細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

このプロトコルは、エッチングされたトポグラフィーガイダンスキューとハイドロゲルバイオインクを持つ細胞の精密な堆積を組み込んだ自動ロボット堆積システムを使用したバイオプリンティング方法論を説明しています。印刷されたセルは、エッチングされた形状に直接送達され、それらを使用して感知し、方向付けすることができます。

この自動ロボット分注技術の全体的な目標は、トポグラフィー細胞誘導のための表面を作成し、プログラムされたパターンに従って細胞をこれらの特徴に送達し、細胞の挙動と分布を制御できるようにすることです。この方法は、モノカルチャーと共培養の両方で、表面トポロジーが細胞の挙動にどのように影響するかなど、生物医学工学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、より確立された方法と比較して、細胞誘導パターンのプログラミングと印刷にかかる時間が短縮されることです。

また、制御された分注のための細胞送達ステップも含まれています。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、ハイドロゲルに堆積した細胞の2Dパターンが表面誘導の恩恵を受けることに気付いたときでした。そこで、表面の特徴にマッチした方法でハイドロゲルをプリントするために、この技術を開発しました。

このプロトコルでは、表面エッチングおよび押出ベースのバイオプリンターとしての背圧支援ロボット ディスペンス システムの使用について説明します。エッチングと印刷用のポリスチレン表面を準備するには、厚さ1mmのポリスチレンシートを選択します。厚いシートは、より曲がります。

次に、シートを酸素プラズマで処理します。酸素ガスレギュレーターを2バールに設定します。次に、プラズママシンのスイッチを入れ、真空ポンプをオンにします。

150ワットと毎分30標準立方センチメートルの酸素ガスの流れでマシンをプログラムし、シートをこれらの条件に10分間さらします。その後、チャンバーを排気し、ドアを密閉してサイクルを開始します。次に、処理したシートを純粋なウシ胎児血清に沈め、撹拌しながら摂氏37度で2時間インキュベー

血清処理後、シートを1X PBSで3回洗浄し、シートを滅菌します。最後の洗浄後、シートを摂氏37度のオーブンに入れて、一晩約12時間乾燥させます。まず、エッチング用の印刷スタイラスを準備します。

細心の注意を払って、直径1.5ミリメートルの繊維針を分注シリンジのノズルに挿入し、くさびで固定します。バイオプリントの配置を最初に作成しようとするときは、番号付きの軸を持つグラフ用紙に目的のパターンをスケッチして、x、y座標を生成します。次に、パターンの座標をスプレッドシートに入力します。

次に、印刷ソフトウェアで、[プログラム]、[プログラムの追加]の順に選択し、次に[編集]、[ポイントの追加]を選択してプログラムを確立します。次に、スプレッドシートからx座標値とy座標値を印刷ディスペンスソフトウェアにコピーします。各実行の前に、ロボットの z 高さをキャリブレーションして、スタイラスの接触位置を設定します。

まず、ロボットオプションを選択します。次に、[モードの変更]をクリックして、[ティーチングモード]オプションを有効にします。これにより、ロボットのJOG機能が有効になります。

ロボットを JOG するには、まず [Robot]、[Meca Initialize] の順に選択して、ロボットを既定の位置に配置します。次に、ロボット、ジョッグ。次に、x スロットと y スロットに、スタイラスをパターンの原点に正確に配置するために必要な距離をミリメートル単位で入力します。

次に、同じくミリメートル単位で、zスロットに数値を入力して、表面を曲げたりへこませたりせずに、スタイラスまたはノズルを表面に接触させます。これは z の開始値として指定されます。各溝の深さは、z 高さを使用して変更できます。

たとえば、カット溝の深さは 40 ミクロン、80 ミクロン、または 170 ミクロンです。スタイラスの曲がりや表面の目立ったへこみがないような接触点を見つけるには、集中力と綿密な観察が必要です。成功を確実にするために、いくつかのシートを準備し、プログラムを異なるz高さで実行して、理想的な開始位置を見つけることをお勧めします。

