自己免疫に対する幹細胞由来の抗原特異的制御性T細胞の開発

この実験の全体的な目標は、自己免疫性関節炎に対する免疫療法のための幹細胞由来の炎症性関節関連制御性T細胞を生成するための新しい方法を開発することです。この方法は、自己免疫性関節炎の潜在的な免疫療法に関する自己免疫分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、幹細胞由来の制御性T細胞がナイピードされ、単一のタイプであることです。

まず、OP9培地で目的のフィーダー細胞を1平方センチメートルあたり第4細胞の10倍の最小密度に希釈し、10センチメートル皿あたり第6フィーダーセルに10倍10をめっきする。細胞が80〜90%コンフルエントになったら、培地を培養物から取り出し、各皿のOP9培地に0.5〜1回10〜5回目のレトロウイルス形質導入誘導性多能性幹細胞またはIPSCを播種します。5日後、培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を洗浄します。

次に、皿ごとに4ミリリットルのトリプシンで細胞を摂氏37度で分離します。10分後、8ミリリットルのIPSC培地で反応を停止し、細胞を遠心分離のために引っ張ります。ペレットを10ミリリットルの新鮮なIPSC培地に再懸濁し、細胞を新しい10cmの皿に再播種します。

フィーダー細胞を細胞培養インキュベーターで30分間プレートに接着させます。次に、浮遊IPSCを回収し、形質導入された細胞を70ミクロンのストレーナでろ過してカウントします。Murine-Flt3-Ligandを添加したOP9培地中のフィーダー細胞の新鮮な80〜90%コンフルエントプレートに5回10〜5番目のIPSCを播種し、培養物をインキュベーターに戻します。

3日後、10ミリリットルのピペットを使用して、培地で皿を洗います。次に、5ミリリットルの新鮮なOP9培地を皿に加え、フィーダー細胞層を乱さないように慎重かつ力強いピペッティングで半付着性のIPSCをやさしく洗い流します。10ミリリットルのPBSで洗浄を繰り返して、最後の半接着細胞を採取し、各皿から洗浄液を培養ごとに1本の円錐形のチューブに引き込みます。

細胞をスピンダウンした後、Murine-Flt3-LigandおよびIL-7を添加したOP9培地10ミリリットルにペレットを再懸濁し、70ミクロンのストレーナーで細胞をろ過します。ウェルごとに1つのIPSC培養物を、80〜90%のコンフルエントフィーダー細胞単層を含む6ウェル培養プレートに播種し、共培養物をインキュベーターに戻します。2日ごとに、培地の半分をMurine-Flt3-LigandとIL-7を添加した新しいOP9培地と交換し、4〜6日ごとに、必要に応じて、分化しているIPSCを新しいフィーダーセルの層を備えた新しいプレートに再播種します。

まず、目的の細胞培養物をトリプシンで分離し、各細胞タイプを10ミリリットルの新鮮な培地に再懸濁します。各細胞培養物を新しい10cm皿にプレートし、フィーダー細胞を細胞培養インキュベーターに接着させます。30分後、浮遊IPSCを回収し、培養物を個々の70ミクロンセルストレーナーに通して、カウントのために細胞クラスターを除去します。

各培養物を10の1.5倍から7番目の細胞/mLの濃度で冷PBSに再懸濁し、必要に応じて再度ろ過します。次に、生後4〜6週齢の雌C57BL/6マウスを一度に1匹ずつ小動物の拘束具に入れ、マウス1匹につき1種類の細胞200マイクロリットルを各動物の尾静脈に養子として移します。ダイヤルゲージキャリパーを使用して両膝の腫れを測定し、ベースライン測定値を確立します。

細胞移植の 10 日後、1 ミリリットルの注射器を使用して、各実験動物の尾の付け根に完全フロイントアジュバントで乳化した 100 マイクログラムのメチル化 BSA をマウスに注入します。細胞移植の 17 日後、10 マイクロリットルの PBS に 20 マイクログラムのメチル化 BSA を左膝関節に、20 マイクログラムのメチル化 BSA と 100 マイクログラムの全オボアルブミンを関節内注射して関節炎を誘発します10マイクロリットルのPBSを、麻酔をかけた養子に移された各動物の右膝関節に注入します。関節炎を誘発してから7日後、膝の直径の増加率を計算するために膝を再度測定し、膝蓋骨を外科的に切除します。

関節をホルマリンで固定します。次に、EDTAで脱灰した後、膝をパラフィンに埋め込み、組織化学的染色と分析のために4ミクロンの切片を取得します。28日目に、抗原特異的T制御細胞は、かなりのレベルのCD3および抗原特異的T細胞受容体を発現します。

これらの細胞のほとんどは、CD25、CD127、およびCTLA-4も発現し、これらはすべて通常、天然に存在するT制御細胞で高レベルで発現します。実際、FoxP3は、細胞内染色によって検出されるように、Notchリガンドによる長期のin vitro刺激の後でも、IPSC由来のT制御細胞に持続します。さらに、これらの抗原特異的IPSC T制御細胞は、in vitroで抗原パルス脾細胞で刺激されると抑制性サイトカインを産生し、これらの細胞の抑制性表現型の可能性を示しています。

FoxP3陽性細胞は、OVAで治療された膝で観察され、制御ベクター形質導入IPSCを投与された膝ではFoxP3陽性細胞は見られません。さらに、TCR-FoxP3ベクターで形質導入されたIPSCを投与されたマウスの膝では、FoxP3ベクター単独よりも多くのCD4陽性、FoxP3陽性、TCR3ベータ5陽性細胞が可視化されており、抗原特異的IPSC−Treg細胞は、レシピエント動物への養子移植後に抗原誘発性関節炎膝に移動することが示唆されている。IPSC由来の細胞養子移植は、OVAが存在する場合の炎症性膝腫脹の大幅な減少にも影響しますが、メチル化BSA注射された膝の制御には影響を与えません。

腫脹の減少のプラスの効果は、対照のMBSAのみの注射動物と比較して、細胞移植治療を受けた膝で観察された骨量の減少の高解像度マイクロCTイメージングによってさらに裏付けられます。これらの詳細な手順は、適切に実行されれば、1 週間で完了します。この手法を試みる際には、TCR-FoxP3抗原形質導入IPSCの浸透した分化を誘導することを忘れないことが重要です。

この手順に続いて、サプレッシブサイトカインの異なる化合物を審議して、抗原特異的IPSCs T reg細胞の生存および品質に関する追加の疑問に答えることもできます。開発後、この技術は、細胞ベース療法の分野の研究者が自己免疫疾患における抗原特異的制御性T細胞の役割を探求する道を開きました。直接車体バクターでの作業は非常に危険である可能性があり、基本的な2つの施設での作業などの予防措置は、手順を実行する際に常に講じる必要があることを忘れないでください。

ご覧いただきありがとうございます、そして実験の頑張りを祈ります。