Name: マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぼう、マイクロ流体工学バイオプリンティングによる血管化組織構築法。二重同心円型プリントヘッドを用いて、HUVECと二次細胞を封入した三次元血管ネットワークを形成し、心臓、肝臓、皮膚など多様な組織工学への応用を実現します。

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著者は、独立賞 (K99CA201603) への国民の健康道機関国立がん研究所をご了承ください。

このプロトコルで使われる新生児ラット心筋細胞は次の機関動物ケアおよび Brigham および女性の病院の使用委員会によって承認された確立された手順56 2 日古い Sprague-dawley ラットから分離された.
1、Bioprinter の計測
<ol>
	<li>デュアルレイヤー、同心円状のマイクロ ヘッド; を構築するシースとして (例えば、18 G、1/2 インチ) 大きい鈍針の中心にコアとして (例えば、27 G、1 インチ) より小さい鈍針を挿入します。コア針が少し出ていることを確認してください (~ 1 mm) 外側シェル (図 1A) よりも長い。通常、先端で同心円配置を支援するためにバレルの側面内側/外側の針の間に適切なサイズのスペーサーを必要ことができます一時的挟ま場合が手動で、配置が調整されます。エポキシ接着剤でバレルの接合部をシールし、該当する場合の先端側からアライメント スペーサーを削除します。</li>
	<li>逆方向の中央の針のバレルに別の針 (23 G) を挿入します。 外側の針のバレルの側面にある穴を生成し、穴に、エポキシ接着剤でシールの順にサイズの一致の金属製のコネクタを挿入します。</li>
	<li>2 つの塩ビ管を bioink 及び架橋液の注入のデュアル チャネル シリンジ ポンプに印字ヘッドの入り江を個別に接続します。Poly(methyl methacrylate) は、プラスチック製のホルダーを使用して bioprinter の頭の上に押出機をマウントします。 注: Bioprinter 選択は、可用性に依存します。ここで私達は正常にいくつかの市販の bioprinters にこのセットアップをテストしました。ただし、x ・ y ・ z 電動ステージを備えて bioprinter 必要があります、原則として、有効にこのマイクロ プリント ヘッドの統合。</li>
</ol>
2. バイオプリンティングを用いた血管床
<ol>
	<li>アルギン酸 (4 w/v%、低粘度)、ゼラチン (ゲルマ、1-2 w/v%) メタクリロイル57,58,:dic Irgacure 2959 の混合物を使用して bioink を作る (0.2 - 0.5 wt.%) 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-イルに溶解] エタン スルホン酸 (HEPES 緩衝液 pH 7.4) 含む 10 vol.% ウシ胎児血清 (FBS)。</li>
	<li>10 vol.% 架橋キャリア流体として FBS を含む HEPES バッファーで 0.3 M CaCl2溶液を作ります。</li>
	<li>バイオプリンティングの直前に 5-10 分の治療を 0.05 w/v% トリプシンによるフラスコからひと臍帯静脈血管内皮細胞 (Huvec) を切り離して、5-10 × 106セル/mL の濃度で bioink で細胞を再懸濁します。均一な分布を確実にゆっくりと 5 から 10 倍の懸濁液をピペットします。</li>
	<li>5 μ L/mL の同じ流量でデュアル チャネルのシリンジ ポンプを使用して bioink/架橋液の注入を開始します。フローは、彼らが安定するまで最大 1 分間継続的に実行する許可されます。その後、約 4 mm/s (図 1B) の堆積速度で bioprinter を制御することで印字ヘッドの移動を開始します。これらの速度は微調整が必要な場合があります最適バイオプリンティングを確保するため各新しいセットアップとチューニングします。バイオプリンティング プロセスは通常室温 (21-25 ° C) で行なわれるが、この温度を変更可能性があります。アルギン酸コンポーネントの高速イオン性ゲル化とを用いた足場 (図 1B) の沈着バイオプリンティング処理できるようにします。</li>
	<li>足場は、bioprinted が、した後は 20-30 s (図 1C) さらに光架橋約 5-10 mW/cm2の紫外線 (360-480 nm) で、ゲルマ成分による化学ゲル化を達成するため。</li>
	<li>バイオプリンティング架橋続いて、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 過剰 CaCl2を削除すると足場を軽くすすいでください。培養内皮細胞成長培地 (EGM) まで 16 日間の 37 ° C および 5 vol.% CO2でインキュベーターで媒体で Huvec 満載を用いた足場少なくとも 2 日ごとに変更。培養期間中に顕微鏡下で比較の形態を監視します。</li>
</ol>
3. 血管柄付き組織を構築します。
<ol>
	<li>比較は、ルーメンのような構造 (図 1D) を形成する足場に超極細の周辺に移行して、一度足場を取得し、優しく (例えばpolymethylsiloxane [PDMS] のスラブ) 疎水性表面上に配置します。フィルター滅菌の紙切れを使用して、毛管力と足場の間質性スペースからすべてのメディアを慎重に取り外します。</li>
	<li>すぐに培地での足場は、足場 (図 1E) の間質性スペース全体に潜入する必要があります上に 1-10 × 106セル/ml の密度で二次電池の種類 (例えば、心筋細胞) の懸濁液の滴 (約 20-40 μ L) を追加します。0.5 - 個々 の超極細に付着する細胞を許可するように 2 h のためのインキュベーター (37 ° C, 5 vol.% CO2、相対湿度 95%) でこのような構成を孵化させなさい。顕著な蒸発が観測されないように期間液滴サイズを監視します。</li>
	<li>目的の血管柄付きの組織が形成されるまで関連媒体の非付着性のセルおよび文化構成を削除する PBS 風呂で揺することによって足場は水洗い。</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

