下で遅延なく成長したのに対し、野生型株は成長しなかったことを示しています。同様の戦略は、ストレッサーのバリエーションを持つケモスタットを使用した適応実験室の進化にも適用できます。

このビデオを見た後、指定された条件下で微生物を獲得し進化させる方法についてよく理解しているはずです。一度習得すると、このテクニックは数ヶ月で行うことができます。この手順を試行する際には、一度にストレスをかけすぎてケモスタット細胞を洗い流さないようにすること、そして毎日光学濃度をチェックすることを忘れないでください。

この手順に続いて、ゲノム解析やトランスクリプトーム解析などの方法を実行して、ストレス耐性の進化に寄与する突然変異などの追加の質問に答えることができますか?