Name: 自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぼう、iPSCから抗原特異的制御性T細胞を作製する方法。自己免疫性関節炎の免疫療法に向けた均一なTreg細胞の生成技術を解説し、細胞治療研究への応用可能性を示します。

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このプロジェクトは、健康（R01AI121180、R21AI109239とK18CA151798）、米国糖尿病協会の国立研究所からの助成金の下で、一部には、資金を供給された（1月16日 - IBS-281）、および健康のペンシルベニア州省（たばこ和解基金）へJS

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<li>van Loenen, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+T+cell+receptor+dimers+harbor+potentially+harmful+neoreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mixed T cell receptor dimers harbor potentially harmful neoreactivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 10972-10977 (2010).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+antigen-specific+human+regulatory+T+cells%3A+immunosuppression+of+FVIII-specific+T-+and+B-cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Engineered antigen-specific human regulatory T cells: immunosuppression of FVIII-specific T- and B-cell responses.</a> Blood. 125, 1107-1115 (2015).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルでは、重要なステップは、TCR / FoxP3の遺伝子形質iPS細胞のインビトロ分化である。 インビトロで Notchシグナル伝達は、T細胞系統に向けて開発を誘導します。 CD4 + FoxP3の+ TregのにiPS細胞を区別するために、我々は非常にMHC II（IA b）の分子を発現するOP9-DL1 / DL4 / IA B細胞を、使用していました。 iPS細胞の大部分は、CD4 +細胞に分化します。しかし、表面TCR発現の後、多くの分化プレT細胞が分化し、最終的には死ぬ能力を失います。その結果、IPSC由来の機能的Tregの細胞数は劇的インビトロ分化の4週間後に減少します。これを回避するために、IL-2の添加は、これらの時点での細胞生存率を向上させることができます。 Ag特異的プレTregの成熟および生存を駆動する別の方法は、マウスに一週間のために、in vitroで分化した前のTregを転送することです。これらの予備Tregは共存する...