コーアクシャルのプリント ヘッドの構造は、コアと鞘から架橋剤からの両方の bioink の同時配信を可能にするのに成功したマイクロ バイオプリンティングに向けての重要なステップを表します。このプロトコルでは例のプリント ヘッドはシェルとコアと 18 G 針 27 G 針を使用して作成された中、は、さまざまな針のサイズが異なるを使用して組み合わせを容易に拡張可能性があります。ただし、フロー量の変化での結果は、各段階で配信、針のサイズの変化、bioink と (個別に調整可能なデュアル チャネルの 1 つではなく 2 つのシリンジ ポンプを使用して)、架橋剤との両方の可能性がありますも、bioprinter によって生じた堆積速度流量のさらなる最適化が必要になります。
現在のプロトコルのパラメーター (蒸着速度、流量、針のサイズ) の組み合わせは、中55平衡後約 150 μ m に膨らむだろう堆積直後約 120 μ m の直径を持つ bioprinted 超極細につながった。超極細の層の間のスペースがなかったのでこのようなサイズはまた約 ...

組織エンジニア リング目標生成機能組織代用置換、復元、またはそれらの怪我や病気、人体1,2,3,4、生体材料7,8,9,10生理活性分子5,6、目的のセルの種類の組み合わせを頻繁に拡張するために使用できます。最近では、モデルを生成する体外組織と器官用医薬品の開発、従来の単純化しすぎられる平面内細胞文化11,12,13,14,15,16,17,18,19の交換など、生体内で同等の重要な機能を模倣した組織工学技術がますます採用されても。両方の状況で複雑なマイクロアーキテクチャーと人間の組織の階層構造を要約する能力が重要なエンジニア リング組織10の機能を有効にして特に、エンジニア リング組織に血管のネットワークを統合する方法は、需要が血管新生でフィールド20,21,22,23の最大の課題の 1 つは、ため。
日には、様々 なアプローチはさまざまな程度の成功8のエンジニア リングの組織構造に血管の構造を構築する試みにこの点で開発しました。たとえば、自己血管内皮細胞のことができます血管ネットワーク24; の世代のため血管増殖因子の配信2625、持続的な血管新生を誘導します。血管系前駆細胞を使用し、ペリサイト容易に血管内皮細胞の増殖およびアセンブリ24,27;足場・ プロパティの設計により、新生28,29; の正確な変調また、細胞シート テクノロジーにより、血管層30の便利な操作のため。それにもかかわらず、これらの戦略は、設計された組織構造およびこうして限られた再現性内で血管がランダムに分布につながる血管の空間パターン形成を制御する能力を授けるないです。過去数年間バイオプリンティングは、自動または半自動の方法31,32,33高再現性と再現性で複雑な組織パターンの彼らの比類のない汎用性のため、このような課題の解決に向けた技術を有効にするクラスとして浮上しています。いけにえバイオプリンティング34,35,36,37,38、埋め込みバイオプリンティング39,40,41, と中空構造バイオプリンティング/立体組織自動製造42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53が血管や血管柄付き組織を生成する可能性が説明されています。
またを用いた足場を作製するマイクロ流体バイオプリンティング戦略が最近開発されている、ハイブリッド bioink から成るアルギン酸、ゼラチン メタクリロイル基 (ゲルマ) 同心印字ヘッドと塩化カルシウム (CaCl2) ソリューションのコアを介して配信されたプリント ヘッド54,55の外側シースの流れを行った。後続の光架橋多層膜を用いた足場の永続的な安定を確保しながらマイクロファイバー形成を有効にするアルギン酸コンポーネントの即時の物理的な架橋の許可 2 つのフローの共押出。注記のうち、bioprinted 超極細内にカプセル化血管内皮細胞が増殖し、血管床54,55を真似たルーメンのような構造を仮定してマイクロファイバーの方に移住する見つかりました。これらの bioprinted endothelialized 血管ベッドその後を表示でしたさらに55血管柄付き組織を構築する二次電池タイプを希望します。このプロトコルは、したがって組織エンジニア リングと organoid モデリングへの応用可能性の血管組織の便利な加工を保証する同心円状ノズルの設計で有効にするようなマイクロ流体バイオプリンティングの戦略の詳細な手順を提供します。

<table><tbody><tr><td>褐藻類由来のアルギン酸ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0682</td><td>BioReagent、植物細胞培養試験済み、低粘度、ブ</td></tr><tr><td>タ皮由来粉末ゼラチンA</td>型 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G2500</td><td>ゲル強度 300</td></tr><tr><td>Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td>98%</td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>1 M、pH 7.0 - 7.6、滅菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適した</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10438026</td><td>認定、熱不活化、USDA承認地域</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>BioXtra、&ge;99.0%</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10010023</td><td>pH 7.4</td></tr><tr><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001</td><td>ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVECs)</td></tr><tr><td>GFP発現ヒト臍帯静脈内皮細胞</td><td>Angio-Proteomie</td><td>cAP-0001GFP</td><td>GFP発現ヒト臍帯静脈内皮細胞(GFPHUVECs)</td></tr><tr><td>内皮細胞増殖培地</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>EGM-2 BulletKit</td></tr><tr><td>Dulbecco's モディファイド イーグル ミディアム&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12430054</td><td>高グルコース、HEPES</td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーンエラストマーキット</td><td>エルスワース 接着剤</td><td>184 SIL エラストキット 0.5KG</td><td>クリア 0.5 kg キット</td></tr><tr><td>UV 硬化ランプシステム</td><td>エクセリタステクノロジー</td>ズ <td>オムニキュア S2000</td><td>スポット UV 光硬化システム インテリジェント UV センサー付き</td></tr></tbody></table>

