三ディスペンサーデカルトプリンタを使用してBioprinted細胞構築物の生存率

この手順の全体的な目標は、3D Bioprintを使用して、複雑な形状の生存細胞を含むコンストラクトを生成することです。これは、最初にヒト脂肪組織間質細胞を培養物から単離することによって達成されます。次に、細胞を新たに調製した酸化RGD標識アルギン酸バイオインクと混合します。

最終ステップでは、生体材料中の細胞LAがバイオプリンティングによって押し出されます。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して、バイオプリントされた細胞の生存率、増殖、および遊走を解析します。スキャフォールド形成や細胞播種などの既存の手順に対するこの手順の主な利点は、当社の手順では、組織を形成するために必要な場所に細胞と細胞凝集体を正確に配置できることです。

今日、手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるサラ・グレース・デニスです。細胞培養インキュベーターでの拡張のために、15ミリリットルの低グルコースTMEMで処理されたT 75フラスコに350,000のヒト脂肪組織間質細胞を播種することから始めます。培養液が80%coの流暢さに達したら、培地を取り出し、カルシウムとマグネシウムを含まない5ミリリットルのDPBSで細胞をすすぎます。

次に、細胞が分離したときに、5ミリリットルのトリプシンとDPBSで37°Cで2分間細胞をインキュベートし、3ミリリットルの細胞培養培地で酵素反応を停止し、細胞を50ミリリットルの円錐管に移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを2ミリリットルの細胞培養培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、6つの細胞アリコートのうち1.3倍10を15ミリリットルの円錐管に移し、細胞を再度スピンダウンします。

ペレットを1ミリリットルの新たに調製したバイオインクに懸濁し、均一に、細胞をアルギン酸水溶液全体に分布させるように注意します。次に、細胞を滅菌プリンター対応の3ミリリットルシリンジにロードし、滅菌済みの22ゲージプラスチックチップにねじ込みます。次に、バイオプリント、各ディスペンサーコンピューター、および再循環ウォーターバスの電源を入れます。

関連するディスペンサーコンピューター上の各ディスペンサーのオンメカニズムと印刷パラメーターの浴温度を摂氏4度に手動で設定します。ディスペンス量を230ナノリットルに、バックステップ数をゼロに、ディスペンサリーレートを毎秒10マイクロリットルに設定します。次に、設計ソフトウェアとプログラムを開き、コンピューターでUSBカメラディスプレイを表示します。

次に、液滴間のスペースが 2.4 mm の 5 x 5 ドット配列の座標を手動で入力します。プログラムを保存し、プログラムをロボットに送信します。次に、ペトリ皿を含むゼラチン二酸化チタンを摂氏4度のプリンターステージに置き、チャンバードアを閉めてロックします。

プログラマブルロジックコントローラーを使用して、紫外線光源を初期化し、チャンバーを滅菌しました。90秒後、チャンバーを開き、ヒト脂肪組織間質細胞懸濁液を含むシリンジを銃に装填し、チャンバーのドアをロックし、プログラマブルロジックコントローラーを使用してファンシステムをオンにします。内圧が平衡化するまで30秒待ってから、印刷プロセス全体を通じて幾何学的経路と印刷パラメータを含むプログラムを実行します。

コンピューターのUSBカメラディスプレイを見て、正確で均一な印刷を確認します。バイオプリントされたコンストラクトの生存率を定量化するには、新たに調製した染色液にそれらを浸します。次に、コンストラクトを暗闇の中で冷蔵庫に15分間置き、汚れが固まるようにします。

次に、共焦点顕微鏡画像を使用して、染色された構築物は、細胞が黄色または緑色に見える場合は、細胞が生きていると分類し、赤色の場合は細胞が死んでいると分類します。これらの結果が示すように、バイオプリンティングは、コンピュータ化されたソフトウェアを使用して、特定の3次元位置に細胞補助体とハイドロゲルを正確かつ一貫して沈殿させます。コンピュータソフトウェアは、各液滴の配置を決定し、分注のための多くのパラメータを制御します。

バイオプリンティング技術を成功させるための要件の1つは、細胞がここで生存し続けることです。先ほど示したように、アルギン系バイオインクで印刷した細胞を、印刷後1時間8日で分析し、0日目には98%の細胞が緑色で生存可能に見え、8日目には95%に上昇しました。赤色染色が示すように、どちらの時点でも死細胞はほとんど観察されず、バイオプリンティングのための代替インクの適合性が確認されました。

さらに、RGD共役アルギンインクは、印刷されたコンストラクトへの細胞の付着を強化し、0および8のハイドロゲルの3つの別々の領域で定量化された細胞の広がりおよび増殖を改善します。ここでは、ginnet bio インク上の RGD ペプチド結合の品質の比較を、8 日目に Ginnet bio インク単独の使用と比較しました。RGD標識ジンネット染色サンプルで観察された細胞拡散は、ジンネットへのペプチドの取り込みが成功したことを示しており、この現象は、その発生後に非標識バイオプリントサンプルには顕著に見られなかった。

この技術は、組織工学の分野の研究者が、生体工学的構造物を組み立てる手段として積層造形を探求する道を開きました。