自己免疫性関節炎は、滑膜組織の過形成と関節軟骨、骨、靭帯の進行性の破壊を特徴とする全身性疾患です。自己免疫性関節炎における制御性T細胞の生成または機能の低下は、制御性T細胞が自己反応性免疫細胞の発生を防ぐ上で重要な役割を果たすため、慢性炎症および組織損傷の一因となります。
制御性Tregの操作は、Ag依存的な方法で炎症を抑制する治療法の開発のための理想的な戦略です。Tregベースの免疫療法では、転写されたTregの特異性が進行中の自己免疫の治療に重要です2。抑制活性を示すためには、制御性T細胞は移動し、患部に留置される必要があり、これは、その位置におけるAgに対するTCRの特異性によって指示され得る3。ポリクローナルTregには、TCRからこのAg特異性を含む小さな集団が含まれている可能性がありますが、これらのAg特異的Tregの数は通常少ないです。その結果、自己免疫疾患に対するポリクローナル制御性制御性T細胞を用いた細胞ベースの治療には、多数の制御性制御性T細胞の養子移植が必要です4,5。多能性幹細胞(PSC)はあらゆるタイプの細胞に成長する能力を持っているため、Ag特異的PSC-TregはTregベースの免疫療法の優れた候補となる可能性があります。これまでの研究では、Tregs6-8を含むPSC由来T細胞の良好な開発が示されています。
ここでは、Ag特異的なiPSC-Tregを開発するためのプロトコルについて説明します。さらに、このような制御性Tregを用いたマウスモデルにおける自己免疫性関節炎の細胞ベース治療について説明する。この方法は、Ag特異的なTCRと転写因子FoxP3を持つマウスiPS細胞を遺伝子改変することに基づいています。その後、改変されたiPS細胞は、サイトカインmFlt3LおよびmIL-7の存在下で、NotchリガンドDL1、DL4、およびMHC-II(I-Ab)分子を発現するOP9間質細胞上のAg特異的Tregに分化します。これらのAg特異的iPSC-Tregは、Agで刺激するとTGF-βやIL-10などの抑制性サイトカインを産生することができ、このようなTregの養子導入は、マウスモデルにおけるAIAの発現を抑制する能力を持っています。記載されたプロトコールは、潜在的な治療的介入のための幹細胞由来のAg特異的Tregを開発するために使用することができる。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6j マウス</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>B6.129S7 Rag1tm1Mom/J</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2216</td><td></td></tr><tr><td>抗CD3 (2C11) 抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD28 (37.51) antibody</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD4 (GK1.5) antibody</td><td>Biolegend</td><td>100417</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8 (53&ndash;6.7) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>100714</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD25 (3C7) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>101912</td><td></td></tr><tr><td>Anti-TCR-&β;(H57597) 抗体</td><td>Biolegend</td><td>109220</td><td></td></tr><tr><td>抗IL10</td><td>Biolegend</td><td>505010</td><td></td></tr><tr><td>抗TGF&β;</td><td>Biolegend</td><td>141402</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>&-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>A10490-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH3007.01</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>Sigma</td><td>B7651</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Genejammer</td><td>Integrated science</td><td>204130</td><td></td></tr><tr><td>ACK溶解バッファー</td><td>ロンザ</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>mFlt-3L</td><td>peprotech</td><td>250-31L</td><td></td></tr><tr><td>mIL-7</td><td>peprotech</td><td>217-17</td><td></td></tr>ゼ<tr><td>ラチン</td><td>シグマ</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>P6148-500G</td><td>注意:アレルギー性、発がん性、毒性</td></tr><tr><td>透過化バッファーBiolegend</td><td></td><td></td><td></td>421002</tr><tr><td>mBSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>卵子アルブミン</td><td>Avantor</td><td>0440-01</td><td></td></tr><tr><td>CFA</td><td>Difco</td><td>2017014</td><td></td></tr><tr><td>Tailveiner 拘束</td>具 <td>Braintree scientific</td><td>RTV 150-STD</td><td></td></tr></tbody></table>

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性t細胞の開発

Development of Stem Cell-derived Antigen-specific Regulatory T Cells Against Autoimmunity

自己免疫疾患は、免疫学的自己寛容の損失に起因し発生します。制御性T細胞（Treg）免疫学的自己寛容の重要なメディエーターです。末梢血中を循環するものTregの2％ -約1で、マウスおよびヒトにおける成熟したCD4 + T細胞亜集団の10％ - Tregは約5を表します。人工多能性幹細胞（iPS細胞）は、自己免疫疾患の細胞ベースの治療のために使用される可能性を持っている機能のTregへ分化させることができます。ここでは、iPS細胞からの抗原（Ag）から固有のTreg（ すなわち 、IPSC-のTreg）を開発するための方法を提示します。この方法は、iPS細胞への転写因子のFoxP3及びAg特異的T細胞受容体（TCR）を組み込み、次いでノッチを発現OP9間質細胞上で分化に基づいてデルタ様（DL）1とDL4のリガンド。 in vitroでの分化に続いて、IPSC-Tregは、CD4、CD8、CD3、CD25、FoxP3の、およびAg特異的TCRを発現し、Agの刺激に応答することができます。この方法は、正常マウスモデルにおいて自己免疫性関節炎の細胞ベースの治療に適用されています。マウス-bearingのAg誘導関節炎（AIA）にこれらのAg特異的IPSC - Tregの養子移入は、関節の炎症および腫脹を軽減し、骨損失を防止する能力を有します。

28日目に、ここに示されるように、Ag特異的Tregは、実質的にCD3およびAg特異的TCR、2つのT細胞マーカーを発現しました。 CD3 +TCRVβ5+集団は、CD4を発現しました。 + CD3 +TCRVβ5+ CD4のほとんどの細胞はまた、CD25、CD127、およびCTLA-4、一般的に天然に存在するTのREGS（nTregs）および異所のFoxP3を発現するT細胞で上昇したレベルで発現される表現しました。フローサイトメトリー（図1）によって分析し、細胞内染色によって検出されるIPSC由来細胞中でFoxp3発現は、Notchリガンドでin vitro刺激後も長期間持続しました。 IPSC-Tregは潜在的な抑制活性を持っていた示し、Agをパルス脾細胞（図2） を用いてインビトロで刺激した場合また、Ag特異的IP...

