Name: 自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: 学ぶ、自己免疫性糖尿病モデルにおいて抗原特異的CD8細胞傷害性T細胞を高効率に生成する方法。in vitroでのトランスダクション技術を用いて機能的なT細胞を大量に作製し、1型糖尿病やがん治療への応用可能性を示す。

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本研究は、JDRF助成金1-INO-2015-74-S-B、2-SRA-2016-238-S-B、SRA-2-S-2018-648-S-B、糖尿病教育・行動賞、キャロライン・ウィーズ法基金(ベイロー・カレッジ)の支援を受けています。細胞選別は、NIH(S10RR024574およびP30CA125123)からの資金でベイラー医科大学の細胞メトリーおよび細胞選別コアによってサポートされました。すべてのペプチド-MHCテトラマーは、NIHテトラマーコア施設から得られた。

<ol><li>Atkinson, M. A., Eisenbarth, G. S., Michels, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Type 1 Diabetes.</a> Lancet. 383, 69-82 (2014).</li>
<li>Bankovich, A. J., Girvin, A. T., Moesta, A. K., Garcia, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+register+shifting+within+the+MHC+groove%3A+theory+becomes+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peptide register shifting within the MHC groove: theory becomes reality.</a> Molecular Immunology. 40 (14-15), 1033-1039 (2004).</li>
<li>Nakayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prime+role+for+an+insulin+epitope+in+the+development+of+type+1+diabetes+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Prime role for an insulin epitope in the development of type 1 diabetes in NOD mice.</a> Nature. 435, 220-223 (2005).</li>
<li>Crawford, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+and+detection+of+insulin-reactive+CD4%2B+T+cells+in+type+1+diabetes+in+the+nonobese+diabetic+%28NOD%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Specificity and detection of insulin-reactive CD4+ T cells in type 1 diabetes in the nonobese diabetic (NOD) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16729-16734 (2011).</li>
<li>Stadinski, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetogenic+T+cells+recognize+insulin+bound+to+IAg7+in+an+unexpected%2C+weak+binding+register%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Diabetogenic T cells recognize insulin bound to IAg7 in an unexpected, weak binding register.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 10978-10983 (2010).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibody+blocking+the+recognition+of+an+insulin+peptide-MHC+complex+modulates+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibody blocking the recognition of an insulin peptide-MHC complex modulates type 1 diabetes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2656-2661 (2014).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+%28CAR%29+T+cells+targeting+a+pathogenic+MHC+class+II%3Apeptide+complex+modulate+the+progression+of+autoimmune+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor (CAR) T cells targeting a pathogenic MHC class II:peptide complex modulate the progression of autoimmune diabetes.</a> Journal of Autoimmunity. 96, 50-58 (2019).</li>
<li>Purbhoo, M. A., Irvine, D. J., Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+killing+does+not+require+the+formation+of+a+stable+mature+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cell killing does not require the formation of a stable mature immunological synapse.</a> Nature Immunology. 5, 524-530 (2004).</li>
<li>Huppa, J. B., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell-antigen+recognition+and+the+immunological+synapse.+Nature+Reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell-antigen recognition and the immunological synapse. Nature Reviews.</a> Immunology. 3, 973-983 (2003).</li>
<li>Irvine, D. J., Purbhoo, M. A., Krogsgaard, M., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+ligand+recognition+by+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of ligand recognition by T cells.</a> Nature. 419, 845-849 (2002).</li>
<li>Barrett, D. M., Singh, N., Porter, D. L., Grupp, S. A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor+therapy+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor therapy for cancer.</a> Annual Review of Medicine. 65, 333-347 (2014).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Yu, Z., Frasheri, D., Restifo, N. P., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+syngeneic+T+cells+transduced+with+a+chimeric+antigen+receptor+that+recognizes+murine+CD19+can+eradicate+lymphoma+and+normal+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of syngeneic T cells transduced with a chimeric antigen receptor that recognizes murine CD19 can eradicate lymphoma and normal B cells.</a> Blood. 116, 3875-3886 (2010).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treating+B-cell+cancer+with+T+cells+expressing+anti-CD19+chimeric+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Treating B-cell cancer with T cells expressing anti-CD19 chimeric antigen receptors.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 10, 267-276 (2013).</li>
