三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率
September 22nd, 2015
A デカルトバイオプリンターは、正確で再現性のある形状でのマルチマテリアル堆積を可能にすると同時に、環境要因の制御を可能にするように設計および製造されました。3次元バイオプリンターを利用することで、複雑で実行可能な構築物を印刷し、簡単に再現することができます。
この手順の全体的な目標は、3D Bioprintを使用して、複雑な形状の生存細胞を含むコンストラクトを生成することです。これは、最初にヒト脂肪組織間質細胞を培養物から単離することによって達成されます。次に、細胞を新たに調製した酸化RGD標識アルギン酸バイオインクと混合します。
最終ステップでは、生体材料中の細胞LAがバイオプリンティングによって押し出されます。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して、バイオプリントされた細胞の生存率、増殖、および遊走を解析します。スキャフォールド形成や細胞播種などの既存の手順に対するこの手順の主な利点は、当社の手順では、組織を形成するために必要な場所に細胞と細胞凝集体を正確に配置できることです。
今日、手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるサラ・グレース・デニスです。細胞培養インキュベーターでの拡張のために、15ミリリットルの低グルコースTMEMで処理されたT 75フラスコに350,000のヒト脂肪組織間質細胞を播種することから始めます。培養液が80%coの流暢さに達したら、培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのDPBSで細胞をすすぎます。
次に、細胞が分離したときに、5ミリリットルのトリプシンとDPBSで37°Cで2分間細胞をインキュベートし、3ミリリットルの細胞培養培地で酵素反応を停止し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、6つの細胞アリコートのうち1.3倍10を15ミリリットルの円錐管に移し、細胞を再度スピンダウンします。
ペレットを1ミリリットルの新たに調製したバイオインクに懸濁し、均一に、細胞をアルギン酸水溶液全体に分布させるように注意します。次に、細胞を滅菌プリンター対応の3ミリリットルシリンジにロードし、滅菌済みの22ゲージプラスチックチップにねじ込みます。次に、バイオプリント、各ディスペンサーコンピューター、および再循環ウォーターバスの電源を入れます。
関連するディスペンサーコンピューター上の各ディスペンサーのオンメカニズムと印刷パラメーターの浴温度を摂氏4度に手動で設定します。ディスペンス量を230ナノリットルに、バックステップ数をゼロに、ディスペンサリーレートを毎秒10マイクロリットルに設定します。次に、設計ソフトウェアとプログラムを開き、コンピューターでUSBカメラディスプレイを表示します。
次に、液滴間のスペースが 2.4 mm の 5 x 5 ドット配列の座標を手動で入力します。プログラムを保存し、プログラムをロボットに送信します。次に、ペトリ皿を含むゼラチン二酸化チタンを摂氏4度のプリンターステージに置き、チャンバードアを閉めてロックします。
プログラマブルロジックコントローラーを使用して、紫外線光源を初期化し、チャンバーを滅菌しました。90秒後、チャンバーを開き、ヒト脂肪組織間質細胞懸濁液を含むシリンジを銃に装填し、チャンバーのドアをロックし、プログラマブルロジックコントローラーを使用してファンシステムをオンにします。内圧が平衡化するまで30秒待ってから、印刷プロセス全体を通じて幾何学的経路と印刷パラメータを含むプログラムを実行します。
コンピューターのUSBカメラディスプレイを見て、正確で均一な印刷を確認します。バイオプリントされたコンストラクトの生存率を定量化するには、新たに調製した染色液にそれらを浸します。次に、コンストラクトを暗闇の中で冷蔵庫に15分間置き、汚れが固まるようにします。
次に、共焦点顕微鏡画像を使用して、染色された構築物は、細胞が黄色または緑色に見える場合は、細胞が生きていると分類し、赤色の場合は細胞が死んでいると分類します。これらの結果が示すように、バイオプリンティングは、コンピュータ化されたソフトウェアを使用して、特定の3次元位置に細胞補助体とハイドロゲルを正確かつ一貫して沈殿させます。コンピュータソフトウェアは、各液滴の配置を決定し、分注のための多くのパラメータを制御します。
バイオプリンティング技術を成功させるための要件の1つは、細胞がここで生存し続けることです。先ほど示したように、アルギン系バイオインクで印刷した細胞を、印刷後1時間8日で分析し、0日目には98%の細胞が緑色で生存可能に見え、8日目には95%に上昇しました。赤色染色が示すように、どちらの時点でも死細胞はほとんど観察されず、バイオプリンティングのための代替インクの適合性が確認されました。
さらに、RGD共役アルギンインクは、印刷されたコンストラクトへの細胞の付着を強化し、0および8のハイドロゲルの3つの別々の領域で定量化された細胞の広がりおよび増殖を改善します。ここでは、ginnet bio インク上の RGD ペプチド結合の品質の比較を、8 日目に Ginnet bio インク単独の使用と比較しました。RGD標識ジンネット染色サンプルで観察された細胞拡散は、ジンネットへのペプチドの取り込みが成功したことを示しており、この現象は、その発生後に非標識バイオプリントサンプルには顕著に見られなかった。
この技術は、組織工学の分野の研究者が、生体工学的構造物を組み立てる手段として積層造形を探求する道を開きました。
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概要
この研究では、3Dバイオプリンターを使用して複雑な形状の生存可能な細胞含有構造物を生成するための手順を提示します。この方法は、ヒトの脂肪組織間質細胞を分離し、バイオインクと混合してから、バイオプリンターを通して押し出すことを含みます。
主要な研究構成要素
科学分野
- バイオプリンティング
- 細胞生物学
- 組織工学
背景
- 3Dバイオプリンティングにより、細胞の正確な配置が可能になります。
- 従来の方法では、足場の形成と細胞播種が含まれます。
- 細胞の直接配置により、組織形成が向上します。
- 共焦点顕微鏡が細胞の生存能の分析に使用されます。
研究目的
- 3Dバイオプリンターを使用して複雑な生存可能な構造物を作り出す。
- 組織工学における細胞配置の精度を向上させる。
- 印刷後のバイオプリント細胞の挙動を分析する。
使用された方法
- ヒト脂肪組織間質細胞の分離。
- 酸化RGD共役アルギン酸バイオインクの調製。
- バイオプリンティングによる細胞含有バイオマテリアルの押し出し。
- 共焦点顕微鏡を用いた細胞の生存能、増殖、移動の分析。
主要な結果
- 生存可能な細胞含有構造物の成功的な生成。
- 従来の方法と比較して、細胞配置の制御が向上。
- バイオプリント細胞の生存能と増殖が実証。
- 共焦点顕微鏡が細胞の移動パターンを確認。
結論
- この3Dバイオプリンターにより、正確で再現可能な細胞配置が可能。
- この方法は組織工学応用を潜在的に進歩させる可能性があります。