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や organoids

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

血管の組織工学を構築し、organoids は歴史的に挑戦されています。ここで多層ヒドロゲル超極細をインター レースで足場を生成するマイクロ流体バイオプリンティングに基づく手法について述べる.滑らかな達成するためにバイオプリンティング、コアの流れとシース流によって運ばれる架橋ソリューションから押出複合 bioink 製剤を含む芯鞘マイクロ プリント ヘッドはように設計され、bioprinter の上に装着。アルギン酸ゼラチン メタクリロイル (ゲルマ) をブレンドすることにより多糖の存在下で瞬時のイオン架橋を受ける選択恒久的な安定化を達成するためにゲルマ成分の二次光架橋続いて二価のイオン、このバイオプリンティング方式を用いた足場を得ることができた。重要なは、血管内皮細胞の bioprinted 超極細内部にカプセルは 16 日文化にわたって血管系に似たルーメンのような構造を形成できます。Endothelialized を用いた足場はさらに、超極細の間質性スペースに二次電池型の後播種によって血管柄付き組織を構築する血管床として使用することがあります。マイクロ流体バイオプリンティング高忠実度で血管組織の便利な工学の一般的な戦略を提供します。

マイクロ流体バイオプリンティング戦略を用いた足場低粘度 bioinks54,55を使用しての直接押出バイオプリンティングことができます。6 × 6 × 6 mm のサイズを図 2A足場に示すように3を含む &#62; 超極細 30 層が 10 分以内の bioprinted をあることができます。CaCl2アルギン酸コンポーネントの即時イオン架橋は上から見ると図 2 b および 2 Cの図に示すように bioprinted を用いた足場の長期安定性を確保するゲルマ コンポーネントのそれ以降の物理光架橋中バイオプリンティング プロセス中に優秀な構造完全性の許可。この場合、プロトコルでは、指定されたバイオプリンティング条件下で達成超極細だっただろうと若干増加超過腫れの直径の約 100-150...

我々 は、二次電池の種類がさらに血管柄付き組織とオルガノイドを生成するには、このを用いた構造の間質性スペースに播種できるを用いた血管床をエンジニア リングのためのマイクロ流体バイオプリンティング戦略に基づく一般化されたプロトコルを提供します。