<li>Fishman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+Transfer+of+mRNA-Transfected+T+Cells+Redirected+against+Diabetogenic+CD8+T+Cells+Can+Prevent+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adoptive Transfer of mRNA-Transfected T Cells Redirected against Diabetogenic CD8 T Cells Can Prevent Diabetes.</a> Molecular Therapy. 25 (2), 456-464 (2017).</li>
<li>Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aManiatis%2C+T+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor. N.Y. (1982).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+T-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of T-cell receptor retrogenic mice.</a> Nature Protocols. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Johnstone, A., Thorpe, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJohnstone%2C+A+%22Immunochemistry+in+practice%22">Immunochemistry in practice</a>. , 3rd edn, Blackwell Science. Cambridge, MA. (1996).</li>
<li>Rowland-Jones, S. L., McMichael, A. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRowland-Jones%2C+SL+%22Lymphocytes%3A+a+practical+approach%22">Lymphocytes: a practical approach</a>. , 2nd ed, Practical approach series. New York. (2000).</li>
<li>Pear, W. S., Nolan, G. P., Scott, M. L., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+helper-free+retroviruses+by+transient+transfection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer helper-free retroviruses by transient transfection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8392-8396 (1993).</li>
<li>Sena-Esteves, M., Saeki, Y., Camp, S. M., Chiocca, E. A., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+conversion+of+cells+to+retrovirus+vector+producers+with+herpes+simplex+virus-Epstein-Barr+virus+hybrid+amplicons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Single-step conversion of cells to retrovirus vector producers with herpes simplex virus-Epstein-Barr virus hybrid amplicons.</a> Journal of Virology. 73 (12), 10426-10439 (1999).</li>
<li>Carrero, J. A., Calderon, B., Towfic, F., Artyomov, M. N., Unanue, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+transcriptional+and+cellular+landscape+of+type+1+diabetes+in+the+NOD+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Defining the transcriptional and cellular landscape of type 1 diabetes in the NOD mouse.</a> PLoS One. 8 (3), e59701(2013).</li>
<li>Jansen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+characterization+of+monocytes-macrophages+and+dendritic+cells+involved+in+the+initiation+of+the+insulitis+and+beta-cell+destruction+in+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical characterization of monocytes-macrophages and dendritic cells involved in the initiation of the insulitis and beta-cell destruction in NOD mice.</a> Diabetes. 43 (5), 667-675 (1994).</li>
<li>Corbett, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation+by+transitory+neo-antigens+derived+from+distinct+microbial+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell activation by transitory neo-antigens derived from distinct microbial pathways.</a> Nature. 509 (7500), 361-365 (2014).</li>
<li>Griffith, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mutation+affecting+intracellular+transport+and+cell+surface+expression+of+murine+class+II+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Structural mutation affecting intracellular transport and cell surface expression of murine class II molecules.</a> Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 541-555 (1988).</li>
<li>Kozono, H., White, J., Clements, J., Marrack, P., Kappler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+soluble+MHC+class+II+proteins+with+covalently+bound+single+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of soluble MHC class II proteins with covalently bound single peptides.</a> Nature. 369 (6476), 151-154 (1994).</li>
<li>Allicotti, G., Borras, E., Pinilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time-resolved+fluorescence+immunoassay+%28DELFIA%29+increases+the+sensitivity+of+antigen-driven+cytokine+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunoassay+%26+Immunochemistry%22%5BJournal%5D)">A time-resolved fluorescence immunoassay (DELFIA) increases the sensitivity of antigen-driven cytokine detection.</a> Journal of Immunoassay & Immunochemistry. 24 (4), 345-358 (2003).</li>
</ol>