次のステップは、各座標点の印刷指示を定義することです。[ラインディスペンスの開始] を使用して、最初のポイントと印刷開始を定義します。ラインパッシングを使用して中間ポイントを指定し、最後にエンドオブラインディスペンスを使用してロボットに信号を送り、印刷実行を終了します。

プログラムをロボットに伝達するには、[ロボット]、[C&T データの送信] の順に選択します。次に、[ロボット]、[モードの変更]、[実行モードの切り替え]の順に選択し、設定を[実行]に切り替えて、実行を開始します。いよいよ印刷開始です。

バイオインクを作るには、10%FBSと2%抗生物質の抗真菌薬を補給したAlpha MEMに2%ゼラチンを溶かします。培地を摂氏60度に2時間置き、ゼラチンを培地に溶解させます。バイオインクの細胞を10cmの皿で70%コンフルエントまで培養します。

表面誘導機能に応答する任意の細胞を使用することができ、埋め込みプロセス中に見られるように蛍光標識を発現する必要があります。培地を取り出し、細胞をPBSで洗浄し、細胞を1X Trypsin-EDTA溶液で摂氏37度で5分間コーティングすることにより、付着した細胞を懸濁液に放出します。媒体でトリプシンを中和した後、懸濁液中の細胞を収集し、5分間1, 000 gでそれらをペレット化します。

上清を説明し、細胞を0.5ミリリットルの培地に再懸濁します。細胞密度を測定した後、懸濁液を冷却したバイオインク溶液に混合して、ミリメートルあたり500万個の細胞を含む溶液を作ります。次に、細胞を含むバイオインクを、ルアーキャップでブロックした準備済みの印刷シリンジに注ぎます。

装填したシリンジを4°Cまで冷やし、印刷可能な粘度にします。次に、セットして冷やしたシリンジを取り出し、シリンジキャップを取り外してプリントノズルを取り付けます。次に、装填したシリンジを分注システムに取り付け、空気圧ラインに接続します。

事前にデザインされたパターンにバイオインクを印刷するには、エッジとラインがはっきりしている必要があります。精密な印刷は、ディスペンサーとプリントノズルのニードルゲージの背圧を最適化することで実現しています。ディスペンサーの背圧を0.05メガパスカルに設定し、34ゲージのテーパー針を備えた10ミリリットルのシリンジを使用します。

次に、ソフトウェアで、ポリスチレンフィルムの表面への書き込み速度を毎秒5ミリメートルに設定します。次に、プログラムされたパターンに従って、細胞化されたバイオインクを事前にエッチングされた溝に堆積させます。細胞を沈着させた後、シートを室温で20分間インキュベートします。

その後、印刷した細胞足場を適切な増殖培地で覆い、細胞を24時間インキュベートして、細胞が付着してからさらに実験を行います。バイオインク内でバイオプリンティングによって播種された幹細胞は、最終的に表面に沈殿し、目立たないようにエッチングされた線の方向に沿って感知され、伸びました。バイオプリンティングなしで培地に播種した細胞も、特徴の方向に整列しました。

しかし、それらはまた表面全体を覆っていたため、バイオインクは細胞を印刷されたトレースに制約しました。エッチングされた特徴のないシートに播種すると、細胞は配向や整列を示さなかった。このビデオを見れば、ポリスチレンシートに溝を正確にエッチングし、その溝に細胞を正確にバイオプリントする方法を理解できるはずです。

一度習得すれば、このテクニックは約2〜3時間で完了します。バイオエンジニアリングの分野の研究者にとって、細胞の異方性と位置決めが必要なモデルで細胞表面の相互作用を明らかにすることは非常に有用です。バイオインクには生細胞が含まれており、シートを印刷する際には滅菌技術を使用することが非常に重要です。