マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

このマイクロ流体バイオプリンティング手法の全体的な目的は、血管化された組織構築物を生成することです。本手法は、血管化組織のバイオファブリケーションにおける重要な課題を解決することができます。本技術の主な利点は、二次的な細胞播種プロセスを通じて血管化組織を構築するための、三次元形状が制御された血管管を生成できる汎用性にあります。

本プロトコルは血管化心臓組織の構築に関する知見を提供するものですが、肝臓や皮膚、さらには癌などの多くの他の組織タイプにも適用可能です。この手法に不慣れな方は、バイオプリンターのセットアップが容易ではないため、苦労する可能性があります。この手順を開始するには、コアとなる小さな鈍針を、シースとなる大きな鈍針の中心に挿入し、二層同心円状マイクロ流体プリントヘッドを構築してください。

コアニードルが外殻から約1 mm突出していることを確認します。その後、中心ニードルのバレルに23ゲージのニードルを逆方向に挿入します。外側ニードルのバレルの側面に穴を開け、適合するサイズの金属コネクタを挿入します。

エポキシ接着剤で密封します。ポリメタクリル酸メチル（PMMA）ホルダーを用いて、エクストルーダーをバイオプリンターのヘッドに取り付けます。次に、バイオインクと架橋溶液を2本のPVCチューブから個別に注入するため、プリントヘッドの入口をデュアルチャンネルシリンジポンプに接続します。

アルギン酸、GelMA、および光開始剤の混合物を用いてバイオインクを作製します。これらを、10%胎児牛血清（FBS）を含む25 millimolar HEPES緩衝液に溶解させます。次に、架橋キャリア液として使用するため、10%FBSを含むHEPES緩衝液に0.3 molar 塩化カルシウムを溶解させた溶液を作製します。

バイオプリンティングの直前に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）を5～10分間トリプシン処理します。15 mLチューブを用い、800 RPMで5分間遠心分離します。5～10回ゆっくりとピペッティングし、細胞濃度が5～10 × 10⁶ cells/mLになるようにバイオインクで再懸濁します。

次に、2チャンネルシリンジポンプを用いて、一方のチャンネルからHUVEC含有バイオインクを、もう一方のチャンネルから架橋液を、それぞれ5 µL/minの流量で注入し始めます。流れが安定するまで、最大1分間連続して流し続けます。その後、バイオプリンターの積層速度を約4 mm/sに維持しながら、プリントヘッドを移動させます。

このバイオプリントにより、アルギン酸成分の迅速なイオンゲル化が起こり、マイクロファイバー足場が堆積します。足場のプリント完了後、化学的ゲル化を完了させるため、5〜10 mW/cm²のUV光を20〜30秒間照射し、gelMA成分を光架橋させます。その後、37 °Cに加温したPBSで静かに洗浄し、足場から過剰な塩化カルシウムを除去してください。

このスキャホールドを血管内皮細胞増殖培地中で、37°C、5% CO2条件下で最大16日間培養します。培地交換は少なくとも2日ごとに行います。培養期間中、HUVECを顕微鏡で観察し、細胞がスキャホールド微細繊維の周辺部に遊走し、管腔様構造を形成するまでモニターします。

次に、滅菌フィルターペーパーを用いて、毛細管現象によりスキャフォールドの間隙空間から培地を慎重にすべて除去します。直ちに、心筋細胞などの二次細胞種の懸濁液をスキャフォールドの上に1滴加え、細胞を間隙空間全体に浸透させます。その後、このスキャフォールドをインキュベーターで30分から2時間インキュベートし、細胞を個々のマイクロファイバーに接着させます。

PBSでスキャフォールドを穏やかに洗浄し、非接着細胞を除去します。目的とする血管化組織が形成されるまで、このスキャフォールドを適切な培地で培養します。ここで説明するマイクロ流体バイオプリンティングにより、低粘度バイオインクを用いたマイクロファイバー状スキャフォールドのダイレクトバイオプリンティングが可能になります。

30本以上のマイクロファイバーを含む6×6×6 mm²サイズのスキャフォールドを、10分以内にバイオプリントすることができました。スキャフォールドの顕微鏡写真の上面図および側面図は、バイオプリント工程における優れた構造的完全性を示しています。これは、アルギン酸成分と塩化カルシウムによる即時的なイオン架橋によって達成されました。

バイオインクのマイクロ流体押出成形、イオン架橋、および光架橋の後、HUVECは比較的高い生存率を維持しました。細胞は増殖し、0日目の初期のランダムな分布から、16日目にはマイクロファイバーの周辺部へと移動しました。スキャホールド上に播種された新生ラット心筋細胞は成熟し、スキャホールド内に定着しました。

これらの細胞は、サルコメアα-アクチニンやコネクシン43などの機能的な心機能バイオマーカーの強い発現を示しました。心筋細胞を播種したバイオプリント微細繊維スキャフォールドの共焦点顕微鏡観察により、HUVECと心筋細胞の両方が共存していることが明らかになりました。

HUVECは主にマイクロファイバーの境界に存在し、一方で心筋細胞はマイクロファイバーの外周を取り囲んでいます。細胞は、細胞源やスキャフォールドの構成に応じて、最大9日から28日まで、自発的かつ同期した拍動を維持することができました。

このビデオを視聴することで、マイクロ流体バイオプリンティング技術を用いた血管化組織の作製方法に加えて、プリントヘッドの作製およびバイオプリンターの操作方法について十分に理解することができます。プリントヘッドの作製やバイオプリンターの操作は、経験のない方にとって困難な場合があるため、本手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を行う際は、プリントヘッド内で2本の針を同心円状に配置し、バイオプリンティングを開始する前に流れを安定させることが重要である点に留意してください。

この技術の開発により、組織工学およびバイオファブリケーション分野の研究者は、in vivoでの再生目的またはin vitroでの組織モデリングのための、血管化された組織構築物を生成するための新たな有効なツールを得ることになります。