MAb287およびそのデリバティブは、2014年に発行された米国特許によって保護されています。

このプロトコルは、レトロウイルス伝達によって抗原特異的CD8 CAR-T細胞を産生するための効率的な方法を説明する。私たちのプロトコルのトランスダクション効率は一般的に高く、CARの堅牢な発現は一般的に観察されます。拡張されたCAR T細胞は、親活性化T細胞の本質的な特徴、および抗体特異性を保持し、インビトロおよびインビボ使用の両方に適している。NODマウス7における1型糖尿病の再プログラムにAb-CAR CD8 T細胞を適用した。
私たちのプロトコルは、前述の方法にいくつかの重要な変更を組み込んでいます。まず、最適化されたT細胞培養培地を用いて、活性化時間を延長します。記載された完全な培地は、いくつかの主要なサプリメントの最適なレベルを含み、T細胞の生存率と活性化後の増殖の程度の両方を有意に改善する。なお、マウスIL-2は同等の結果を持つヒトタンパク質に置き換えることができるが、現時点では、ヒトIL-2はより手頃な価格である。なお、24時間活性化工程を用いた場合よりも40〜48時間活性化されたT細胞を用いて、著しく高い経導効率が得ら...

望ましくないオフターゲット効果のリスクが減少する可能性が高いことを考えると、抗原特異的免疫療法(ASI)はT1Dなどの自己免疫疾患に対する有望な治療法です。蓄積された証拠は、(プレプロ)インスリンに対する免疫応答がT1D1において特に重要であるかもしれないことを示唆している。過去10年間、当社を含む複数のグループからの研究は、特定のMHCクラスII分子(B:9-23/MHCII)によるインスリンB鎖アミノ酸9~23を含むエピトープの提示がT1Dの開発において重要な役割を果たしていることを強く示唆している。マウスとヒト2,3,4,5.B:9-23/MHCII複合体を選択的に標的にするために、mAb287という名前のモノクローナル抗体を生成し、他のペプチド6を含むホルモンインスリンまたは複合体に対する交差反応性を有しない。MAb287はインビトロでの抗原提示をブロックし、mAb287を糖尿病前NODマウスに毎週投与すると、処置されたマウス6の35%におけるT1Dの発達を遅らせた。生体内の抗原の提示をブロックするためには、通常、高い循環濃度を維持するために頻繁な注射が必要である。我々は、T細胞を再プログラムするためにAb287の高い特異性を利用してこの困難を克服し、それによってT1D7に対する抗原特異的T細胞療法を改善できると仮定した。
細胞傷害性T細胞は、彼らの認知リガンドの単一のコピーが8、9、10を発現した場合、その標的を殺すことができると報告されている。従って、B:9-23/MHCII特異的CD8T細胞は、親抗体よりも不要な抗原提示を排除する上で高い効率を有することが期待され、その効果を発揮するために同じAPC上の複数の複合体に結合する必要が生じやすい。CAR T細胞は、複数のヒト癌11、12、13の治療に使用されており、また、自己免疫14においても有効であり続けであり、かつ有効でありうる。しかしながら、病原性ペプチド-MHC複合体に対する特異性を持つCAR-T細胞は、これまでT1Dの進行を修飾するために使用されていない。以下に説明する最適化されたCD8 T細胞伝達技術を用いて、我々は最近、これが実際に実行可能なアプローチ7を表す原理の証明を示した。
このプロトコルでは、効率的かつ合理化されたトランスダクションおよび拡張方法の概要を説明する。我々のプロトコルは、高効率のマウスCD8 CAR T細胞の生成を必要とする他の研究にも適用可能である。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール (50mM)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td>50 &mu;メートル</td></tr><tr><td>5'RACE PCR</td><td>Clontech</td><td>634859</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD28抗体</td><td>eBioscience</td><td>14-0281-86</td><td>最終濃度1&micro;g/ml</td></tr><tr><td>抗マウス CD3e 抗体</td><td>eBioscience</td><td>145-2C11</td><td>最終濃度 1&micro;g/ml</td></tr><tr><td>ビオチンラット抗マウスIFN-&γ;</td><td>BD Biosciences</td><td>554410</td><td>0.5 & micro での作業濃度。g/ml</td></tr><tr><td>BSA</td><td>シグマ</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>遠藤フリー マキシプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>ファイナル 50 &マイクロ;g / mlです。</td></tr><tr><td>熱不活性化 FCS</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.03</td><td>最終 10% FCS</td></tr><tr><td>HEPES (100X)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>1X</td></tr><tr><td>IAg7-CLIP テトラマー-BV421</td><td>NIH テトラマー エモリーの施設</td><td>承認ごとに</td><td>6 & マイクロでの作業濃度;g/ml</td></tr><tr><td>IAg7-インスリン P8E テトラマー-BV421</td><td>NIH テトラマー エモリーの施設</td><td>承認ごと</td><td>6 & マイクロでの作業濃度;g/ml</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン (ITS 100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>51500056</td><td>最終濃縮は 1x</td></tr><tr><td>リポフェクタミン 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LS カラム</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS Separation Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>マウス CD8a+ T 細胞分離キット</td><td>Miletenyi Biotec Inc</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>マウス CD8a+ T 細胞分離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培地</td><td>ThermoFisher</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (5000U/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>15070063</td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td>Phoenix-ECO 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3214</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>pMIG II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>pMSCV-IRES-GFP II</td><td>Addgene</td><td>52107</td><td></td></tr><tr><td>精製ラット抗マウスIFN-&γ;</td><td>BD Biosciences</td><td>551216</td><td>3 & micro での作業濃度。g/ml</td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>Sigma</td><td>R7767</td><td></td></tr><tr><td>RetroNectin</td><td>Takara</td><td>T100A</td><td>50 & micro での作業濃度;g/ml in PBS</td></tr><tr><td>rhIL-2 (ストック濃度 105 IU/ul)</td> <td>Peprotech</td><td>200-02</td><td>最終濃度 200 IU/ml</td></tr><tr><td>rmIL-7 (ストック濃度 50ng/ul)</td><td>R&D</td><td>407-ML-005</td><td>0.5ng/ml での最終濃度</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞ストレーナー</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Tryple</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr></tbody></table>

