三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率
2015年9月22日
A デカルトバイオプリンターは、正確で再現性のある形状でのマルチマテリアル堆積を可能にすると同時に、環境要因の制御を可能にするように設計および製造されました。3次元バイオプリンターを利用することで、複雑で実行可能な構築物を印刷し、簡単に再現することができます。
この手順の全体的な目標は、3D Bioprintを使用して、複雑な形状の生存細胞を含むコンストラクトを生成することです。これは、最初にヒト脂肪組織間質細胞を培養物から単離することによって達成されます。次に、細胞を新たに調製した酸化RGD標識アルギン酸バイオインクと混合します。
最終ステップでは、生体材料中の細胞LAがバイオプリンティングによって押し出されます。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して、バイオプリントされた細胞の生存率、増殖、および遊走を解析します。スキャフォールド形成や細胞播種などの既存の手順に対するこの手順の主な利点は、当社の手順では、組織を形成するために必要な場所に細胞と細胞凝集体を正確に配置できることです。
今日、手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるサラ・グレース・デニスです。細胞培養インキュベーターでの拡張のために、15ミリリットルの低グルコースTMEMで処理されたT 75フラスコに350,000のヒト脂肪組織間質細胞を播種することから始めます。培養液が80%coの流暢さに達したら、培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのDPBSで細胞をすすぎます。
次に、細胞が分離したときに、5ミリリットルのトリプシンとDPBSで37°Cで2分間細胞をインキュベートし、3ミリリットルの細胞培養培地で酵素反応を停止し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、6つの細胞アリコートのうち1.3倍10を15ミリリットルの円錐管に移し、細胞を再度スピンダウンします。
ペレットを1ミリリットルの新たに調製したバイオインクに懸濁し、均一に、細胞をアルギン酸水溶液全体に分布させるように注意します。次に、細胞を滅菌プリンター対応の3ミリリットルシリンジにロードし、滅菌済みの22ゲージプラスチックチップにねじ込みます。次に、バイオプリント、各ディスペンサーコンピューター、および再循環ウォーターバスの電源を入れます。
関連するディスペンサーコンピューター上の各ディスペンサーのオンメカニズムと印刷パラメーターの浴温度を摂氏4度に手動で設定します。ディスペンス量を230ナノリットルに、バックステップ数をゼロに、ディスペンサリーレートを毎秒10マイクロリットルに設定します。次に、設計ソフトウェアとプログラムを開き、コンピューターでUSBカメラディスプレイを表示します。
次に、液滴間のスペースが 2.4 mm の 5 x 5 ドット配列の座標を手動で入力します。プログラムを保存し、プログラムをロボットに送信します。次に、ペトリ皿を含むゼラチン二酸化チタンを摂氏4度のプリンターステージに置き、チャンバードアを閉めてロックします。
プログラマブルロジックコントローラーを使用して、紫外線光源を初期化し、チャンバーを滅菌しました。90秒後、チャンバーを開き、ヒト脂肪組織間質細胞懸濁液を含むシリンジを銃に装填し、チャンバーのドアをロックし、プログラマブルロジックコントローラーを使用してファンシステムをオンにします。内圧が平衡化するまで30秒待ってから、印刷プロセス全体を通じて幾何学的経路と印刷パラメータを含むプログラムを実行します。
コンピューターのUSBカメラディスプレイを見て、正確で均一な印刷を確認します。バイオプリントされたコンストラクトの生存率を定量化するには、新たに調製した染色液にそれらを浸します。次に、コンストラクトを暗闇の中で冷蔵庫に15分間置き、汚れが固まるようにします。
次に、共焦点顕微鏡画像を使用して、染色された構築物は、細胞が黄色または緑色に見える場合は、細胞が生きていると分類し、赤色の場合は細胞が死んでいると分類します。これらの結果が示すように、バイオプリンティングは、コンピュータ化されたソフトウェアを使用して、特定の3次元位置に細胞補助体とハイドロゲルを正確かつ一貫して沈殿させます。コンピュータソフトウェアは、各液滴の配置を決定し、分注のための多くのパラメータを制御します。
バイオプリンティング技術を成功させるための要件の1つは、細胞がここで生存し続けることです。先ほど示したように、アルギン系バイオインクで印刷した細胞を、印刷後1時間8日で分析し、0日目には98%の細胞が緑色で生存可能に見え、8日目には95%に上昇しました。赤色染色が示すように、どちらの時点でも死細胞はほとんど観察されず、バイオプリンティングのための代替インクの適合性が確認されました。
さらに、RGD共役アルギンインクは、印刷されたコンストラクトへの細胞の付着を強化し、0および8のハイドロゲルの3つの別々の領域で定量化された細胞の広がりおよび増殖を改善します。ここでは、ginnet bio インク上の RGD ペプチド結合の品質の比較を、8 日目に Ginnet bio インク単独の使用と比較しました。RGD標識ジンネット染色サンプルで観察された細胞拡散は、ジンネットへのペプチドの取り込みが成功したことを示しており、この現象は、その発生後に非標識バイオプリントサンプルには顕著に見られなかった。
この技術は、組織工学の分野の研究者が、生体工学的構造物を組み立てる手段として積層造形を探求する道を開きました。
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概要
本研究では、3Dバイオプリンターを用いて複雑な形状を持つ生存細胞含有構造体を作製する手順を提示します。この手法では、ヒト脂肪組織由来間葉系幹細胞を単離し、バイオインクと混合した後、バイオプリンターで押し出し成形を行います。
研究の主要構成要素
科学分野
- バイオプリンティング
- 細胞生物学
- 組織工学
背景
- 3Dバイオプリンティングにより、細胞を精密に配置することが可能です。
- 従来の方法では、スキャフォールド（足場）の形成と細胞播種が行われます。