ここでは、マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の免疫療法のために、人工多能性幹細胞(iPSC)から機能的な抗原(Ag)特異的制御性T細胞(Tregs)を開発する方法を紹介します。

自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

Autoimmune diseases arise due to the loss of immunological self-tolerance. Regulatory T cells (Tregs) are important mediators of immunologic ...

この実験の全体的な目的は、自己免疫性関節炎に対する免疫療法の目的で、幹細胞由来の炎症関節関連調節性T細胞を生成するための新しい手法を開発することです。この手法は、自己免疫性関節炎の潜在的な免疫療法に関する自己免疫分野の重要な疑問への回答に寄与します。本手法の主な利点は、幹細胞由来の調節性T細胞が特定の抗原に反応し、かつ単一のタイプであることです。まず、目的のフィーダー細胞をOP9培地を用いて1×10⁴ cells/cm²以上の密度に希釈し、10 cmディッシュあたり1×10⁶個のフィーダー細胞を播種します。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、培養液を除去し、レトロウイルスで導入した誘導多能性幹細胞（iPSCs）を0.5〜1×10⁵個、OP9培地とともに各ディッシュに播種します。5日後、培地を吸引し、10 mLのPBSで細胞を洗浄します。次に、1ディッシュあたり4 mLのTrypsinを用い、37 °Cで細胞を剥離させます。10分後、8 mLのIPSC mediumを加えて反応を停止させ、遠心分離に供します。ペレットを10 mLの新鮮なIPSC mediumで再懸濁し、新しい10 cmディッシュに細胞を再播種します。フィーダー細胞を細胞培養インキュベーター内で30分間静置し、プレートに接着させます。次に、浮遊しているiPSCを回収し、導入後の細胞を70 µmストレイナーでろ過して細胞数をカウントします。Murine-Flt3-Ligandを添加したOP9培地を用い、フィーダー細胞が80～90%コンフルエントになった新しいプレートに5×10⁵個のiPSCを播種し、培養物をインキュベーターに戻します。3日後、10 mLピペットを使用して、培養液でディッシュを洗浄します。次に、5 mLの新鮮なOP9培地をディッシュに加え、フィーダー細胞層を乱さないよう注意しながら、慎重かつ力強くピペッティングし、半接着性のiPS細胞を穏やかに洗い流します。さらに10 mLのPBSで洗浄を繰り返し、残りの半接着細胞を回収します。各ディッシュの洗浄液は、培養ごとに1本のコニカルチューブに集めます。細胞を遠心分離した後、Murine-Flt3-LigandおよびIL-7を添加したOP9培地10 millilitersでペレットを再懸濁し、70 micronストレーナーで細胞をろ過します。80%から90%までコンフルエントになったフィーダー細胞単層を含む6ウェル培養プレートの各ウェルに、iPSC培養物を1種類ずつ播種し、共培養物をインキュベーターに戻します。2日ごとに、培地の半分をMurine-Flt3-LigandおよびIL-7を添加した新鮮なOP9培地と交換し、4日から6日ごとに、必要に応じて分化中のiPSCを新鮮なフィーダー細胞層を敷いた新しいプレートに再播種します。まず、目的の細胞培養物をTrypsinで剥離し、各細胞種を10 millilitersの新鮮な培地で再懸濁します。各細胞培養物を新しい10 centimeterディッシュに播種し、細胞培養インキュベーター内でフィーダー細胞を接着させます。