マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

このマイクロ流体バイオプリンティング手法の全体的な目標は、血管新生組織コンストラクトを生成することです。この方法は、血管新生組織のバイオファブリケーションにおける重要な問題を解決することができます。この技術の主な利点は、二次細胞播種プロセスを通じて血管新生組織をエンジニアリングするための3次元形状制御血管バットを生成するのに汎用性があることです。

このプロトコルは、血管新生した心臓組織のエンジニアリングに関する洞察を提供しますが、肝臓、皮膚、さらには癌など、他の多くの組織タイプにも適用できます。この方法に不慣れな一般の人は、バイオプリンターのセットアップが簡単ではない可能性があるため、苦労するかもしれません。この手順を開始するには、コアとして機能する小さな鈍い針を、シースとして機能する大きな鈍い針の中心に挿入して、2層の同心円マイクロ流体プリントヘッドを構築します。

芯針が外殻から約1mm突き出ていることを確認してください。その後、中央の針のバレルに23ゲージの針を逆方向に挿入します。外側の針のバレルの側面に穴を開け、一致するサイズの金属コネクタを挿入します。

エポキシ接着剤でシールします。ポリメチルメタクリレートまたはPMMAホルダーを使用して、押出機をバイオプリンターのヘッドに取り付けます。次に、バイオインクと架橋溶液を2本のPVCチューブに個別に注入するために、プリントヘッドの入口をデュアルチャネルシリンジポンプに接続します。

アルギン酸、ゲルMA、光開始剤の混合物を使用してバイオインクを作製します。10%ウシ胎児血清またはFBSを含む25ミリモルHEPESバッファーに溶解。次に、架橋担体液として機能するために、10%FBSを含むHEPES緩衝液に0.3モルの塩化カルシウムの溶液を作ります。

バイオプリンティングの直前に、ヒト臍帯静脈内皮細胞またはHUVECを5〜10分間トリプシン化します。細胞を800 RPMで15ミリリットルのチューブ内で5分間遠心分離します。バイオインク中の細胞を1ミリリットルあたり10個から6個の細胞の5〜10倍の濃度で、5〜10回ゆっくりとピペッティングして再懸濁します。

次に、デュアルチャネルシリンジポンプを使用して、一方のチャネルからHUVECのlaidenバイオインクの注入を開始し、もう一方のチャネルを介して架橋流体を毎分5マイクロリットルの流量で開始します。フローが安定するまで、最大1分間連続して流れます。その後、バイオプリンターの堆積速度を毎秒約4ミリメートルに維持して、プリントヘッドの動きを開始します。

このバイオプリンティングにより、アルギン酸成分の迅速なイオンゲル化とマイクロファイバーの足場の堆積がもたらされるはずです。足場が印刷された後、gelMAコンポーネントを5〜10ミリワット/平方センチメートルのUV光で20〜30秒間フォトクロスリンクして、化学ゲル化を実現します。次に、摂氏37度の温かいPBSで足場をやさしくすすいで、足場から余分な塩化カルシウムを取り除きます。

この足場を内皮細胞増殖培地で摂氏37度、5容量パーセントのCO2で最大16日間培養します。少なくとも2日ごとに媒体を交換してください。培養期間中は、HUVECが足場のマイクロファイバーの周辺に移動し、ルーメンのような構造を形成するまで、HUVECを顕微鏡で監視します。

次に、滅菌濾紙を使用して、毛細管現象で足場の組織内空間から培地全体を慎重に取り出します。足場の上に心筋細胞などの二次細胞タイプの懸濁液を即座に滴下し、細胞が組織内空間全体に浸潤できるようにします。その後、この足場をインキュベーターで30分から2時間インキュベートし、細胞が個々のマイクロファイバーに付着するのを待ちます。

足場をPBSで優しく洗浄することにより、非接着性細胞を除去します。この足場を適切な培地で、所望の血管新生組織が形成されるまで培養する。ここで説明するマイクロ流体バイオプリンティングは、低粘度のバイオインクを使用して、マイクロファイバー性足場の直接バイオプリンティングを可能にします。

6×6×6平方ミリメートルのサイズで<30本以上のマイクロファイバーを含む足場は、10分以内にバイオプリントできます。足場顕微鏡写真の上面図と側面図は、バイオプリンティングプロセス中の優れた構造的完全性を示しています。アルギン酸成分と塩化カルシウムとの即時イオン性架橋により達成されます。

バイオインクのマイクロ流体押出し、イオン架橋、および光架橋の後、HUVECは比較的高い生存率を維持しました。細胞は増殖し、0日目に最初にランダムに分布した状態から、16日目にマイクロファイバーの周辺部に移動しました。足場に播種された新生児ラット心筋細胞は成熟し、足場に生息しました。

彼らは、機能的な心臓バイオマーカーの強い発現を示しました。サルコメアアルファアクチニン、コネキシン43など。心筋細胞を装着したバイオプリントされた微小線維性足場の共焦点顕微鏡検査により、HUVECと心筋細胞の両方の共存が明らかになりました。

HUVECは主にマイクロファイバーの境界に存在し、心筋細胞はマイクロファイバーの外側を取り囲んでいます。細胞は、最大9〜28日間、自発的で同期した拍動を維持することができました。セルのソースとスキャフォールドの構成によって異なります。

このビデオを見れば、マイクロ流体バイオプリンティング技術を使用して血管新生組織を作製する方法、プリントヘッドの製造、バイオプリンターの操作方法について十分に理解できるはずです。プリントヘッドの製造とバイオプリンターの操作は、これまでバイオプリンターを使用したことのない人にとっては難しい場合があるため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることは非常に重要です。この手順を試行する際は、バイオプリンティングを開始する前に、プリントヘッド内で2本の針を同心にし、流れを安定させることを忘れないでください。

この技術の開発により、組織工学およびバイオファブリケーションの分野の研究者は、in vivoでの再生目的またはin vitroでの組織モデリングのための血管新生組織構築物を生成するための別の有効なツールを手に入れました。