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

このマイクロ流体バイオプリンティング手法の全体的な目的は、血管化された組織構築物を生成することです。本手法は、血管化組織のバイオファブリケーションにおける重要な課題を解決することができます。本技術の主な利点は、二次的な細胞播種プロセスを通じて血管化組織を構築するための、三次元形状が制御された血管管を生成できる汎用性にあります。本プロトコルは血管化心臓組織の構築に関する知見を提供するものですが、肝臓や皮膚、さらには癌などの多くの他の組織タイプにも適用可能です。この手法に不慣れな方は、バイオプリンターのセットアップが容易ではないため、苦労する可能性があります。この手順を開始するには、コアとなる小さな鈍針を、シースとなる大きな鈍針の中心に挿入し、二層同心円状マイクロ流体プリントヘッドを構築してください。コアニードルが外殻から約1 mm突出していることを確認します。その後、中心ニードルのバレルに23ゲージのニードルを逆方向に挿入します。外側ニードルのバレルの側面に穴を開け、適合するサイズの金属コネクタを挿入します。エポキシ接着剤で密封します。ポリメタクリル酸メチル（PMMA）ホルダーを用いて、エクストルーダーをバイオプリンターのヘッドに取り付けます。次に、バイオインクと架橋溶液を2本のPVCチューブから個別に注入するため、プリントヘッドの入口をデュアルチャンネルシリンジポンプに接続します。アルギン酸、GelMA、および光開始剤の混合物を用いてバイオインクを作製します。これらを、10%胎児牛血清（FBS）を含む25 millimolar HEPES緩衝液に溶解させます。次に、架橋キャリア液として使用するため、10%FBSを含むHEPES緩衝液に0.3 molar 塩化カルシウムを溶解させた溶液を作製します。バイオプリンティングの直前に、ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECs）を5～10分間トリプシン処理します。15 mLチューブを用い、800 RPMで5分間遠心分離します。5～10回ゆっくりとピペッティングし、細胞濃度が5～10 × 10⁶ cells/mLになるようにバイオインクで再懸濁します。次に、2チャンネルシリンジポンプを用いて、一方のチャンネルからHUVEC含有バイオインクを、もう一方のチャンネルから架橋液を、それぞれ5 µL/minの流量で注入し始めます。流れが安定するまで、最大1分間連続して流し続けます。その後、バイオプリンターの積層速度を約4 mm/sに維持しながら、プリントヘッドを移動させます。このバイオプリントにより、アルギン酸成分の迅速なイオンゲル化が起こり、マイクロファイバー足場が堆積します。足場のプリント完了後、化学的ゲル化を完了させるため、5〜10 mW/cm²のUV光を20〜30秒間照射し、gelMA成分を光架橋させます。その後、37 °Cに加温したPBSで静かに洗浄し、足場から過剰な塩化カルシウムを除去してください。このスキャホールドを血管内皮細胞増殖培地中で、37°C、5% CO2条件下で最大16日間培養します。培地交換は少なくとも2日ごとに行います。