自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性t細胞の高効率生成

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

1型糖尿病(T1D)は、β細胞破壊およびインスリン産生の絶対喪失につながる細胞特異的自己免疫を特徴とする。自発的非肥満糖尿病(NOD)マウスモデルでは、インスリンが主な標的であり、これらの動物の遺伝子操作により単一のキーインスリンエピトープを除去することが疾患を予防する。従って、この病原性エピトープを有する専門抗原提示細胞(APC)の選択的排除は、望ましくないインスリン特異的自己免疫応答を阻害するアプローチであり、かつより大きな翻訳可能性を有する可能性が高い。
キメラ抗原受容体(CA)は、T細胞を疾患を引き起こす抗原を選択的に標的にするようにリダイレクトすることができます。この技術は、複数の癌を治療するために養子細胞療法に細胞工学を使用する最近の試みの基礎である。このプロトコルでは、少数のナイーブ細胞から始まる機能性抗原特異的CD8 CAR-T細胞の数が多く生成される最適化されたT細胞レトロウイルス(RV)伝達およびインビトロ拡張プロトコルについて説明する。以前は複数のCAR-T細胞プロトコルが記載されていたが、典型的には、トランスダクション後のトランスダクション効率および細胞生存率が比較的低い。対照的に、当社のプロトコルは最大90%のトランスダクション効率を提供し、生成された細胞は生体内で2週間以上生存し、単回注入後の疾患発症を著しく遅らせることができます。重要な手順を簡単に実行できるように、細胞の維持および伝達プロトコルの詳細な説明を提供します。一次細胞分離からCAR式までの手順全体は、14日以内に実行できます。一般的な方法は、標的が知られている任意のマウス疾患モデルに適用されてもよい。同様に、特定の用途(病原性ペプチド/MHCクラスII複合体を標的とする)は、主要複合体が同定された他の自己免疫疾患モデルに適用可能である。

典型的には、このプロトコルを用いたトランスダクション効率は〜60〜90%である。図3に示す実験では、約ソート前に、CD8T細胞の70%がGFPを共発現した。彼らはまた、CD28とCD3(図3C)を共発表現しました。重要なことに、すべての「テスト」GFP+細胞もIA g7-B:R3テトラマーと共染色したが、対照テトラマーとは一致しない(図4)。同様に、並べ替えられたCAR-T細胞は、それぞれのコグネイトリガンドを発現する標的細胞との共培養後にのみ高レベルのIFN-γを分泌した(図5)。これは、トランスプリエテッド細胞が親抗体の標的に向けられたCD8エフェクターT細胞表現型を有することを確認する。
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