30分後、浮遊しているiPSCsを回収し、個別の70 micronセルストレイナーに通して、計数のために細胞塊を除去します。各培養物を冷PBS中で1.5 × 10⁷ cells/mLの濃度で再懸濁し、必要に応じて再度ろ過します。次に、4〜6週齢の雌C57BL/6マウスを1匹ずつ小型動物用固定具に入れ、1種類につき200 µLの細胞を各個体の尾静脈に養子移植します。ダイアルゲージキャリパーを用いて両膝の腫脹を測定し、ベースライン値を決定します。細胞移植の10日後、1 mLシリンジを用いて、完全フロイントアジュバントに乳化させた100 µgのメチル化BSAを、各実験動物の尾根に注射します。細胞移植の17日後、麻酔下にある養子導入動物の左膝関節に20 µgのメチル化BSA（10 µLのPBSに溶解）を関節内注射し、右膝関節に20 µgのメチル化BSAと100 µgの全卵白アルブミン（10 µLのPBSに溶解）を関節内注射して、関節炎を誘発させます。関節炎誘発の7日後、膝の直径の増加率を算出するために再度膝を測定し、手術により膝蓋骨を摘出します。関節をホルマリンで固定します。次に、EDTAで脱灰した後、膝をパラフィンに包埋し、組織化学的染色および分析用に4 µmの切片を作成します。28日目には、抗原特異的調節性T細胞が、CD3および抗原特異的T細胞受容体を高レベルで発現します。これらの細胞の多くはCD25、CD127、およびCTLA-4も発現しており、これらはすべて天然のT調節細胞において通常、高レベルで発現しています。実際に、細胞内染色によって検出された通り、iPS細胞由来T調節細胞では、Notchリガンドを用いた長期的なin vitro刺激後でもFoxP3が維持されます。さらに、これらの抗原特異的iPS細胞由来T調節細胞は、in vitroで抗原パルスした脾細胞で刺激した際に抑制性サイトカインを産生し、これらの細胞が抑制的な表現型を持つ可能性が示されました。OVA処理を施した膝ではFoxP3陽性細胞が観察されましたが、コントロールベクターを導入したiPS細胞を投与した膝ではFoxP3陽性細胞は見られませんでした。さらに、TCR-FoxP3ベクターを導入したiPS細胞を投与したマウスの膝では、FoxP3ベクターのみを導入した場合よりも、CD4陽性、FoxP3陽性、TCR3 Beta 5陽性の細胞が多く視覚化されました。これは、抗原特異的なiPS細胞由来Treg細胞が、レシピエント動物への養生的移入後、抗原誘導性関節炎を呈した膝へ遊走することを示唆しています。また、iPS細胞由来細胞の養生的移入は、OVAが存在する場合に炎症による膝の腫脹を大幅に減少させましたが、コントロールとしてメチル化BSAを注入した膝には影響を与えませんでした。腫脹の軽減による好影響は、コントロール群であるMBSAのみを注入した動物と比較して、細胞移植治療を施した膝において骨喪失の減少が高解像度Micro-CTイメージングで観察されたことにより、さらに裏付けられました。習得すれば、これらの詳細な手順は適切に実施することで6週間で完了させることができます。この手法を試みる際は、TCR-FoxP3抗原を導入したiPSCsの分化を誘導することを忘れないようにすることが重要です。この手順に従い、抗原特異的iPS細胞由来Treg細胞の生存率や質に関するさらなる疑問を解消するために、さまざまな抑制性サイトカイン化合物について検討することも可能です。本手法の開発により、細胞治療分野の研究者が自己免疫疾患における抗原特異的制御性T細胞の役割を探索する道が開かれました。直接的な自己抗体細菌を扱う操作は極めて危険であるため、手順の実施中は常に、基本的な2施設（バイオセーフティーレベル2）で作業するなど、十分な予防策を講じてください。ご視聴ありがとうございました。実験の成功をお祈りいたします。

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