- 細胞を直接配置することで、組織形成を促進できる可能性があります。
- 細胞生存率の解析には、共焦点顕微鏡が用いられます。
研究目的
- 3Dバイオプリンターを用いて、複雑で生存可能な構築物を製作すること。
- 組織工学における細胞配置の精度を向上させること。
- バイオプリント後の細胞の挙動を解析すること。
使用した手法
- ヒト脂肪組織由来ストローマ細胞の単離。
- 酸化RGD結合アルギン酸バイオインクの調製。
- バイオプリンティングによる細胞含有バイオマテリアルの押し出し。
- 共焦点顕微鏡を用いた細胞生存率、増殖および遊走の解析。
主要な結果
- 生存可能な細胞含有構造体の作製に成功した。
- 従来の手法と比較して、細胞配置の制御性が向上した。
- バイオプリントされた細胞の生存能および増殖能を実証した。
- 共焦点顕微鏡により、細胞の遊走パターンを確認した。
結論
- 3Dバイオプリンターにより、精密で再現性のある細胞配置が可能になります。
- この手法は、組織工学への応用を前進させる可能性があります。
- 今後の研究では、このバイオプリンティング技術のさらなる応用が検討されると考えられます。
よくある質問
産業界における重要性
このバイオプリンティング手法により、複雑な3D構造内における細胞の精密な空間的配置が可能となり、再生医療および疾患モデリングに向けた組織工学における重要な課題が解決されます。高い細胞生存率を維持し増殖をサポートすることで、本アプローチは生理学的に適切な構築物における治療候補物質の評価のための再現性のあるプラットフォームを提供します。この機能により、生物活性剤を定義された微小環境に直接配置することが可能となり、初期段階のターゲットバリデーションおよびメカニズムのデリスク化が促進されます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期発見およびターゲット検証
- 科学的価値：バイオミメティック構造内での空間的に制御された細胞配置により、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：プリントされた構築物における細胞生存率（8日目で95%超）と増殖を維持することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートする。
- 予測的価値：化合物スクリーニングにおいて生体組織に近い組織化を再現することで、ターゲットエンゲージメントへの信頼性を高める。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：共焦点顕微鏡を用いて生存率、増殖、および遊走を定量的に評価し、標準化された生存細胞含有構築物を作製する。
- 運用の価値：制御可能なプリンティングパラメータとコンピュータ支援設計（CAD）製造により、アッセイの再現性を可能にする。
- 拡張性：正確な液滴配置と環境制御により、後続の化合物評価のためのプラットフォームの再利用を促進する。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：RGD結合アルギン酸バイオインク内で細胞機能を維持することにより、発見から前臨床検証までの進展をサポートします。
- メカニズム的なリスク低減：RGDペプチドの結合による細胞接着と伸展の向上を通じて、予測の信頼性を高めます。
- 疾患関連システム：天然の細胞外マトリックス組織を密接に模倣したバイオミメティックな組織構築物を生成します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、エンジニアリングされた組織において再現可能かつ定量化可能な生物学的リードアウトを提供することにより、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至るまでの創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 発見生物学：定義された3D位置への細胞およびハイドロゲルの精密な配置により、仮説検証とパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：標準化された構築物の作製と細胞挙動の定量的共焦点イメージングにより、アッセイへの即応性を実現します。
- 分析：染色された構築物から得られる生存率、増殖能、および遊走性の指標を用いて、条件間の比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：プリント後8日間にわたりバイオインク内での細胞機能を維持することで、前臨床研究への展開を可能にします。
- 企業内での再利用：プログラム可能な分注とソフトウェア制御により、複数のプロジェクトにわたり複雑な形状を生成できる再利用可能な機能を確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：細胞と環境の相互作用におけるメカニズム的な曖昧さを低減することで、ターゲットバリデーションの予測信頼性を向上させます。
- 運用上の価値：分注パラメータの制御と滅菌チャンバー環境により、標準化と再現性を実現します。
- 戦略的価値：組織に近い環境での細胞応答の早期評価を可能にすることで、go/no-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：進展基準を裏付ける生存率および増殖の定量データを通じて、リスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 細胞分離、バイオインクの調製、および生存率評価のための共焦点顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- バイオプリンターのハードウェア、滅菌シリンジシステム、および温度制御機能付きプリンティングステージに依存します。
- CAD設計、吐出速度、および環境制御に関するチーム間での標準化が必要です。
- 適応上の検討事項として、バイオインクの組成およびアルギン酸ベースのマトリックスに対する細胞種の適合性が挙げられます。
- 実用上の制限として、ノズルの詰まりのリスクや、生存率を定量化するためのプリント後染色プロトコルの必要性があります。