本稿では、抗原特異的CD8 T細胞の生成のためのプロトコルと、インビトロおよびインビボで使用する機能性T細胞の数が多いことを目的としたインビトロでの増殖について説明する。

自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

このプロトコルは、自己免疫疾患を治療する上で望ましい安全なアプローチである多数の機能抗原特異的T細胞を生成することを可能にする。この技術の主な利点は、非常に効率的なトランスダクションプロセスと多数の機能T細胞を提供することです。この技術は、抗原が知られている1型糖尿病および他の自己免疫疾患を治療するために拡張することができる。さらに、CAR T細胞は、特定のタイプの癌に対する有望な治療法であり得る。この方法は、他のCALを発現する免疫細胞を生成するために使用することができる。良い受け入れられた技術を持ち、プロトコル全体を読み、実験全体を事前に計画することが重要です。この2週間の長いプロトコルにはミニステップが含まれており、成功は各ステップの適切なパフォーマンスに依存します。この方法の視覚的なデモンストレーションは、学習者が正しく従うために重要です。原稿に記載されているように、トランスフェクションのためにフェニックス細胞を準備します。細胞の吹き飛ばしを最小限に抑えるために、培地を追加および除去する側壁をマークすることをお勧めします。ゼロ日に細胞から上清を吸引し、5ミリリットルのPBSで洗浄します。減らされた血清培地をプレートの側壁に滴下して7ミリリットル慎重に加え、細胞をインキュベーターに戻します。1.5ミリリットルの減らされた血清培地を2つの14ミリメートルの丸いポリプロピレンチューブに加えます。40マイクロメートルのトランスフェクション試薬をチューブの1つに加え、15マイクログラムの抗体はCARプラスミドを他の5マイクログラムの包装プラスミドと一緒にリダイレクトしました。室温で5分間チューブをインキュベートし、プラスミドチューブにトランスフェクション試薬を加えます。溶液を上下に3回軽くピペットで混ぜ、室温で少なくとも20分間インキュベートします。フェニックス細胞に3ミリリットルの混合物を加え、組織培養インキュベーターに入れます。4~5時間後、細胞に1ミリリットルのFCSを加え、摂氏37度で一晩培養します。翌日、上清を細胞から取り出し、4ミリリットルの新鮮な温め込み培養培地を加える。フェニックス細胞から培地を含むウイルスを収集し、それを濾過して残留細胞の破片を除去することで、2日目にウイルスを収穫する。組み換えヒトIL-2ストックをウイルスに加え、1ミリリットル当たり200の国際単位の最終濃度を得て、すぐにトランスダクションに使用します。フェニックス細胞に新鮮な培地を4ミリリットル加え、一晩保育器に入れます。翌日にウイルスの収集を繰り返して2回目のトランスダクションを行い、細胞を廃棄します。マウスCD8 T細胞を播種する1日前に、抗マウスCD3とCD28抗体の混合物を24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットル加え、プレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。ゼロ日目には、マウス脾臓を収穫し、氷の上の細胞培養皿にPBSの10ミリリットルに浸す細胞ストレーナーの上に置きます。細胞培養フードでは、各脾臓を3~5個に切り、注射器の滅菌プランジャーを使用して、ワイヤーメッシュを通して組織を押し込みます。1~4個の希釈赤血球リシスバッファーで脾細胞を再懸濁し、室温で5分間インキュベートし、細胞カウント用にTrypan Blueで10マイクロリットルの細胞懸濁液を希釈して、赤血球を静かに除去します。そして、残りの細胞を350回gで7分間遠心してペレットする。マウスCD8 T細胞分離キットを使用してCD8 T細胞を濃縮し、ビオチン抗体カクテル100マイクロリットルから8番目の細胞に10マイクロリットルのバッファー400マイクロリットルの細胞ペレットを一時停止します。細胞懸濁液をよく混ぜ合わせ、摂氏4度で5分間インキュベートし、抗体結合を可能にします。その後、300マイクロリットルの標識バッファーと200マイクロリットルの抗ビオチンマイクロビーズを10回10〜8細胞に加えます。