- 今後の研究では、このバイオプリンティング技術のさらなる応用を探ることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This bioprinting method enables precise spatial organization of cells within complex 3D geometries, addressing a key challenge in tissue engineering for regenerative medicine and disease modeling. By maintaining high cell viability and supporting proliferation, the approach provides a reproducible platform for evaluating therapeutic candidates in physiologically relevant constructs. This capability supports early-stage target validation and mechanistic de-risking by allowing direct placement of bioactive agents in defined microenvironments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through spatially controlled cell deposition in biomimetic architectures.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining cell viability (>95% at day eight) and proliferation in printed constructs.
- Predictive Value: Enhances confidence in target engagement by replicating native tissue-like organization for compound screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, viable cell-laden constructs with quantifiable outputs via confocal microscopy for viability, proliferation, and migration.
- Operational Value: Enables assay reproducibility through controllable printing parameters and computer-aided design manufacturing.
- Scalability: Facilitates platform reuse for downstream compound evaluation via precise droplet placement and environmental control.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from discovery to preclinical validation by maintaining cell function in RGD-conjugated alginate bio ink.
- Mechanistic De-risking: Improves predictive confidence through enhanced cell adhesion and spreading due to RGD peptide conjugation.
- Disease-Relevant System: Generates biomimetic tissue constructs that closely mimic native extracellular matrix organization.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification by providing reproducible, quantifiable biological readouts in engineered tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via precise placement of cells and hydrogels in defined 3D locations.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized construct production and quantitative confocal imaging of cell behavior.
- Analytics: Enables comparative analysis of conditions using viability, proliferation, and migration metrics from stained constructs.
- Translational Research: Connects to preclinical work by maintaining cell function in bio ink over eight days post-printing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for generating complex geometries across multiple projects via programmable dispensing and software control.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in cell-environment interactions.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via controlled dispensing parameters and sterile chamber environment.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by enabling early assessment of cellular responses in tissue-like contexts.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative viability and proliferation data supporting advancement criteria.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell isolation, bio ink preparation, and confocal microscopy for viability assessment.
- Dependent on bioprinter hardware, sterile syringe systems, and temperature-controlled printing stages.
- Necessitates cross-team standardization of CAD designs, dispensing rates, and environmental controls.
- Adaptation considerations include bio ink composition and cell type compatibility with alginate-based matrices.
- Practical limitations include nozzle clogging risks and the need for post-print staining protocols to quantify viability.