培養期間中、HUVECを顕微鏡で観察し、細胞がスキャホールド微細繊維の周辺部に遊走し、管腔様構造を形成するまでモニターします。次に、滅菌フィルターペーパーを用いて、毛細管現象によりスキャフォールドの間隙空間から培地を慎重にすべて除去します。直ちに、心筋細胞などの二次細胞種の懸濁液をスキャフォールドの上に1滴加え、細胞を間隙空間全体に浸透させます。その後、このスキャフォールドをインキュベーターで30分から2時間インキュベートし、細胞を個々のマイクロファイバーに接着させます。PBSでスキャフォールドを穏やかに洗浄し、非接着細胞を除去します。目的とする血管化組織が形成されるまで、このスキャフォールドを適切な培地で培養します。ここで説明するマイクロ流体バイオプリンティングにより、低粘度バイオインクを用いたマイクロファイバー状スキャフォールドのダイレクトバイオプリンティングが可能になります。30本以上のマイクロファイバーを含む6×6×6 mm²サイズのスキャフォールドを、10分以内にバイオプリントすることができました。スキャフォールドの顕微鏡写真の上面図および側面図は、バイオプリント工程における優れた構造的完全性を示しています。これは、アルギン酸成分と塩化カルシウムによる即時的なイオン架橋によって達成されました。バイオインクのマイクロ流体押出成形、イオン架橋、および光架橋の後、HUVECは比較的高い生存率を維持しました。細胞は増殖し、0日目の初期のランダムな分布から、16日目にはマイクロファイバーの周辺部へと移動しました。スキャホールド上に播種された新生ラット心筋細胞は成熟し、スキャホールド内に定着しました。これらの細胞は、サルコメアα-アクチニンやコネクシン43などの機能的な心機能バイオマーカーの強い発現を示しました。心筋細胞を播種したバイオプリント微細繊維スキャフォールドの共焦点顕微鏡観察により、HUVECと心筋細胞の両方が共存していることが明らかになりました。HUVECは主にマイクロファイバーの境界に存在し、一方で心筋細胞はマイクロファイバーの外周を取り囲んでいます。細胞は、細胞源やスキャフォールドの構成に応じて、最大9日から28日まで、自発的かつ同期した拍動を維持することができました。このビデオを視聴することで、マイクロ流体バイオプリンティング技術を用いた血管化組織の作製方法に加えて、プリントヘッドの作製およびバイオプリンターの操作方法について十分に理解することができます。プリントヘッドの作製やバイオプリンターの操作は、経験のない方にとって困難な場合があるため、本手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この手順を行う際は、プリントヘッド内で2本の針を同心円状に配置し、バイオプリンティングを開始する前に流れを安定させることが重要である点に留意してください。この技術の開発により、組織工学およびバイオファブリケーション分野の研究者は、in vivoでの再生目的またはin vitroでの組織モデリングのための、血管化された組織構築物を生成するための新たな有効なツールを得ることになります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

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