よく混ぜて、摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。一方、セパレータに分離カラムを設置し、3ミリリットルのラベリングバッファで洗浄します。40マイクロメートルの細胞ストレーナーをカラムの上部に置き、ビーズと細胞混合物の1ミリリットルをストレーナーを通して分離カラムに入れます。プレチル15ミリリットルチューブに流れを収集し、同じチューブに排水を収集し、メーカーの指示に従って列を洗浄します。細胞を数え、5分間350回gで遠心分離して回収する。T細胞培地と遠心分離機を2ミリリットルで再び洗います。次に、1ミリリットル当たり250,000〜500,000細胞の濃度で、温め込まれたT細胞培地で再懸濁する。以前に調製したCD3およびCD28抗体被覆プレートを1ミリリットルの無菌PBSで3回洗浄し、各ウェルに2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。渦巻き運動を使用して、細胞を均等に分配します。コントロールとして、同じ数のCD8 T細胞をプレートの単一の非コーティングウェルにプレートし、10%の炭酸ガスタンクインキュベーターで37°Cで細胞を48時間インキュベーターします。1日目には、24ウェルプレートのウェルに0.5ミリリットルのフィブロネクチンを加え、摂氏4度で一晩インキュベートして、ヒトフィブロネクチンフラグメントコーティングプレートを準備します。翌日、フィブロネクチン溶液を取り除き、1ウェルあたり2%BSAとPBSの1ミリリットルを加えます。プレートを室温で30分間インキュベートし、処理した井戸を1ミリリットルの無菌PBSで洗浄します。洗浄液を取り外した後、プレートを使用する準備が整いました。トリパンブルーを使用して、活性化されたCD8 Tセルをカウントします。遠心によってそれらを収集します。そして、トランスダクションのためにミリリットル当たり500万個の生存細胞でそれらを再懸濁させる。活性化CD8細胞懸濁液の100マイクロリットルをフィブロネクチン被覆プレートの各ウェルに加えます。その後、培地を含む以前に調製されたウイルスの1.5〜2ミリリットルを加え、渦巻き運動を使用して混合して細胞を均等に分配します。Ziplocバッグにプレートを密封し、摂氏37度で90分間2,000倍gで遠心分離機を入れます。遠心分離機からプレートを取り出し、生物学的安全キャビネットに持って行きます。ビニール袋を慎重に取り出し、プレートの外側が媒体で汚染されていないことを確認します。プレートを摂氏37度の二酸化炭素インキュベーターに移します。4時間後、各ウェルから1ミリリットルの培地を取り出し、プリウォーム完備のT細胞培地1ミリリットルに交換し、プレートをインキュベーターに戻します。このプロトコルの重要な側面は、高い活性化ウイルス、健康な活性化T細胞、および適切なトランスダクション方法である。細胞は、PEサイズ7共役抗CD8、AF647共役抗CD3、およびBV 421結合型抗CD28と共染色して、フローサイトメトリック解析を行った。約70%のCD8T細胞がCAR発現を示すGFPを同時発現した。また、CD28とCD3も共同で表現しました。重要なことに、すべての試験GFP陽性細胞はまた、細胞表面上のCARの発現を示すが、対照四量計とは対照しないI-Ag7インスリンBR3四量主細胞と共染色した。さらに、並び替え試験および制御CAR T細胞は、それぞれ、その同一性リガンドを発現する標的細胞と共培養した後にのみ高レベルのインターフェロンガンマを分泌し、トランスデューシングされた細胞が親抗体の標的に向けられたCD8エフェクターT細胞を有することを確認した。ウイルス産生細胞の導入、一次CD8T細胞の単離、およびこれらのT細胞の活性化は、この実験の最も重要なステップである。健康な活性化T細胞と適切な試薬を用いたこれらのT細胞の導入を有することで、良好な結果が得られます。この方法は、他の T 細胞を変換するために使用できますが、特定の T 細胞型に合わせてカスタマイズする必要があります。このプロトコルは、抗原特異的なキメラ抗原受容体T細胞療法による1型糖尿病の予防に道を開く。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

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